בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Summary

אנו מדווחים על שיטה לבודד מבשר עור נגזרות נאיביים multipotent (SKP) תאים פיברובלסטים מתרבויות האנושיות העיקריות. אנו מראים כי SKPs אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים חולקים מאפיינים של תאי גזע דומים לאלה שנגזרים ישירות מביופסיות עור אדם. תאים אלה מבטאים את סמן הרכס העצבי, nestin, בנוסף לסמני multipotent כגון Oct4 וNanog.

Abstract

במהלך העשור האחרון, מספר אוכלוסיות תאי גזע בוגרים זוהו בעור אנושי ^1-4. הבידוד של מבשרי עור מבוגרים multipotent דווח לראשונה על ידי מילר פ D מעבדה ^{5, 6.} מחקרים המוקדמים אלה תאר אוכלוסיית תאי מבשר multipotent מהדרמיס יונקים בוגרים ^5. תאים אלה - SKPs כינה, למבשרי עור נגזרים - היו מבודדים והתרחבו ממכרסמים ועור אנושי ומובחן לצאצאים הן עצביים וmesodermal, כולל סוגי תאים לא נמצאו בעור, כגון תאי עצב ^5. מחקרי immunocytochemical על SKPs תרבית גילו כי תאים הביעו vimentin וnestin, חלבון נימה ביניים באו לידי ביטוי בשרירי מבשרי עצבים ושלד, בנוסף לפיברונקטין וסמני תאי גזע multipotent ^6. עד עכשיו, את SKPs אוכלוסיית תאי גזע הבוגרים היו מבודד מביופסיות עור יונקים טריים שנאספו. ve_content "> לאחרונה, הקמנו ודיווחתי כי אוכלוסייה של תאים מבשר נגזרים עור יכולה להישאר קיימת בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות שנקבעו מביופסיות עור ^7. ההנחה שכמה תאי גזע הסומטיים אולי מתגוררים בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות באוכלוסיית הכפלות הייתה מוקדמות בהתבסס על תצפיות אלה: (1) SKPs ותרבויות פיברובלסטים העיקריות נגזרים מדרמיס, ולכן מספר קטן של תאי SKP יכול להישאר קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי הראשוני ו( 2) תרבויות פיברובלסטים ראשוניות גדלו מ aliquots הקפוא שהיו נתון שלילי הטמפרטורה במהלך אחסון או ההעברה הכיל מספר קטן של תאים שנותרו קיימא ^7. תאים נדירים אלה היו מסוגלים להרחיב ואפשר היה passaged מספר פעמים. תצפית זו הציעה כי מספר קטן של תאים עם עוצמה התפשטות גבוהה והתנגדות ללחץ היו קיימים בתרבויות האנושיות פיברובלסטים ^7.

אנחנו ניצל את הממצאים אלה להקמת פרוטוקול לבידוד מהיר של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים העיקריות הזמינים בקלות מבנקי רקמות ברחבי העולם (איור 1). לשיטה זו משמעות חשובה שכן היא מאפשרת בידוד של תאים מבשר כאשר דגימות עור אינן נגישים תוך תרבויות פיברובלסטים עשויות להיות זמינות מבנקי רקמות, ובכך, פותחות הזדמנויות חדשות לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות גנטיות נדירות כמו גם מחלות בדוגמנות מנה.

Protocol

1. בידוד SKP מתרבויות פיברובלסטים הראשוניים

1. תרבויות פיברובלסטים או מבנקים או תאים המתקבלים ישירות מביופסיות עור נשמרות בתרבות בפיברובלסטים צמיחת מדיום DMEM המכיל 15% עוברי עגל בסרום, גלוטמין 2 מ"מ, 10 מ"ג / מיליליטר פניצילין, וסטרפטומיצין מ"ל 10 מ"ג /.

אדם fibroblasts GMO3349C וGMO8398A התקבלו מהמכון למחקר רפואי Coriell (קמדן, ניו ג'רזי) ושמשו במחקר זה.

2. תרבויות מהכפלות אוכלוסייה (קובצי PPD) 20 עד 35 שמשו לתרבויות SKP בconfluency של 80%. צלחת אחת 10 ס"מ תרבות רקמות (BD פלקון) מכילה כ 1.5x10 ⁶ תאים.
3. שטוף תאים עם PBS ו דגירה עם פתרון 2 מיליליטר טריפסין (0.25%, Invitrogen) במשך שעה 1 ב 37 ° C.
4. איסוף תאים מהצלחת עם 5 מ"ל PBS ולהעביר את ההשעיה תא צינור פלקון 15 מ"ל.
5. דגירה התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
6. הכן את מדיום גידול בהיקף SKP של DMEM-F12, 3:01 (V / V) ו40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 סרום תוסף חינם 2% (Invitrogen), 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​Fungizone (Invitrogen) ו25 מיקרומטר / מיליליטר gentamycin (Invitrogen).
7. גלולה התאים ב -1,200 סל"ד במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה באופן ישיר ב4 מדיום גידול SKP מ"ל. מעבירים את ההשעיה התא לבקבוק 25 ס"מ ² תרבית רקמה (BD פלקון).
8. דגירה את הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ולנטר את התרבות להיווצרות כדור ביום למשך 3 עד 4 שבועות.

2. תנאי תרבות Sphere

1. תרבות תאים בסנטימטר ² בקבוק 25 (BD פלקון) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. לנער את הבקבוק מדי יום במרץ כדי למנוע תאים לדבוק בחלקו התחתון של הבקבוק. במידת צורך, פיפטה מעלה ומטה עם פיפטה סטרילית 2 מ"ל לנתק את התאים חסיד ולהעביר את התרבות לבקבוק חדש.
3. ספירות הראשונות להתחיל לבנות תוך 3 to 4 ימים.
4. בואו תחומי משקעים לתחתית בקבוק ושינוי מחצית בינונית כל 3 ימים. כדי לשמור על אותו הריכוז הסופי של גורמי גדילה להוסיף גורמי גדילת 2X למדיום גידול SKP מוכן טרי.
5. שמור על הנפח קבוע מרבי 4 מ"ל.
6. כאשר התחומים להגיע לגודל של 200 מ"מ ~ הם צריכים להיות passaged על ידי פירוק הכדורים לגודל קטן יותר על ידי נמרץ pipetting למעלה ולמטה עם 2 מ"ל פיפטה.
7. התרבות מחולקת לשני 25 ס"מ ² צלוחיות (BD פלקון) ותרבויות כדורים הן להאכיל כמתואר בשלב 2.4).
8. התחומים נאספים לסמני תאי גזע הקרנה על ידי 16 עד 21 יום.

ההליך מ2.6) ו2.7) מתאר את ההתפשטות של הספירות ל (1) מאפשר nutriments וגורמי צמיחה במסגרת מדיום SKP לגשת לכל התאים בתוך כל תחום ו( 2) להרחיב את תחום תרבות SKP לפני שימוש.

בדרך כלל תרבויות Sphere תחת מ"ק שלנותנאי lture לשמור את היכולת לגדול על פני תקופה של שלושה חודשים והם passaged בין 3 עד 4 פעמים.

3. Immunocytochemistry עבור סמני תאי גזע

1. תרבויות Sphere נקצרים בPBS על ידי 16 עד 21 יום. תרבויות הן pelleted ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות.
2. התחומים הם resuspended בנפח קטן של PBS.
3. צייר שני עיגולים עם עט DAKO של כ 0.5 מיקרומטר קוטר בשקופיות מיקרוסקופ (מותג פישר).
4. הוסף 50 μl של השעיה כדור לעיגולים.
5. בדקו על ידי מיקרוסקופ אור לנוכחות של תחומים בכל טיפה.
6. תן את טיפות יבשה מתחת למכסת המנוע.
7. כך או להקפיא את השקופיות ב -80 ° C או להמשיך עם הפרוטוקול מכתים immunofluoresence.
8. למכתים immunofluorescence, לתקן את השקופיות עם מתנול מראש מקורר (100%) ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
9. שטוף את השקופיות עם PBS.
10. לחסום את השקופיות עם PBS/10% בסרום שור עוברי / 0.02% X100 טריטוןבמשך שעה לפחות 1.
11. דגירה עם נוגדן ראשוני (למשל נוגדנים נגד Nanog אנטי Nestin, אנטי Oct4, אנטי TG30,, לוח 3) דילול בחסימת המאגר: PBS/10% FBS במשך שעה 2 בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
12. לשטוף 3 פעמים עם חסימת חיץ ודגירה עם נוגדנים משני במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
13. לשטוף 3 פעמים עם חסימת פעמים חיץ ו3 עם PBS.
14. שקופיות הר עם Vectashield הרכבה בינונית (וקטור Inc).
15. ניתוח דגימות לביטוי של סמנים בתאי גזע על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.

4. ניתוח PCR בזמן אמת של רמות ביטוי של סמני תאי גזע

1. קח כ 2-3 תרבויות Sphere מ"ל מיום 18 עד 21.
2. הגלולה בתחומי 1,200 סל"ד במשך 5 דקות ולשאוב כל המדיום.
3. בודד RNA מן הספירות באמצעות Minikit RNeasy (Qiagen, ולנסיה, קליפורניה).
4. להעריך את טוהר הרנ"א על ​​ידי ספקטרומטריית וagarose ג'ל.
5. לסנתז cDNA (רברס טרנסקריפטאז Omniscript (Qiagen)) באמצעות רנ"א הכל הסלולרי כתבנית.
6. לאמת את הסמנים בתאי גזע על ידי שימוש בזמן אמת פריימרים-PCR לסמני תאי גזע (שמוצג בטבלה מס '1) בכוח SYBR גרין PCR mastermix (יישומי Biosystems) עם ריכוז של 375 ננומטר של כל צבע יסוד ו50 ng של תבנית ב20 μl עוצמת תגובה. GAPDH משמש כשליטת אנדוגני.
7. להגברת שימוש denaturation ראשונית על 95 מעלות צלזיוס במשך 2.5 דקות ואחרי 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות ו60 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות.
8. לנתח את הריצה עם 2 שיטה (ΔΔCt) ^8.

5. בידול מכוון לתאי שריר חלק

1. ספירות מהיום 21-26 היו מצופה ל -6 מנות התרבות גם (BD פלקון) במדיום SKP.
2. תאים הורשו לדבוק ולהיגמל מהתחומים במדיום SKP עבור 72 שעות.
3. תאי שריר חלק (SMCs) differentiatיון התחיל ביוזמת הוחלף בינוניות עם בינוני בידול SMC המורכב גבוה גלוקוז שונה Dulbecco נשר הבינוני (Invitrogen) המכיל 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen), ו -2.5 TGF-B1 ng / ml (Invitrogen) .
4. מדיום הוחלף כל 3 ימים עם מוכן טרי בינונית בידול SMC לתקופה של 3 עד 4 שבועות בתרבויות.
5. הקרנה עבור סמני SMC בוצעה לאחר 3 עד 4 שבועות על ידי אימונוהיסטוכימיה.
6. תאים היו קבועים עם פתרון paraformaldehyde 4% ב-PBS למשך 10 דקות.
7. תאים היו permeabilized עם PBS המכיל 0.3% טריטון X-100 למשך 30 דקות.
8. תאים הודגרו עם נוגדנים נגד αSMA (MO851, Dako, 1:100), או calponin (M3556, Dako, 1:100) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר ומעובד יותר, כמתואר ב3.12) ל3.15).

תוצאות

אנו מראים כי אוכלוסייה של תאים באופן סלקטיבי כדי ליצור הרחבת תחומי SKP בתנאי גידול מבוקרים בהיקף של EGF וFGF2 קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני (איור 1) כפי שדיווחנו לאחרונה ^7.

תרבויות פיברובלסטים מקובצי PPD 15 עד 25, כי ...

Discussion

שימוש בשיטה המתוארת במסמך זה, ניתן לבודד תאי גזע עורי נאיבי מתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני. שימוש בגישה זו, לאחרונה דיווחו בידוד והאפיון של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים שמקורם בחולים עם תסמונת גנטית נדירה, האצ'ינסון-גילפורד progeria תסמונת ^7. כמו להראות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.