Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Zusammenfassung

Wir berichten über eine Methode, um naive multipotent Haut stammenden Vorläufer (SKP) Zellen aus primären humanen Fibroblasten Kulturen zu isolieren. Wir zeigen, dass diese SKPs von Fibroblastenkulturen abgeleitet ähnliche Stammzellen Eigenschaften teilen, die, die direkt aus der menschlichen Haut Biopsien abgeleitet. Diese Zellen exprimieren die Neuralleisten Marker Nestin, zusätzlich zu der multipotenten Marker wie OCT4 und Nanog.

Zusammenfassung

Im Laufe des letzten Jahrzehnts haben mehrere erwachsenen Stammzell-Populationen in der menschlichen Haut ^1-4 identifiziert worden. Die Isolierung von multipotent erwachsenen Haut Vorstufen wurde zuerst von F. Miller D Labor ^{5, 6} gemeldet. Diese frühen Studien beschrieben eine multipotent Vorläufer-Zell-Population von adulten Dermis ^5. Diese Zellen - bezeichnet SKPs, für Haut-abgeleiteten Vorstufen - wurden isoliert und expandiert von Nagetier-und menschlichen Haut und differenziert sowohl in neuralen und mesodermalen Nachkommen, darunter Zelltypen nie in der Haut gefunden, wie Neuronen ^5. Immunzytochemische Studien an kultivierten Zellen SKPs ergab, dass Vimentin und Nestin, ein Intermediärfilament Protein in neuronalen und Skelettmuskel Vorstufen ausgedrückt ausgedrückt zusätzlich zu Fibronektin und multipotent Stammzellmarkern ^6. Bis jetzt haben die adulten Stammzellen Bevölkerung SKPs aus frisch gesammelten Säugerhaut Biopsien isoliert worden. ve_content "> Vor kurzem haben wir festgestellt, und berichtete, dass eine Population von Haut abgeleitet Vorläuferzellen bleiben konnte in primären Fibroblasten Kulturen aus Hautbiopsien ⁷ etabliert. Die Annahme, dass ein paar somatischen Stammzellen könnten in primären Fibroblastenkulturen am frühen Populationsverdopplungen aufzuhalten war basierend auf den folgenden Beobachtungen: (1) SKPs und primären Fibroblasten Kulturen werden von der Dermis abgeleitet und damit eine kleine Anzahl von SKP Zellen bleiben konnte in primären dermalen Fibroblasten Kulturen und (2) der primären Fibroblastenkulturen aus gefrorenen Aliquots, die angebaut wurden unterzogen, um ungünstige bei Lagerung oder Übertragung enthielt eine geringe Anzahl von Zellen, lebensfähige ⁷ blieb. Diese seltenen Zellen waren in der Lage zu erweitern und können passagiert werden mehrmals. Diese Beobachtung vorgeschlagen, dass eine kleine Anzahl von Zellen mit hoher Verbreitung Wirksamkeit und Widerstandsfähigkeit gegen Stress waren im menschlichen Fibroblastenkulturen ^7.

Wir nutzten diese Erkenntnisse, um ein Protokoll für die schnelle Isolierung von adulten Stammzellen aus primären Fibroblasten Kulturen, die leicht zugänglich von Gewebe Banken auf der ganzen Welt (Abbildung 1) zu etablieren. Diese Methode hat wichtige Bedeutung, da sie die Isolierung von Vorläuferzellen ermöglicht, wenn Hautproben nicht zugänglich sind, während Fibroblastenkulturen kann aus Gewebe Banken zur Verfügung, damit die Eröffnung neuer Möglichkeiten, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen seltene genetische Erkrankungen sowie Erkrankungen Modellierung in eine sezieren Gericht.

Protokoll

1. SKP Isolation von Primär Fibroblastenkulturen

1. Fibroblasten-Kulturen entweder aus Zellbanken oder direkt aus Hautproben sind in Kultur in Fibroblastenwachstumsfaktor DMEM mit 15% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin, 10 mg / ml Penicillin und 10 mg / ml Streptomycin gehalten.

Humane Fibroblasten GMO3349C und GMO8398A wurden aus dem Coriell Institut für medizinische Forschung (Camden, NJ) erhalten und wurden in dieser Studie verwendet.

2. Kulturen von Populationsverdopplungen (PPD) 20 bis 35 wurden für SKP Kulturen bei einer Konfluenz von 80% verwendet. Eine 10 cm Gewebekulturschale (BD Falcon) enthält etwa 1.5x10 ⁶ Zellen.
3. Waschen der Zellen mit PBS und Inkubation mit 2 ml Trypsin-Lösung (0,25%, Invitrogen) für 1 Stunde bei 37 ° C.
4. Sammeln Zellen von der Platte mit 5 ml PBS und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon-Röhrchen.
5. Inkubieren der Zellen bei 4 ° C für 24 Stunden.
6. Bereiten SKP Nährmedium bestehend aus DMEM-F12, 3:1 (V / V) und 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 Serum kostenlose Beilage 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) und 25 um / ml Gentamycin (Invitrogen).
7. Pellet die Zellen bei 1.200 rpm für 5 min und Zellpellet direkt in 4 ml Wachstumsmedium SKP. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 25 cm ² Zellkulturflasche (BD Falcon).
8. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C und überwachen die Kultur für Bildung Sphäre täglich für 3 bis 4 Wochen.

2. Sphere Kultur AGB

1. Kultur Zellen in einem 25 cm ^2-Flasche (BD Falcon) bei 37 ° C, 5% CO _2.
2. Schütteln Sie die Flasche kräftig täglich um Zellen zu vermeiden, um den Boden des Kolbens haften. Falls erforderlich, und Abpipettieren mit 2 ml sterilen Pipette zu adhärenten Zellen trennen und zu übertragen, die Kultur zu einem neuen Kolben.
3. Erste Kugeln anfangen zu bauen innerhalb von 3 to 4 days.
4. Lassen Sphären Sediment am Boden des Kolbens und Wandel Hälfte des Mediums alle 3 Tage. Um die gleiche Endkonzentration von Wachstumsfaktoren-Add 2X Wachstumsfaktoren auf die frisch zubereiteten SKP Nährmedium.
5. Halten Sie die Lautstärke konstant maximal 4 ml.
6. Wenn Kugeln eine Größe von ~ 200 mm erreichen sie sollten durch den Abbau der Sphären zu kleineren durch kräftiges Auf-und Abpipettieren mit einer 2 ml Pipette passagiert werden.
7. Die Kultur wird in zwei 25 cm ^2-Kolben (BD Falcon) und Kugeln Kulturen aufgeteilt sind Futtermittel im Sinne von Schritt 2.4) beschrieben.
8. Kugeln sind für Stammzell-Marker Screening von Tag 16 bis 21 gesammelt.

Das Verfahren von 2.6) und 2.7) beschreiben die Ausbreitung der Kugeln (1) können Nährstoffe und Wachstumsfaktoren in SKP Medium enthalten, um alle Zellen in jedem Bereich zuzugreifen und (2), um die Kugel SKP Kultur vor Gebrauch erweitern.

Typischerweise Sphere Kulturen unter unserer culture Bedingungen halten die Fähigkeit zu wachsen über einen Zeitraum von drei Monaten und sind zwischen 3 bis 4 mal passagiert.

3. Immunocytochemistry für Stammzell-Marker

1. Sphere Kulturen werden in PBS für Tag 16 bis 21 geerntet. Die Kulturen werden bei 1000 Upm für 5 Minuten pelletiert.
2. Kugeln sind in einem kleinen Volumen von PBS resuspendiert.
3. Zeichnen Sie zwei Kreise mit einem DAKO pen von etwa 0,5 &mgr; m im Durchmesser auf Objektträgern (Fisher-Marke).
4. In 50 ul Kugel Suspension in den Kreisen.
5. Überprüfen mittels Lichtmikroskopie auf das Vorhandensein von Kugeln in jedem Tropfen.
6. Lassen Sie die Tropfen trocken unter der Haube.
7. Entweder frieren die Objektträger bei -80 ° C oder fahren Sie mit der Immunfluoreszenz Färbeprotokoll.
8. Für Immunofluoreszenzfärbung, beheben Sie die Folien mit vorgekühlten Methanol (100%) bei -20 ° C für 10 min.
9. Waschen Sie die Objektträger mit PBS.
10. Blockieren Sie die Folien mit PBS/10% fötalem Rinderserum / 0,02% Triton X100für mindestens 1 Stunde.
11. Inkubieren mit primärem Antikörper (zB Anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-Antikörper Nanog, Tabelle 3) in Blocking-Puffer verdünnt PBS/10% FBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
12. 3 x waschen mit Blocking-Puffer und Inkubation mit sekundärem Antikörper für 1 Std. bei Raumtemperatur.
13. 3 x waschen mit Blocking-Puffer und 3-mal mit PBS.
14. Berg Dias mit Vectashield Montage Medium (Vector Inc.).
15. Analysieren Sie die Proben für die Expression von Stammzell-Marker durch Immunfluoreszenzmikroskopie.

4. Realtime PCR-Analyse der Expression von Stammzell-Marker

1. Nehmen Sie etwa 2-3 ml Sphere Kulturen von Tag 18 bis 21.
2. Pellet die Kugeln bei 1.200 rpm für 5 min und saugen alle Medium.
3. Isolieren von RNA aus den Bereichen mit dem RNeasy Minikit (Qiagen, Valencia, CA).
4. Bewerten RNA Reinheit durch Spektrometrie und Agarosegel.
5. Synthesize cDNA (Omniscript Reverse Transkriptase (Qiagen)) unter Verwendung der gesamten zellulären RNA als Vorlage.
6. Überprüfen Sie die Stammzell-Marker durch Realtime-PCR unter Verwendung der Primer für Stammzell-Marker (siehe Tabelle 1) in einem Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) mit einer Konzentration von 375 nM von jedem Primer und 50 ng Template in einem 20 ul Reaktionsvolumen. GAPDH als endogene Kontrolle verwendet.
7. Für die Amplifikation verwenden eine anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 2,5 min gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 5 Sekunden und 60 ° C für 20 sek.
8. Analysieren Sie den Lauf mit der 2 (ΔΔCt)-Methode ^8.

5. Gerichteten Differenzierung in die glatten Muskelzellen

1. Spheres von Tag 21 bis 26 wurden in 6-Well-Kulturschalen (BD Falcon) in SKP ausplattiert.
2. Man ließ die Zellen anhaften und von den Kugeln in SKP Medium herauswachsen für 72 Stunden.
3. Glatte Muskelzellen (SMC) differentiatIonen gestartet eingeleitet ersetzt durch das Medium mit SMC Differenzierung, das aus hoch-Glucose modifizierten Eagle-Dulbecco-Medium (Invitrogen), enthaltend 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen) und 2,5 ng / ml TGF-b1 (Invitrogen) .
4. Das Medium wurde alle 3 Tage mit frisch zubereiteten SMC Differenzierungsmedium für einen Zeitraum von 3 bis 4 Wochen in Kultur.
5. Screening für SMC-Marker wurde nach 3 bis 4 Wochen durch Immunhistochemie durchgeführt.
6. Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Min. fixiert.
7. Die Zellen wurden mit PBS, enthaltend 0,3% Triton X-100 für 30 Minuten permeabilisiert.
8. Die Zellen wurden mit Antikörpern gegen αSMA (MO851, Dako, 1:100) oder Calponin (M3556, Dako, 1:100) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und weiterverarbeitet, wie in 3.12 beschrieben) bis 3,15) inkubiert.

Ergebnisse

Wir zeigen, dass eine Population von Zellen, die selektiv zu erweitern, um SKP Sphären unter kontrollierten Wachstumsbedingungen bestehend aus EGF und FGF2 erzeugen in primären dermalen Fibroblasten-Kulturen (Abb. 1) sind, wie wir vor kurzem ⁷ gemeldet.

Fibroblasten-Kulturen aus PPD 15 bis 25, die üblicherweise für den Fibroblasten-Stämme erhältlich Zellbanken entsprechen, wurden in dieser Studie verwendet. Fibroblasten-Kulturen hat dem Doppel-Behandlung, be...

Diskussion

Unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens können naiven dermale Stammzellen aus primären dermalen Fibroblasten Kulturen isoliert werden. Mit diesem Ansatz haben wir vor kurzem berichtet, die Isolierung und Charakterisierung von adulten Stammzellen aus Fibroblastenkulturen von Patienten mit einer seltenen genetischen Syndrom, Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom ⁷ abgeleitet. Wie hier zeigen diese Vorläuferzellen express Stammzell-Marker sind in der Lage sich selbst zu erneuern und gerichtet in ve...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.