İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Özet

Birincil insan fibroblast ikinci naif multipotent ten türetilmiş öncü (SKP) hücreleri izole etmek için bir yöntem sunulmaktadır. Biz fibroblast kültürleri elde edilen bu SKPS insan deri biyopsisi doğrudan elde benzeyen kök hücre özelliklerini paylaşmak olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, örneğin Oct4 ve Nanog olarak multipotent işaretleri ek olarak nöral tepe işaretleyici, Nestin, ifade eder.

Özet

Son on yılda, birçok yetişkin kök hücre popülasyonlarının insan derisi ^1-4 tespit edilmiştir. Multipotent yetişkin dermal öncüleri izolasyonu ilk Miller F. D laboratuarı ^{5, 6} tarafından bildirildi. Bu ilk çalışmalar yetişkin memeli dermis ⁵ Bir multipotent öncül hücre popülasyonu nitelendirdi. Bu hücreler - adlandırılan SKPS, cilt kaynaklı öncüleri için - izole ve kemirgen ve insan derisi genişletilmiş ve bu nöronlar ⁵ gibi deride bulmadım hücre tipleri de dahil olmak üzere sinir ve mezodermal hem döl, içine ayırt edildi. Kültür SKPS üzerinde immünositokimyasal çalışmalar hücre fibronektin ve multipotent kök hücre işaretleyicileri ⁶ ek olarak vimentin ve Nestin, sinir ve kas öncüleri olarak ifade bir ara filaman proteini ifade olduğunu ortaya koymuştur. Şimdiye kadar, yetişkin kök hücreleri nüfus SKPS yeni toplanmış memeli biyopsi izole edilmiştir. ve_content "> Son zamanlarda, kurulan ve cilt elde öncü hücreler nüfusu biyopsi ⁷ kurulan primer fibroblast kültürlerinde mevcut kalabileceklerini bildirdi. birkaç somatik kök hücreleri erken nüfus çiftlenmeler birincil fibroblast kültürlerinde ikamet olabilir varsayım oldu Aşağıdaki gözlemlerine dayanarak: (1) SKPS ve primer fibroblast kültürleri dermis türetilmiştir ve SKP hücrelerin bu nedenle az sayıda birincil dermal fibroblast kültürlerinde mevcut kalamayacağını ve (2) primer fibroblast kültürleri olmuştur dondurulmuş alikotları büyüdü ⁷ yaşayabilecek durumda kalır küçük bir hücre sayısı bulunan depolama ve nakil sırasında uygun olmayan bir sıcaklığa maruz. Bu nadir hücreleri birkaç kez genişletmek ve geçişli olabilir başardık. Bu gözlem, önerilen, yüksek proliferasyon gücü ve strese karşı direnci olan küçük bir hücre sayısı insan fibroblast kültürlerinde ⁷ mevcuttu.

Biz dünya çapında doku bankaları (Şekil 1) temin edilebilir primer fibroblast kültürlerden yetişkin kök hücrelerin hızlı izolasyonu için bir protokol oluşturmak için bu bulguların yararlandı. Deri örnekleri erişilemez zaman fibroblast kültürleri içinde moleküler nadir genetik hastalıkların altında yatan mekanizmaların yanı sıra modelleme hastalıkları incelemek için yeni fırsatlar açılması, böylece, doku bankalardan bulunabilir ederken öncü hücrelerin izolasyonu sağlayan bu yöntem önemli bir öneme sahip çanak.

Protokol

1. İlköğretim Fibroblast Kültürler gelen SKP İzolasyon

1. Hücre bankaları veya doğrudan deri biyopsileri elde edilen ya da fibroblast fibroblast büyüme ortamı DMEM,% 15 fetal dana serumu, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penisilin ve 10 mg / ml streptomisin ihtiva eden kültür içinde muhafaza edilir.

İnsan fibroblast GMO3349C ve GMO8398A Tıbbi Araştırma Enstitüsü Coriell (Camden, NJ) 'den elde edildi ve bu çalışmada kullanılmıştır.

2. Nüfus çiftleştirmeyi kültürlerinde (PPD) 20-35% 80 arasında bir katışma az SKP kültürler kullanılmıştır. Bir 10 cm doku kültürü çanak (BD Falcon) yaklaşık 1.5x10 ⁶ hücre içerir.
3. 37 ° C'de 1 saat boyunca 2 ml tripsin çözeltisi (% 0.25, Invitrogen) ° C PBS ile inkübe edilir ve hücreleri yıkayın
4. 5 ml PBS ile plaka hücreleri toplamak ve bir 15 ml Falcon tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
5. 24 saat boyunca 4 ° C'de inkübe hücreleri.
6. DMEM-F12, 03:01 (v / v) ve 40 ng / ml 'FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 serumsuz takviyesi% 2 (Invitrogen), 1 ug oluşan SKP büyüme ortamı hazırlamak / ml Fungizone (Invitrogen) ve 25 mm / ml gentamisin (Invitrogen).
7. Pelet 5 dakika boyunca 1,200 rpm'de hücreleri ve 4 ml SKP büyüme ortamı içinde, doğrudan hücre pelletini. 25 cm ² doku kültürü şişesi (BD Falcon) için hücre süspansiyonu aktarın.
8. 37 ° C'de inkübe edin ve şişeye 3-4 hafta boyunca günlük olarak küre oluşumu için kültür izler.

2. Küre Kültür Koşullar

1. 37 ° C,% 5 CO ₂ az 25 cm ² şişesi (BD Falcon) Kültür hücreleri.
2. Şişenin dibine bağlı hücre önlemek için kuvvetli bir şekilde günlük olarak çalkalanır. Gerekirse, yapışık hücreleri ayırmak ve yeni bir balona kültür aktarmak için 2 ml steril pipet ile aşağı yukarı pipet ve.
3. İlk küre 3 t içinde oluşturmaya başlayabilirsinizo 4 gün.
4. Orta her 3 günde bir şişeye ve değişim yarım dibine küreler tortu izin. Büyüme faktörleri, aynı nihai konsantrasyonda tutmak için taze hazırlanmış SKP besiyerine 2X büyüme faktörleri ekleyin.
5. 4 ml maksimum hacmi sabit tutun.
6. Küreler ~ 200 mm boyutu ulaştığında onlar güçlü bir 2 ml pipet ile aşağı yukarı pipetleme ve daha küçük boyuta küreler parçalayarak geçişli olmalıdır.
7. Kültür adım 2.4) açıklandığı gibi yem iki 25 cm ² matara (BD Falcon) ve küreler kültürler ayrılmıştır.
8. Küreler 21 gün 16 ile tarama kök hücre belirteçleri için toplanır.

2.6) ve 2.7) gelen prosedüre küre yayılma tarif (1) SKP orta dahil besin ve büyüme faktörleri her alanı içinde tüm hücreleri erişim sağlar ve (2) önce kullanım SKP küre kültür genişletin.

Bizim cu altında genellikle Küre kültürLTURE şartlar, üç aylık bir süre boyunca büyüme kapasitesini korumak ve 3-4 kez arasında tatbik edilir.

3. Kök Hücre Markers için İmmünositokimya

1. Küre kültürler gün 16 ile 21 PBS içinde hasat edilir. Kültürler 5 dakika boyunca 1000 rpm'de pellet haline getirilir.
2. Küreler PBS küçük bir hacim içinde tekrar süspanse edilir.
3. Mikroskop slaytlar (Fisher marka) üzerinde çapı yaklaşık 0.5 mikron bir DAKO kalemle iki daire çizin.
4. Daire içine küre süspansiyonu 50 ul ekleyin.
5. Her damla küreler varlığı için ışık mikroskobu ile kontrol edin.
6. Başlık altında damla kurumasını bekleyin.
7. Ya -80 ° C'de slaytlar dondurmak veya Immunoflorans boyama protokolü ile devam edin.
8. Immünofloresan boyama için, 10 dakika boyunca -20 ° C'de önceden soğutulmuş metanol (% 100) ile slaytlar düzeltmek.
9. PBS ile slaytlar yıkayın.
10. PBS/10% Fetal sığır serumu / 0.02% Triton X100 ile slaytlar Bloken az 1 saat boyunca kanştınldı.
11. PBS/10% 4, 2 saat oda sıcaklığında veya gece boyunca FBS ° C: tampon engelleme seyreltilmiş birincil antikor (örneğin, bir anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-Nanog antikorlar, Tablo 3) ile inkübe
12. Tampon engelleme ile 3 kez yıkanır ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca sekonder antikor ile inkübe edin.
13. PBS ile 3 kez tampon ve engelleme ile 3 kez yıkanır.
14. Vectashield montaj orta (Vektör Inc) ile montaj slaytlar.
15. Mikroskobi ile kök hücre belirteçleri ifade örnekleri analiz edin.

4. Kök Hücre belirteçlerinin İfade Düzeylerinin gerçek zamanlı PCR Analizi

1. 21 gün 18 yaklaşık 2-3 ml Küre kültürleri alın.
2. Pelet 5 dakika boyunca 1.200 rpm'de küreler ve tüm orta aspire.
3. RNeasy Minikit (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak kürelerden RNA izole edin.
4. Spektrometresi ve agaroz jel RNA saflık değerlendirin.
5. Şablon olarak toplam hücresel RNA kullanarak (Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen)) cDNA sentez.
6. 20 ul her bir primerden 375 nM ve 50 ng şablon bir konsantrasyon ile bir güç SYBR Green PCR master (Applied Biosystems) kök hücre işaretleyicileri (Tablo 1 'de gösterildiği gibi) için gerçek zamanlı PCR kullanılarak primerleri ile kök hücre belirteçleri doğrulamak reaksiyon hacmi. GAPDH endojen kontrol olarak kullanılır.
7. Amplifikasyon 20 saniye boyunca 5 saniye 60 ° C 95 ° C'de 40 döngü, ardından 2.5 dakika boyunca 95 ° C'de bir ilk denatürasyon ° C kullanın.
8. 2 (ΔΔCt) yöntemi ⁸ ile çalışma analiz edin.

5. Düz Kas Hücreleri içine Yönetmen Farklılaşma

1. 21. gün ile 26 küreler SKP ortam içinde 6 bölümlü kültür tabaklarında (BD Falcon) içine ekildi.
2. Hücreler, 72 saat boyunca ortam içinde SKP kürelerden yapışır ve büyümek için izin verildi.
3. Düz kas hücreleri (SMC'lere) diferansiyeiyon% 5 FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen) ve 2.5 ng / ml TGF-B1 (Invitrogen) içeren yüksek glukoz Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (Invitrogen) 'dan oluşan SMC farklılaşma ortamı ile orta değiştirilmesi tarafından başlatılan başladı .
4. Orta kültürlerde 3-4 haftalık bir süre boyunca taze hazırlanmış SMC farklılaşma ortamı ile her 3 günde bir değiştirildi.
5. SMC işaretleri için tarama immünohistokimya ile 3-4 hafta sonra gerçekleştirilmiştir.
6. Hücreler, 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid solüsyonu ile tespit edilmiştir.
7. Hücreler PBS 30 dakika için% 0.3 Triton X-100 ihtiva eden permeabilize edilmiştir.
8. Hücreler, oda sıcaklığında 1 saat ve daha fazla olarak 3.15) 3.12 'de açıklandığı gibi işlenmiş) için αSMA (MO851, Dako, 1:100) veya calponin (M3556, Dako, 1:100) karşı antikorlar ile inkübe edildi.

Sonuçlar

Biz son ⁷ raporlanan seçici EGF ve FGF2 oluşan kontrollü büyüme koşul altında SKP küreler oluşturmak için genişletmek hücre populasyonunun birincil dermal fibroblast kültürleri (Şekil 1) mevcut olduğunu göstermektedir.

Tipik olarak hücre bankaları temin primer fibroblastlar suşları uygun PPD 15 ile 25 fibroblast bu çalışmada kullanılmıştır. Bu yöntem, anlatılan 24 saat süre ile yiyecek tüketimi ile birlikte soğuk tedavi oluşan çi...

Tartışmalar

Bu tarifnamede anlatılan yöntem kullanılarak, naif dermal kök hücrelerin, birincil deri fibroblast izole edilebilir. Bu yaklaşımı kullanarak, son zamanlarda nadir görülen genetik bir sendrom, Hutchinson-Gilford progeria sendromu ⁷ hastalarda elde edilen fibroblast kültürlerden erişkin kök hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu rapor. Gibi bu öncü hücreler ifade kök hücre belirteçleri kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve (lütfen Wenzel ve ark. Tarafından 4 bkz.,

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.