السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان

Summary

نفيدكم طريقة لعزل السذاجة السلائف الجلد المشتقة (SKP) خلايا متعددة القدرات من الثقافات الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. وتبين لنا أن هذه SKPs المستمدة من الثقافات الليفية تقاسم خصائص الخلايا الجذعية مماثلة لتلك التي تستمد مباشرة من خزعات الجلد البشري. هذه الخلايا تعبر عن علامة قمة العصبية، nestin، بالإضافة إلى علامات متعددة القدرات مثل OCT4 وNANOG.

Abstract

على مدى العقد الماضي، وقد تم تحديد العديد من السكان الكبار الخلايا الجذعية في الجلد البشري ^1-4. وذكرت والعزلة السلائف متعددة القدرات الجلدي الكبار أول مرة من قبل ميلر F. D مختبر ^{5، 6.} وصف هذه الدراسات في وقت مبكر متعددة القدرات خلية السكان السلائف من الكبار الأدمة الثدييات ^5. هذه الخلايا - SKPs يطلق عليه، لالسلائف الجلد المشتقة - تم عزل وتوسيع نطاقها من القوارض وجلد الإنسان ومتباينة في ذرية على حد سواء العصبي وأرومية متوسطة، بما في ذلك أنواع الخلايا أبدا وجدت في الجلد، مثل الخلايا العصبية ^5. كشفت الدراسات Immunocytochemical على SKPs مثقف أن الخلايا أعرب vimentin وnestin، وهو بروتين خيوط الوسيطة التي أعرب عنها في السلائف العضلات العصبي والهيكل العظمي، بالإضافة إلى فبرونيكتين ومتعددة القدرات علامات الخلايا الجذعية ^6. حتى الآن، وقد تم عزل الخلايا الجذعية البالغة SKPs السكان من جمعها طازجة خزعات الجلد الثدييات. ve_content "> في الآونة الأخيرة، وقد أنشأنا وذكرت أن عدد سكانها خلايا الجلد السلائف المستمدة يمكن أن تظل موجودة في الثقافات الليفية الأولية التي أنشئت من خزعات الجلد ^7. وكان الافتراض أن عدد قليل من الخلايا الجذعية الجسدية قد تتواجد في الثقافات الليفية الأولية في الأضعاف السكان في وقت مبكر بالاستناد إلى الملاحظات التالية: (1) يتم اشتقاق SKPs والثقافات الليفية الأولية من الأدمة، ويمكن أن تظل موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية وبالتالي عدد قليل من الخلايا SKP و (2) الثقافات الليفية الأولية نمت من مأخوذة المجمدة التي كانت تعرض لدرجة حرارة غير المواتية أثناء التخزين أو النقل يحتوي على عدد صغير من الخلايا التي ظلت قابلة للحياة ^7. هذه الخلايا النادرة كانوا قادرين على توسيع ويمكن passaged عدة مرات. اقترح هذه الملاحظة أن عددا صغيرا من الخلايا مع ارتفاع قوة الانتشار ومقاومة للإجهاد كانت موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الإنسان ^7.

ونحن قد استفادت من تلك النتائج إلى وضع بروتوكول لعزل السريع للخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية الأولية التي تتوافر بسهولة من بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم (الشكل 1). هذا الأسلوب له أهمية كبيرة لأنه يتيح للعزل الخلايا السلائف عندما عينات الجلد لا يمكن الوصول إليها في حين الثقافات الليفية قد تكون متاحة من بنوك الأنسجة، وبالتالي، وفتح فرص جديدة لتشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض الوراثية النادرة فضلا عن الأمراض النمذجة في طبق.

Protocol

1. عزل SKP من الثقافات الليفية الابتدائية

1. تتم المحافظة على الثقافات الليفية إما من بنوك الخلايا أو الحصول عليها مباشرة من خزعات الجلد في الثقافة في الخلايا الليفية النمو المتوسطة DMEM تحتوي على 15٪ مصل العجل الجنين، 2 مم الجلوتامين، 10 ملغ / مل البنسلين، و 10 ملغ / مل الستربتوميسين.

تم الحصول على الخلايا الليفية الإنسان GMO3349C وGMO8398A من معهد Coriell للأبحاث الطبية (كامدن، ونيو جيرسي) واستخدمت في هذه الدراسة.

2. (PPDS) استخدمت الثقافات من الأضعاف السكان 20-35 للثقافات SKP في confluency من 80٪. واحد 10 سم الأنسجة صحن الثقافة دينار بحريني (فالكون) يحتوي على حوالي 1.5x10 ⁶ خلايا.
3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع 2 مل من محلول التربسين (0.25٪، إينفيتروجن) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
4. جمع الخلايا من اللوحة مع 5 مل PBS ونقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب الصقر.
5. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
6. إعداد المتوسطة النمو SKP تتألف من DMEM-F12، 03:01 (V / V) و 40 نانوغرام / مل FGF2 (العلوم البيولوجية دينار بحريني، و 20 نانوغرام / مل EGF (العلوم البيولوجية دينار بحريني)، B27 المصل الملحق مجانا 2٪ (إينفيتروجن)، 1 ميكروغرام / مل Fungizone (إينفيتروجن) و 25 ميكرون / مل جنتاميسين (إينفيتروجن).
7. بيليه الخلايا في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه الخلية مباشرة في 4 مل SKP متوسطة النمو. نقل تعليق الخلية إلى 25 سم ² الأنسجة قارورة الثقافة دينار بحريني (فالكون).
8. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية ورصد الثقافة لتشكيل المجال يوميا لمدة 3 إلى 4 أسابيع.

2. الشروط الثقافة المجال

1. خلايا الثقافة في 25 سم ² قارورة دينار بحريني (فالكون) عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2.
2. هز القارورة بقوة يوميا لتجنب الخلايا على الانضمام إلى الجزء السفلي من القارورة. إذا لزم الأمر، ماصة صعودا وهبوطا مع 2 مل ماصة معقمة لفصل الخلايا الملتصقة ونقل الثقافة إلى قارورة جديدة.
3. مجالات أول البدء في بناء غضون 3 رس 4 أيام.
4. اسمحوا المجالات الرواسب إلى أسفل القارورة وتغير نصف المتوسط ​​كل 3 أيام. للحفاظ على نفس تركيز النهائي من عوامل النمو إضافة عوامل النمو 2X إلى استعداد طازجة متوسطة النمو SKP.
5. الحفاظ على حجم أقصى ثابت 4 مل.
6. عندما المجالات تصل إلى حجم من ~ 200 مم ينبغي passaged عن طريق تحطيم المجالات إلى حجم أصغر من قبل قوي pipetting صعودا وهبوطا مع 2 مل ماصة.
7. يتم تقسيم الثقافة إلى قسمين 25 سم ² قوارير دينار بحريني (فالكون) والمجالات الثقافات هي تغذية كما هو موضح في الخطوة 2.4).
8. يتم جمع المجالات لعلامات الخلايا الجذعية فحص بعد يوم 16-21.

الإجراء من 2.6) و 2.7) وصفا نشر من المجالات ل(1) يسمح اغذية وعوامل النمو المدرجة في SKP المتوسطة على الوصول إلى جميع الخلايا الموجودة في كل مجال و (2) لتوسيع ثقافة المجال SKP قبل الاستخدام.

عادة الثقافات المجال تحت مكعب لديناشروط lture الحفاظ على القدرة على النمو على مدى فترة ثلاثة أشهر، وو passaged بين 3 إلى 4 مرات.

3. كيمياء سيتولوجية مناعية لعلامات الخلايا الجذعية

1. ويتم حصاد الثقافات المجال في برنامج تلفزيوني بعد يوم 16-21. الثقافات مكعبات في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
2. ومعلق المجالات في حجم صغير من برنامج تلفزيوني.
3. رسم دائرتين مع القلم DAKO ما يقرب من 0.5 ميكرون في القطر على شرائح المجهر (فيشر العلامة التجارية).
4. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق المجال في الدوائر.
5. تحقق بواسطة المجهر الضوئي لوجود المجالات في كل قطرة.
6. السماح للقطرات الجافة تحت غطاء محرك السيارة.
7. إما تجميد الشرائح في -80 درجة مئوية أو المضي قدما في بروتوكول تلطيخ immunofluoresence.
8. لتلطيخ المناعي، وتحديد الشرائح مع الميثانول قبل المبردة (100٪) عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
9. تغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني.
10. منع الشرائح مع PBS/10٪ مصل بقري جنيني / 0.02٪ X100 تريتونلا يقل عن 1 ساعة.
11. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (مثل مكافحة Nestin، ومكافحة Oct4، ومكافحة TG30، والأجسام المضادة لمكافحة NANOG، الجدول 3) المخفف في عرقلة العازلة: PBS/10٪ FBS لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
12. يغسل 3 مرات مع عرقلة العازلة واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
13. يغسل 3 مرات مع حجب مرات العازلة و3 مع برنامج تلفزيوني.
14. جبل الشرائح مع تصاعد Vectashield المتوسطة (ناقلات وشركة).
15. تحليل عينات للتعبير عن علامات الخلايا الجذعية بواسطة المجهر المناعي.

4. تحليل PCR الوقت الحقيقي من مستويات التعبير عن علامات الخلايا الجذعية

1. يستغرق حوالي 2-3 الثقافات المجال مل من يوم 18 إلى 21.
2. بيليه المجالات في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، ونضح عن المتوسط.
3. عزل الحمض النووي الريبي من المجالات باستخدام Minikit RNeasy (QIAGEN، فالنسيا، CA).
4. تقييم نقاء RNA بواسطة مطياف وagarose هلام.
5. توليف [كدنا] (Omniscript الناسخ العكسي (QIAGEN)) باستخدام الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية كقالب.
6. تحقق من صحة علامات الخلايا الجذعية التي كتبها الحقيقي-PCR باستخدام بادئات لعلامات الخلايا الجذعية (كما هو موضح في الجدول رقم 1) في دولة SYBR الأخضر PCR Mastermix (النظم البيولوجية التطبيقية) بتركيز من 375 نانومتر من كل التمهيدي و 50 نانوغرام من قالب في ميكرولتر 20 حجم رد الفعل. يتم استخدام GAPDH والسيطرة الذاتية.
7. لالتضخيم استخدام تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة تليها 40 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوانى و 60 درجة مئوية لمدة 20 ثانية.
8. تحليل المدى مع 2 (ΔΔCt) الطريقة ^8.

5. التمايز الموجهة إلى خلايا العضلات الملساء

1. كانت مطلية المجالات من يوم 21-26 إلى 6 أطباق ثقافة جيدا دينار بحريني (فالكون) في SKP المتوسطة.
2. وسمح خلايا الالتزام وتتفوق من المجالات في المتوسط ​​SKP لمدة 72 ساعة.
3. خلايا العضلات الملساء (SMCS) differentiatبدأ أيون التي بدأها استبدال المتوسطة مع SMC متوسطة التمايز تتكون من الجلوكوز المرتفعة Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(إينفيتروجن) تحتوي على 5٪ FBS، 5 نانوغرام / مل PDGF-BB (إينفيتروجن)، و 2.5 نانوغرام / مل TGF-B1 (إينفيتروجن) .
4. تم تغيير المتوسطة كل 3 أيام مع استعداد طازجة متوسطة التمايز SMC لفترة من 3 إلى 4 أسابيع في الثقافات.
5. تم إجراء فحوص للكشف عن علامات SMC بعد 3 إلى 4 أسابيع بواسطة المناعية.
6. تم إصلاح الخلايا مع 4٪ حل بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
7. تم permeabilized الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة.
8. وحضنت الخلايا مع أجسام مضادة ضد αSMA (MO851، داكو، 1:100)، أو calponin (M3556، داكو، 1:100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ومواصلة تجهيزها كما هو موضح في 3.12) إلى 3.15).

النتائج

وتبين لنا أن عدد السكان من الخلايا التي تعمل على توسيع انتقائي لتوليد المجالات SKP تحت ظروف النمو للرقابة تتكون من صندوق تعديل العولمة الأوروبي وFGF2 موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية (الشكل 1) كما ذكرنا مؤخرا ^7.

Discussion

باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، السذاجة الخلايا الجذعية عن طريق الجلد يمكن عزلها عن الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية. باستخدام هذا النهج، ونحن ذكرت مؤخرا عزل وتوصيف الخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية المستمدة من المرضى الذين يعانون من متلازمة ورا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.