Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Resumo

Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.

Resumo

Ao longo da última década, várias populações de células estaminais adultas foram identificadas na pele humana ^1-4. O isolamento de precursores dérmicos adultas multipotentes foi primeiramente relatada por F. Miller D laboratório ^{5, 6.} Estes estudos iniciais descreveu uma população de células multipotentes precursor do adulto derme mamíferos ^5. Estas células - SKPs denominados precursores, para a pele derivadas - foram isoladas e expandidas do roedor e a pele humana e diferenciar-se em progenitura tanto neural e mesodérmica, incluindo os tipos de células nunca encontradas na pele, tais como os neurónios ^5. Estudos imunocitoquímicos sobre SKPs revelou que as células cultivadas expressaram vimentina e nestina, uma proteína de filamento intermédia expresso em precursores neurais do músculo esquelético e, em adição à fibronectina e marcadores de células estaminais multipotentes ^6. Até agora, as células estaminais adultas SKPs população têm sido isoladas de recém-coletadas biópsias de pele de mamíferos. ve_content "> Recentemente, nós estabelecemos e informou que uma população de células precursoras derivadas da pele pode permanecer presente em culturas de fibroblastos primários estabelecidos a partir de biópsias de pele ^7. A suposição de que algumas células-tronco somáticas pode residir em culturas de fibroblastos primários em duplicações da população início era baseada nas seguintes observações: (1) SKPs e culturas de fibroblastos primários são derivados a partir da derme, e, por conseguinte, um pequeno número de células SKP podem permanecer presentes em culturas de fibroblastos dérmicos primários e (2) culturas de fibroblastos primários cultivados a partir de alíquotas congeladas que foram submetida à temperatura desfavoráveis ​​durante o armazenamento ou transferência continha um pequeno número de células que permaneceram viáveis ^​​7. Estas raras células foram capazes de se expandir e podem ser passadas várias vezes. Tal observação sugeriu que uma pequena quantidade de células com elevada potência a proliferação e a resistência ao stress Encontravam-se presentes em culturas de fibroblastos humanos ^7.

Aproveitamos estes resultados para estabelecer um protocolo para o rápido isolamento de células-tronco adultas a partir de culturas de fibroblastos primários que estão prontamente disponíveis a partir de bancos de tecidos ao redor do mundo (Figura 1). Este método tem um significado importante, uma vez que permite o isolamento de células precursoras da pele quando as amostras não estão acessíveis ao culturas de fibroblastos podem estar disponíveis a partir de bancos de tecidos, deste modo, abrindo novas possibilidades para dissecar os mecanismos moleculares subjacentes a doenças genéticas raras, bem como doenças de modelação numa prato.

Protocolo

1. Isolamento SKP de culturas primárias de fibroblastos

1. Culturas de fibroblastos quer a partir de bancos de células ou directamente obtidos a partir de biópsias de pele são mantidas em cultura em meio de crescimento de fibroblastos DMEM contendo 15% de soro fetal de vitelo, glutamina 2 mM, 10 mg / ml de penicilina e 10 mg / ml de estreptomicina.

Fibroblastos humanos e GMO3349C GMO8398A foram obtidos a partir da Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) e foram usadas neste estudo.

2. Culturas de duplicações da população (PPV) de 20 a 35 foram utilizados para culturas de SKP numa confluência de 80%. Um 10 centímetros de tecido prato de cultura (BD Falcon) contém cerca de 1.5x10 ⁶ células.
3. Lavar as células com PBS e incubar com 2 ml de solução de tripsina (0,25%, Invitrogen) durante 1 hora a 37 ° C.
4. Recolha de células a partir da placa com 5 ml de PBS e transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 15 ml.
5. Incubar as células a 4 ° C durante 24 horas.
6. Prepara meio de crescimento SKP consistindo de DMEM-F12, 3:1 (v / v) e 40 ng / mL de FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml de EGF (BD Biosciences), suplemento B27 livre de soro a 2% (Invitrogen), 1 ug / ml de Fungizone (Invitrogen) e 25 mM / ml de gentamicina (Invitrogen).
7. Agregar as células a 1.200 rpm durante 5 min e ressuspender o sedimento de células directamente em 4 ml de meio de crescimento SKP. Transferir a suspensão celular para cm a 25 garrafa de cultura de tecidos ² (BD Falcon).
8. Incubar o balão a 37 ° C e monitorar a cultura para a formação da esfera por dia durante 3 a 4 semanas.

2. Esfera Cultura Condições

1. Culturas de células em um balão ^{de 2} 25 cm (BD Falcon) a 37 ° C, 5% de CO _2.
2. Agitar o frasco vigorosamente diariamente para evitar as células a aderir ao fundo do frasco. Se necessário, pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 2 ml estéril para separar as células aderentes e transferir a cultura para um novo frasco.
3. Primeiras esferas começar a construir dentro de 3 tØ 4 dias.
4. Deixe esferas sedimento no fundo do frasco e a mudança de metade do meio a cada 3 dias. Para manter a mesma concentração final de factores de crescimento 2X adicionar factores de crescimento ao meio de crescimento SKP preparados.
5. Manter o volume constante máximo de 4 ml.
6. Quando esferas atingir um tamanho de ~ 200 milímetros devem ser passadas por quebrar as esferas de tamanho menor por vigorosa pipetando para cima e para baixo com uma pipeta 2 ml.
7. A cultura é dividida em duas 25 centímetros ^dois frascos (BD Falcon) e as esferas são culturas de alimentação, tal como descrito na etapa 2.4.)
8. Spheres são coletadas para marcadores de células-tronco de triagem por dia 16 a 21.

O procedimento de 2,6) e 2,7) descrevem a propagação das esferas para (1) permite que os nutrientes e factores de crescimento em meio de SKP incluídos para aceder a todas as células dentro de cada esfera e (2) a expansão da cultura esfera SKP antes da utilização.

Normalmente culturas Esfera sob os nossos cucondições LTURE manter a capacidade de crescer durante um período de três meses, e são passadas entre 3 a 4 vezes.

3. Imunocitoquímica para marcadores de células-tronco

1. Esfera culturas são colhidas em PBS por dia 16 a 21. As culturas são sedimentados a 1000 rpm durante 5 min.
2. As esferas são ressuspensas num pequeno volume de PBS.
3. Desenhe dois círculos com uma caneta DAKO de cerca de 0,5 m de diâmetro em lâminas de microscópio (marca Fisher).
4. Adicionar 50 ml de suspensão esfera para os círculos.
5. Verificar por microscopia de luz para a presença de esferas em cada gota.
6. Deixe as gotas seca sob o capô.
7. Ou congelar as lâminas a -80 ° C, ou continuar com o protocolo de coloração de imunofluorescência.
8. Para coloração por imunofluorescência, fixar as lâminas com metanol pré-arrefecido (100%) a -20 ° C durante 10 min.
9. Lavar as lâminas com PBS.
10. Bloquear os slides com PBS/10% de soro fetal bovino / 0,02% Triton X100durante pelo menos 1 hr.
11. Incubar com anticorpo primário (por exemplo, anti-nestina, anti-Oct4, anti-TG30, os anticorpos anti-Nanog, Tabela 3) diluídos em tampão de bloqueio: PBS/10% de SFB durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
12. Lavar 3 vezes com tampão de bloqueio e incubar com o anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente.
13. Lavar 3 vezes com tampão de bloqueio e 3 vezes com PBS.
14. Monte slides com Vectashield meio de montagem (Vector Inc.).
15. Analisar amostras para a expressão de marcadores de células-tronco por meio de microscopia de imunofluorescência.

4. Análise de PCR em tempo real dos níveis de expressão de marcadores de células-tronco

1. Tome cerca de 2-3 ml culturas Esfera do dia 18 a 21.
2. Pelota das esferas a 1.200 rpm por 5 min e aspirar todas as médias.
3. Isolar RNA a partir das esferas usando o Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
4. Avaliar a pureza por espectrometria de RNA e de gel de agarose.
5. Sintetizar cDNA (Omniscript transcriptase reversa (Qiagen)) usando o RNA total de celulares como modelo.
6. Validar os marcadores de células estaminais por-PCR em tempo real utilizando iniciadores para os marcadores de células estaminais (mostrados na Tabela 1) numa energia Mastermix SYBR Green PCR (Applied Biosystems), com uma concentração de 375 nM de cada iniciador e 50 ng de modelo em 20 ul volume de reacção. GAPDH é usada como controle endógeno.
7. Para a amplificação utilizar uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 2,5 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 sec e 60 ° C durante 20 seg.
8. Analisar a corrida com o método 2 ⁸ (ΔΔCt).

5. Diferenciação direcionado para as células musculares lisas

1. Esferas do dia 21-26 foram semeadas em placas de cultura de 6 poços (BD Falcon) em meio SKP.
2. As células foram deixadas aderir e de superar as esferas SKP em meio durante 72 horas.
3. As células musculares lisas (CML) difeião iniciado iniciada por substituiu o meio com meio de diferenciação SMC consistindo de alta concentração de glicose de Eagle Modificado por Dulbecco (Invitrogen) contendo 5% de FBS, 5 ng / ml de PDGF-BB (Invitrogen), e 2,5 ng / ml de TGF-b1 (Invitrogen) .
4. O meio foi mudado a cada 3 dias com meio recém-preparado diferenciação SMC durante um período de 3 a 4 semanas de cultura.
5. Rastreio de marcadores SMC foi realizada após 3 a 4 semanas de imuno-histoquímica.
6. As células foram fixadas com uma solução de paraformaldeído a 4% em PBS durante 10 min.
7. As células foram permeabilizadas com PBS contendo 0,3% de Triton X-100 durante 30 min.
8. As células foram incubadas com anticorpos contra αSMA (MO851, Dako, 1:100), ou calponina (M3556, Dako, 1:100) durante 1 hora à temperatura ambiente e ainda processados ​​como descrito no 3,12) a 3,15).

Resultados

Mostramos que uma população de células que se expandem para selectivamente gerar esferas SKP sob condição de crescimento controlada constituídos por EGF e FGF2 estão presentes em culturas de fibroblastos dérmicos primários (Figura 1), que relatou recentemente ^7.

Culturas de fibroblastos de PPV 15-25 que tipicamente correspondem às estirpes de fibroblastos primários disponíveis em bancos de células foram usadas neste estudo. Culturas de fibroblastos su...

Discussão

Usando o método aqui descrito, células estaminais dérmicos virgens podem ser isolados a partir de culturas de fibroblastos dérmicos primários. Usando essa abordagem, que informou recentemente o isolamento e caracterização de células-tronco adultas a partir de culturas de fibroblastos derivados de pacientes com uma síndrome genética rara, Hutchinson-Gilford Progeria Síndrome ^7. Como mostrar aqui as precursoras células expressam marcadores de células-tronco são capazes de auto-renovação e pode s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.