Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Riepilogo

Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati ​​da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.

Abstract

Nell'ultimo decennio, diverse popolazioni di cellule staminali adulte sono state identificate in pelle umana ^1-4. L'isolamento di precursori multipotenti dermici adulti è stata riportata da F. Miller laboratorio D ^{5, 6.} Questi primi studi hanno descritto una popolazione di cellule precursori multipotenti da adulto derma mammiferi ^5. Queste cellule - SKPs denominati, per i precursori della pelle derivate - sono state isolate ed espanse da roditore e la pelle umana e differenziate in progenie sia neurale e mesoderma, compresi i tipi di cellule mai trovati in pelle, come i neuroni ^5. Studi immunocitochimiche su SKPs coltura rivelato che le cellule esprimono vimentina e nestina, una proteina filamenti intermedi espressa in precursori neuronali e muscolari scheletriche, oltre a fibronectina e marcatori di cellule staminali multipotenti ^6. Fino ad ora, le cellule staminali adulte SKPs di popolazione sono stati isolati da appena raccolti biopsie cutanee dei mammiferi. ve_content "> Recentemente, abbiamo stabilito e riportato che una popolazione di cellule precursori della pelle derivate potrebbe rimanere presente nelle colture di fibroblasti primari stabiliti da biopsie cutanee ^7. L'ipotesi che alcune cellule staminali somatiche potrebbero risiedere in colture di fibroblasti primari a raddoppi di popolazione iniziali era compatibili con i seguenti osservazioni: (1) SKPs e colture di fibroblasti primari sono derivate dal derma, e quindi un piccolo numero di cellule SKP potrebbero rimanere presente nelle colture di fibroblasti dermici primari e (2) colture primarie di fibroblasti coltivati ​​da aliquote congelate che sono state sottoposti a temperatura sfavorevole durante la conservazione o il trasferimento conteneva un piccolo numero di cellule vitali che rimanevano ^7. Queste cellule rare sono stati in grado di espandere e potrebbero essere diversi passaggi più volte. Questa osservazione suggerisce che un piccolo numero di cellule con elevata potenza proliferazione e resistenza alle sollecitazioni erano presenti in colture di fibroblasti umani ^7.

Abbiamo approfittato di questi risultati per stabilire un protocollo per il rapido isolamento di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti primari che sono prontamente disponibili presso le banche dei tessuti di tutto il mondo (Figura 1). Questo metodo ha un significato importante in quanto consente l'isolamento di cellule precursori quando i campioni di pelle non sono accessibili mentre colture di fibroblasti possono essere disponibili da parte delle banche dei tessuti, in tal modo, aprendo nuove opportunità per analizzare i meccanismi molecolari alla base di malattie genetiche rare e le malattie di modellazione in un piatto.

Protocollo

1. Isolamento SKP da colture di fibroblasti primari

1. Colture di fibroblasti o di banche di cellule o ottenuti direttamente da biopsie della pelle sono mantenute in coltura in crescita dei fibroblasti mezzo DMEM contenente 15% siero fetale di vitello, glutammina 2 mM, 10 mg / ml di penicillina e 10 mg / ml di streptomicina.

Fibroblasti umani GMO3349C e GMO8398A sono stati ottenuti dal Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) e sono stati utilizzati in questo studio.

2. Culture di raddoppi di popolazione (PPD), da 20 a 35 sono stati utilizzati per colture SKP ad una confluenza del 80%. Un 10 centimetri tessuto cultura piatto (BD Falcon) contiene circa 1.5x10 ⁶ celle.
3. Lavare le cellule con PBS e incubare con 2 ml di soluzione di tripsina (0,25%, Invitrogen) per 1 ora a 37 ° C.
4. Raccogliere le cellule dalla piastra con 5 ml di PBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo falcon 15 ml.
5. Incubare le cellule a 4 ° C per 24 hr.
6. Preparare terreno di crescita SKP consistente di DMEM-F12, 03:01 (V / V) e 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml di EGF (BD Biosciences), B27 siero supplemento libero 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) e 25 micron / ml di gentamicina (Invitrogen).
7. Agglomerare le cellule a 1200 rpm per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare direttamente in 4 ml SKP mezzo di crescita. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale 25 centimetri ² (BD Falcon).
8. Incubare il matraccio a 37 ° C e monitorare la cultura per la formazione sfera giorno per 3 a 4 settimane.

2. Sfera Culture Condizioni

1. Cellule di coltura in una beuta ² 25 cm (BD Falcon) a 37 ° C, 5% di CO _2.
2. Agitare il matraccio vigorosamente giorno per evitare cellule di aderire al fondo del pallone. Se necessario, pipettare su e giù con una pipetta sterile 2 ml per staccare cellule aderenti e trasferire la cultura di un pallone nuovo.
3. Prime sfere iniziano a costruire entro 3 to 4 giorni.
4. Lasciare sfere sedimenti sul fondo del pallone e il cambiamento metà del mezzo ogni 3 giorni. Per mantenere la stessa concentrazione finale di fattori di crescita aggiungere fattori di crescita 2X alla SKP terreno di coltura preparati al momento.
5. Tenere il volume costante massimo 4 ml.
6. Quando sfere raggiungono una dimensione di ~ 200 millimetri dovrebbero essere diversi passaggi rompendo le sfere di piccole dimensioni di vigorosa pipettando su e giù con una pipetta 2 ml.
7. La cultura è diviso in due 25 centimetri ² boccette (BD Falcon) e sfere culture sono alimenti come descritto al punto 2.4).
8. Sfere sono raccolti per marcatori di cellule staminali di screening per giorno da 16 a 21.

La procedura da 2.6) e 2.7) descrive la propagazione delle sfere a (1) permette di nutrienti e fattori di crescita compresi nel SKP medie di accedere a tutte le cellule all'interno di ogni sfera e (2) per espandere la cultura sfera SKP prima dell'uso.

Tipicamente culture sfera sotto i nostri cucondizioni lture mantengono la capacità di crescere su un periodo di tre mesi e sono diversi passaggi da 3 a 4 volte.

3. Immunocitochimica di marcatori di cellule staminali

1. Culture Sphere sono raccolte in PBS da giorno 16 al 21. Le culture sono pellettato a 1.000 rpm per 5 min.
2. Sfere sono risospese in un piccolo volume di PBS.
3. Disegnare due cerchi con una penna DAKO di circa 0,5 micron di diametro su vetrini da microscopio (marchio Fisher).
4. Aggiungere 50 ml di sospensione sfera in circoli.
5. Controllare al microscopio ottico per la presenza di sfere in ciascuna goccia.
6. Lasciate asciugare le gocce sotto il cofano.
7. O congelare i vetrini a -80 ° C oppure procedere con il protocollo di colorazione immunofluorescenza.
8. Per immunofluorescenza, fissare i vetrini con metanolo precedentemente raffreddata (100%) a -20 ° C per 10 min.
9. Lavare i vetrini con PBS.
10. Bloccare le diapositive con PBS/10% di siero fetale bovino / 0.02% Triton X100per almeno 1 ora.
11. Incubare con anticorpo primario (ad esempio anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, gli anticorpi anti-Nanog, tabella 3) diluito in tampone di bloccaggio: PBS/10% FBS per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
12. Lavare 3 volte con tampone di arresto e incubare con l'anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente.
13. Lavare 3 volte con il blocco tempi di buffer e 3 con PBS.
14. Mount diapositive con Vectashield montaggio medium (Vector Inc.).
15. Analizzare i campioni per l'espressione di marcatori di cellule staminali mediante microscopia di immunofluorescenza.

4. L'analisi PCR in tempo reale dei livelli di espressione di marcatori di cellule staminali

1. Prendete circa 2-3 ml culture Sfera da giorno 18 a 21.
2. Pellet le sfere a 1200 rpm per 5 minuti e aspirare tutte di media.
3. Isolare RNA dalle sfere utilizzando il Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
4. Valutare la purezza dell'RNA mediante spettrometria e gel.
5. Sintetizzare cDNA (Omniscript trascrittasi inversa (Qiagen)) con il totale di RNA cellulari come modello.
6. Convalidare i marcatori di cellule staminali da Realtime-PCR utilizzando i primer per marcatori di cellule staminali (indicata nella Tabella 1) in un Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems), con una concentrazione di 375 nM di ciascun primer e 50 ng di template in un 20 l volume di reazione. GAPDH è utilizzato come controllo endogeno.
7. Per l'amplificazione utilizzare un denaturazione iniziale a 95 ° C per 2,5 minuti seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 5 sec e 60 ° C per 20 sec.
8. Analizza la corsa con il 2 (ΔΔCt) Metodo ^8.

5. Differenziazione Regia in cellule muscolari lisce

1. Sfere da giorno 21 al 26 sono stati placcati in 6 piatti della cultura e (BD Falcon) in SKP medie.
2. Le cellule sono stati autorizzati ad aderire e diventare troppo grande dalle sfere in media SKP per 72 ore.
3. Cellule muscolari lisce (SMC) differenzianteione iniziato avviato dal sostituito il mezzo con SMC terreno di differenziamento costituito alta glucosio di Dulbecco Modified Eagle Medium (Invitrogen) contenente il 5% FBS, 5 ng / ml di PDGF-BB (Invitrogen), e 2,5 ng / ml di TGF-b1 (Invitrogen) .
4. Mezzo è stato cambiato ogni 3 giorni con appena preparato terreno di differenziamento SMC per un periodo di 3 a 4 settimane in culture.
5. Lo screening per i marcatori SMC è stata eseguita dopo 3 o 4 settimane di immunoistochimica.
6. Cellule sono state fissate con soluzione di paraformaldeide 4% in PBS per 10 min.
7. Le cellule sono state permeabilizzate con PBS contenente 0,3% Triton X-100 per 30 min.
8. Le cellule sono state incubate con anticorpi contro αSMA (MO851, Dako, 1:100), oppure calponina (M3556, Dako, 1:100) per 1 ora a temperatura ambiente e successivamente trattati come descritto in 3.12) a 3.15).

Risultati

Si dimostra che una popolazione di cellule che selettivamente si espandono per generare sfere SKP sotto condizione di una crescita controllata, comprensivi di EGF e FGF2 sono presenti in colture di fibroblasti cutanei primari (figura 1), come abbiamo riportato di recente ^7.

Colture di fibroblasti da PPD 15 e 25 che in genere corrispondono ai fibroblasti primari ceppi disponibili da banche di cellule sono stati utilizzati in questo studio. Colture di fibroblasti so...

Discussione

Utilizzando il metodo qui descritto, le cellule staminali cutanee naive possono essere isolati da colture di fibroblasti dermici primari. Usando questo approccio, abbiamo recentemente riportato l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti derivati ​​da pazienti con una sindrome genetica rara, di Hutchinson-Gilford progeria sindrome ^7. Come mostrano qui quei precursori cellule esprimono marcatori di cellule staminali sono in grado di auto-rinnova...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.