인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 성인 줄기 세포 분리

요약

우리는 인간의 기본 섬유 아세포 배양에서 순진 능성 피부에서 파생 된 전구체 (SKP) 세포를 분리하는 방법을보고합니다. 우리는 섬유 아세포 문화에서 파생 된 이러한 SKPs은 인간의 피부 생검에서 직접 파생 된 것과 유사한 줄기 세포 특성을 공유하는 것을 보여줍니다. 이러한 세포는 OCT4와 나노 등 능성 마커뿐만 아니라 신경 능선 마커 스틴을 표현한다.

초록

지난 십 년간, 여러 성체 줄기 세포 집단은 인간의 피부 ^1-4에서 발견되었습니다. 능성 성인 피부 전구체의 분리가 처음 밀러 F. D 연구소 ^{5, 6에} 의해보고되었다. 이러한 초기 연구는 성인 포유류의 진피 ^5에서 다 능성 전구 세포 인구를 설명했다. 이러한 세포 -라고 SKPs, 피부 파생 된 전구체는 - 격리와 설치류와 인간의 피부에서 확장하고 뉴런 ^5와 같은 피부 발견되지 않았다 세포 유형 등 신경과 중배엽 모두 자손,로 분화되었다. 배양 SKPs에 면역 세포 연구는 세포가 피브로넥틴 및 다 능성 줄기 세포 마커 ^6에 추가 vimentin에와 스틴, 신경과 골격 근육의 전구체로 표현 중간 필라멘트 단백질을 발현 것으로 나타났다. 지금까지 성체 줄기 세포 인구 SKPs 갓 수집 포유류의 피부 생검에서 분리되었다. ve_content는 "> 최근에, 우리는 설립과 피부 유래 전구 세포의 인구는 피부 생검 ^7에서 설정된 기본 섬유 아세포 배양에 존재 남아있을 것으로보고있다. 몇 체세포 줄기 세포가 초기 인구 계대에서 차 섬유 아세포 배양에 상주 할 수있는 가정이었다 다음과 같은 관측에 따라 : (1) SKPs 및 기본 섬유 모세포 배양 진피에서 파생 된, 그리고 SKP 세포 따라서 소수의 1 차 피부 섬유 아세포 배양에 존재 남아있을 수 있으며, (2) 주요 섬유 아세포 배양했습​​니다 냉동 분주에서 성장 ⁷ 가능한 남아 세포의 작은 숫자가 포함 된 저장 또는 전송 중에 불리한 온도에 노출.이 드문 세포는 여러 번 확장 및 계대 수있었습니다.이 관찰 제안하는 높은 확산 힘과 스트레스에 대한 저항을 가진 세포의 작은 숫자 인간 섬유 아세포 배양 ⁷ 참석했다.

우리는 전세계 조직 은행 (그림 1)에서 쉽게 사용할 수있는 기본 섬유 모세포 배양에서 성체 줄기 세포의 빠른 분리를위한 프로토콜을 설정하는 이러한 연구 결과를 이용했습니다. 피부 샘플에 액세스 할 수없는 경우 섬유 아세포 문화의 분자 희귀 유전 질환을 기본 메커니즘뿐만 아니라 모델링 질병을 해부 할 수있는 새로운 기회를 열어, 따라서, 조직 은행에서 구할 수 있지만이 전구 세포의 분리를 허용하는이 방법은 중요한 의미가있다 요리.

프로토콜

1. 차 섬유 아세포 배양에서 SKP 분리

1. 세포 은행에서 직접 피부 생검에서 얻은 하나 섬유 아세포 배양 섬유 모세포 성장 배지 DMEM 15 % 태아 송아지 혈청, 2 MM의 글루타민, 10 MG / ML 페니실린, 10 MG / ML 스트렙토 마이신을 포함의 문화에 유지됩니다.

인간 섬유 아세포 GMO3349C 및 GMO8398A는 의료 연구를위한 Coriell 연구소 (캠든, NJ)에서 얻은 본 연구에 사용 하였다.

2. 인구 계대에서 배양 (PPD가) 20 35 80 %의 confluency에에 SKP 문화를 위해 사용되었다. 한 10cm 조직 문화 접시 (BD 팔콘)는 약 1.5x10 ⁶ 셀이 포함되어 있습니다.
3. 37 1 시간 2 ML 트립신 용액 (0.25 %, Invitrogen 사) ° C.와 PBS와 부화와 세포를 씻으
4. 5 ML PBS와 함께 접시에에서 세포를 수집하고 15 ML 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
5. 24 시간 동안 4 ° C에서 세포를 품어.
6. DMEM-F12 3:1 (V / V) 40 NG / ML FGF2 (BD Biosciences는, 20 NG / ML EGF (BD Biosciences의), B27 혈청 보충 2 % (Invitrogen 사), 1 μg으로 구성된 SKP 성장 매체를 준비합니다 / ㎖ Fungizone (Invitrogen 사) 및 25 μm의 / ㎖ 젠타 마이신 (Invitrogen 사).
7. 펠릿 5 분 동안 1,200 rpm으로 세포와 4 ML SKP 성장 매체에서 직접 세포 펠렛을 resuspend을. 25cm ² 조직 문화 플라스크 (BD 팔콘)에 세포 현탁액을 전송합니다.
8. 37 ° C에서 플라스크 배양하여 3 4 주 동안 매일 구체 형성의 문화를 모니터링합니다.

2. 구 배양 조건

1. 37 ° C, 5 % CO _2에서 25cm ² 플라스크 (BD 팔콘)에서 배양 세포.
2. 플라스크의 바닥에 부착하는 세포를 방지하기 위해 적극적으로 매일 플라스크를 흔들어. 필요한 경우, 자기편 세포를 분리하고 새 플라스크에 문화를 전송하는 2 ㎖ 멸균 피펫 아래로 피펫.
3. 첫 번째 분야는 3t에서 구축 시작오 사일.
4. 매체 매 3 일마다의 플라스크 변화의 절반 아래로 분야 침전물을 할 수 있습니다. 성장 인자의 동일한 최종 농도를 유지하려면 갓 준비 SKP 성장 매체에 배 성장 인자를 추가합니다.
5. 4 ML 최대 볼륨을 일정하게 유지.
6. 분야는 ~ 200mm의 크기에 도달하면 그들은 활발한는 2 ㎖ 피펫 아래로 피펫에 의해 작은 크기로 분야를 세분화하여 계대해야합니다.
7. 문화는 2.4 단계)에 설명 된대로 사료 두 25cm ² 플라스크 (BD 팔콘)와 분야 ​​문화로 분할됩니다.
8. 분야는 21 일 (16)에 의해 심사 줄기 세포 마커를 수집하고 있습니다.

2.6) 및 2.7)의 절차에 분야의 전파를 설명하는 것은 (1) SKP 매체에 포함 된 영양소와 성장 인자는 각 영역 내의 모든 셀에 액세스 할 수 있습니다 (2) 사전을 사용 SKP 구 문화를 확장 할 수 있습니다.

우리의 세제곱에 따라 일반적으로 구 문화lture 조건은 3 개월 기간을 통해 성장하는 능력을 유지하고 3 - 4 시간 사이 계대 있습니다.

3. 줄기 세포 마커에 대한 면역 세포 화학

1. 구 문화는 하루에 16 21에 PBS에 수확된다. 문화는 5 분 1,000 rpm으로 펠렛입니다.
2. 분야는 PBS의 작은 볼륨 현탁되어 있습니다.
3. 현미경 슬라이드 (피셔 브랜드)에 직경 약 0.5 ㎛의 DAKO 펜으로 두 개의 원을 그립니다.
4. 원에 구 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
5. 각 드롭 분야의 존재를 광학 현미경으로 확인합니다.
6. 후드 방울 건조 시키십시오.
7. 어느 -80 ° C에서 슬라이드를 정지 또는 immunofluoresence 염색 프로토콜로 진행합니다.
8. 면역 염색에 대해, 10 분 -20 ° C에서 미리 냉각 메탄올 (100 %)로 슬라이드를 고정합니다.
9. PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
10. PBS/10 % 태아 소 혈청 / 0.02 % 트리톤의 X100과 함께 슬라이드를 차단최소 1 시간 동안.
11. PBS/10 % 4에서 2 상온에서 시간 또는 밤새 FBS ° C. : 버퍼를 차단에 희석 일차 항체 (예 : 안티 스틴, 안티 OCT4, 안티 TG30, 반대로 나노 항체, 표 3)를 품다
12. 차단 버퍼로 3 회 세척하고 실온에서 1 시간 동안 차 항체와 함께 배양한다.
13. PBS로 버퍼와 3 회를 차단로 3 번 씻으십시오.
14. Vectashield 장착 매체 (벡터 주식 회사)와 마운트 슬라이드.
15. 면역 형광 현미경으로 줄기 세포 마커의 발현에 대한 샘플을 분석합니다.

4. 줄기 세포 마커의 발현 수준의 실시간 PCR 분석

1. 21 일부터 18 약 2-3 ML 구 문화를 가져 가라.
2. 펠릿 5 분 동안 1,200 rpm에서 분야와 모든 매체를 대기음.
3. RNeasy Minikit (Qiagen의, 발렌시아, CA)를 사용하여 분야에서 RNA를 분리합니다.
4. 분광 아가로 오스 겔에 의해 RNA의 순도를 평가합니다.
5. 템플릿으로 전체 세포 RN​​A를 사용하여 (Omniscript의 역전사 효소 (Qiagen의)) cDNA를 합성.
6. 20 μL의 각 프라이머의 375 nm의 템플릿 50 NG의 농도 전원 SYBR 녹색 PCR Mastermix (적용되는 생물계)에있는 줄기 세포 마커 (표 1 참조)에 대한 실시간-PCR 이용하여 프라이머로 줄기 세포 마커를 검증 반응 볼륨입니다. GAPDH는 내생 컨트롤로 사용됩니다.
7. 증폭은 20 초 동안 5 초, 60 ° C에 대한 95 40주기에 따라 2.5 분 ° C에 대해 95에서 초기 변성 ° C를 사용하십시오.
8. 2 (ΔΔCT) 메서드를 ^8로 실행을 분석합니다.

5. 평활근 세포로 직접 분화

1. 하루 21 ~ 26 구체 SKP 배지에서 6 잘 배양 접시 (BD 팔콘)로 도금 하였다.
2. 세포는 72 시간 동안 SKP 매체 분야에서 준수하고 빨리 성장하는 것이 허용되었다.
3. 평활근 세포 (SMCS) differentiat이온은 5 % FBS, 10 NG / ML PDGF-BB (Invitrogen 사), 2.5 ML / NG TGF-B1 (Invitrogen 사)를 포함하는 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 배지 (Invitrogen 사)로 구성된 SMC 차별화 매체와 매체를 교체하여 시작 시작 .
4. 매체는 문화 3-4주의 기간 동안 갓 준비 SMC 분화 배지로 3 일마다 변경되었습니다.
5. SMC 마커에 대한 심사는 면역 조직 화학 염색으로 3으로 4 주 후에 시행 하였다.
6. 세포는 10 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액에 고정 하였다.
7. 세포를 PBS는 30 분 동안 0.3 % 트리톤 X-100을 함유 투과 하였다.
8. 세포는 실온에서 1 시간 및 추가가 같은 3.15) 3.12에 설명 된 처리)에 대한 αSMA (MO851, DAKO, 1:100) 또는 calponin (M3556, DAKO, 1:100)에 대한 항체와 함께 배양 하였다.

결과

우리는 우리가 최근 ^7보고 된 선택적으로 EGF와 FGF2으로 구성된 통제 성장 조건 하에서 SKP 분야를 생성하기 위해 확장 세포의 인구는 기본 피부 섬유 아세포 배양 (그림 1)에 존재하는 것을 보여줍니다.

일반적으로 세포 은행에서 제공하는 기본 섬유 아세포의 변종에 해당하는 PPD가 15 일부터 25 일까지 섬유 아세포 배양 본 연구에 사용 하였다. 이 방법에서...

토론

방법을 사용하여 여기에 설명, 순진 피부 줄기 세포는 기본 피부 섬유 아세포 배양에서 분리 할 수​​ 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 최근 희귀 유전 증후군, 허친슨 - 길 포드 조로증 증후군 ⁷ 명에서 유래 섬유 아세포 배양에서 성체 줄기 세포의 분리 및 특성을보고했다. 로 그 전구체 세포 표현 줄기 세포 마커 자기 갱신 할 수 있으며 (자세한 벤첼 등.에 의해 그림 4...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.