تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

Summary

الزرد هي نظام لنمذجة الاضطرابات الناشئة الإنسان من العضلات والهيكل العظمي. نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لعزل myofibers العضلات والهيكل العظمي من الزرد الجنينية واليرقات. هذه الطريقة تعطي عالية الكثافة إعداد ليف عضلي مناسبة لدراسة مورفولوجية واحد من الألياف العضلات والهيكل العظمي، والبروتين توطين التحت خلوية، وعلم وظائف الأعضاء العضلات.

Abstract

وقد ثبت الزرد أن يكون نظام نموذجا قيما لاستكشاف وظيفة العضلات والهيكل العظمي والعضلات لدراسة الأمراض البشرية. على الرغم من العديد من المزايا التي تقدمها في الجسم الحي تحليل الهيكل العظمي والعضلات في الزرد، تصور معقد ومنظم بدقة البروتين الوسط مسؤولة عن وظيفة العضلات، وخصوصا في الأجنة كله، يمكن أن يكون مشكلة. ينبع هذا عائق من صغر حجم العضلات والهيكل العظمي الزرد (60 ميكرون)، وحجم أصغر من قسيم عضلي. نحن هنا وصف وشرح طريقة بسيطة وسريعة لعزل myofibers الهيكل العظمي من الأجنة الزرد واليرقات. نحن تشمل أيضا البروتوكولات التي توضح تقنيات إعداد المنصب مفيدة لتحليل بنية العضلات وظيفة. على وجه التحديد، ونحن من التفصيل توطين immunocytochemical اللاحقة للبروتينات العضلات والهيكل العظمي والتحليل النوعي لإطلاق الكالسيوم عبر حفز التصوير الكالسيوم الخلية الحية. عموما، هذا الفيديوتنص المادة طريقة مباشرة إلى الأمام وكفاءة لعزل وتوصيف myofibers الهيكل العظمي الزرد، وهو الأسلوب الذي يوفر ممرا للدراسات اللاحقة لا تعد ولا تحصى من بنية العضلات وظيفة.

Introduction

العضلات والهيكل العظمي هو النسيج درجة عالية من التخصص مسؤولة عن توليد القوى مقلص اللازمة لحركية. يبدأ الانكماش من خلال عملية تعرف باسم الإثارة الانكماش (EC) اقتران الذي يحول الإشارات الكهربائية إلى إطلاق الكالسيوم من مخازن داخل الخلايا ^1،2. الافراج الكالسيوم داخل الخلايا ينشط قسيم عضلي لتقصير وتوليد القوة. والعديد من مكونات محددة من الآلات الجزيئية المسؤولة عن التوسط انتقال العصبية والعضلية تقاطع ^3، EC اقتران ^4،5، وأكتين-الميوسين تقلصات تعتمد ⁶ الاستمرار في أن تكون موضوع بحث مكثف الجارية. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد البروتينات التي استقرار غشاء العضلات خلال ^7،8 الانكماش والتي تتوسط بين إشارات ليف عضلي والمصفوفة خارج الخلية ^7،9 ودرس بقدر كبير من التفصيل.

الطفرات في عدد من الجينات الهامة للبنية العضلاتوقد تم تحديد وظيفة الثانية كأسباب للأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري ( http://www.musclegenetable.org/ ). هذه الأمراض، تصنيفها كما الاعتلالات العضلية الهيكلية وضمور العضلات على أساس الخصائص السريرية والنسيجية، وترتبط مع ضعف العضلات، والعجز مدى الحياة، ^و10،11 الوفيات المبكرة. وقد ثبت الزرد أن يكون نظاما غير المسددة لنمذجة ودراسة الأمراض العضلات والهيكل العظمي البشري ^8،12،13. واستخدمت ذلك للتحقق من صحة طفرات جينية جديدة ^8، وتحديد جوانب جديدة من الفيزيولوجيا المرضية المرض ^14،15، وتحديد النهج العلاجي الجديد ^15،16. قوة الزرد لدراسة مرض في العضلات الإنسان يتصل عدد كبير من النسل، والتطور السريع للبنية العضلات وظيفة، والوضوح البصري للجنين الزرد، وسهولة التلاعب الجيني والدوائية للحمار وحشي الناميةالأسماك ^17.

نحن وآخرون ^12،18،19 قد وضعت في الآونة الأخيرة تقنية بسيطة لعزل السريع والفعال للmyofibers من الزرد النامية. وقد مكنت هذه المنهجية في دراسة myofibers بتفصيل أكبر مما يمكن أن تقدمها تحليل الجنين كله. وقد تم استغلال هذه التقنية لتوصيف البروتين توطين التحت خلوية ²⁰ وكذلك لتحديد الخصائص النسيجية هامة كجزء من دراسات التحقق من الصحة في النماذج المطورة حديثا المرض ^21. علاوة على ذلك، يمكن بالإضافة إلى ذلك myofibers المعزولة أن تستخدم للتصوير الحي وللدراسات الكهربية ^22، التقنيات التي تسمح للاستجواب الجوانب الرئيسية من وظيفة العضلات. بروتوكول محددة لليف عضلي العزلة، جنبا إلى جنب مع اثنين من الأمثلة من التجارب التحليلية اللاحقة، هو مفصل في الأجزاء المتبقية من هذه المخطوطة.

Protocol

1. Coverslips إعداد بولي يسين المغلفة L-(الوقت: 1 ساعة)

coverslips طلاء يسمح لتسوية ليف عضلي السريع والتصاق. هذا يمكن أداؤها أثناء الخطوة تفكك العزلة ليف عضلي (الخطوة 2 أدناه).

1. قطع ووضع Parafilm على الجزء السفلي من 60 ملم طبق بتري (أي علامة تجارية).
2. وضع زلات غطاء زجاجي المجهر (12 مم) على Parafilm في 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة أو وضعها بشكل فردي في الآبار واحد من 24 لوحات جيدة.

ملاحظة 1: هذه coverslips جولة صغيرة تساعد على التركيز أرقام ليف عضلي والحد من استخدام الأجسام المضادة الزائدة.

ملاحظة 2: سوف coverslips غيرها من حجم العمل، ومع ذلك، فإن كميات الكواشف والأجنة المستخدمة هناك حاجة الى تعديلها وفقا لذلك.

3. ماصة 50-200 ميكرولتر من بولي-L-يسين حل (0.01٪) على كل غطاء زجاجي في طبق بتري.
4. السماح لل coverslips للجلوس واحد على الأقل حواور في 37 درجة مئوية. وسوف تعد حضانات لا تؤثر سلبا النتائج.
5. إزالة بولي-L يسين حل من غطاء زجاجي ويغسل مرتين مع حد أدنى من 100 برنامج تلفزيوني 1X ميكرولتر.
6. تسمح coverslips لتجف.
7. Coverslips هي الآن جاهزة للmyofibers.

ملاحظة 3: لضمان العقم، ويمكن أن يتم طلاء في غطاء وcoverslips على تعقيمها.

ملاحظة 4: حافظ على طبق بتري 60 ملم مع parafilm في القاع. سيتم استخدام هذا الإعداد أثناء ليف عضلي الطلاء وimmunolabeling (في وقت لاحق الخطوات).

البديل 1: بدلا من طلاء coverslips مباشرة قبل الاستخدام، ويمكن استخدام الأوراق المالية ساترة المغلفة. طبق بيتري 60 ملم تحتوي على ما لا يقل عن 2 مل بولي-L-يسين يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية تحتوي على العديد من coverslips. مع هذا البديل بدء في الخطوة 1.5 لمعالجة لل coverslips لmyofibers.

البديل 2: نحن أيضا coverslips معطف في بولي-L-الأورنيثين. Tله أكثر كثيفة العمالة، ولكن من المفيد للزراعة على المدى الطويل لأن coverslips المغلفة بولي-L-الأورنيثين يمكن أن يكون للأشعة فوق البنفسجية المعالجة. مع العلاج بالأشعة فوق البنفسجية وتقنية معقمة حذرا myofibers الحية يمكن عادة أن يستمر في الثقافة من 4-7 أيام.

2. تفكك الزرد الأجنة وتصفيح من Myofibers (الوقت: 1-3 ساعة)

ملاحظة: بروتوكول قياسي ينطبق أفضل ل3 DPF (الإخصاب أيام آخر) الأجنة.

1. نقل الأجنة الزرد إلى مستوى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي وإزالة الكثير من أسماك المياه الزائدة وقت ممكن. عادة، 10-20 الأجنة في أنبوب، وإن كان أقل يمكن استخدامها. باستخدام أكثر من 20-25 الأجنة في كثير من الأحيان يؤدي إلى إعداد الكثافة المفرطة.
   1. إزالة chorions قبل التفكك، يدويا باستخدام ملقط # 5. بدلا من ذلك، ويتحقق إزالة المشيماء الكيميائية مع 10-15 دقيقة Pronase العلاج. عادة، لا بد من إزالة السابقة من المشيمه فقط عند تأكيد مسبق من موتمطلوب النمط الظاهري النمل أو التشكل، أو عند استخدام مراحل حيث يتم فقس الأجنة بشكل طبيعي من المشيماء بهم.
2. إضافة 900 ميكرولتر من CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأجنة.
3. إضافة 100 ميكرولتر من نوع كولاجيناز الثاني والنهائي تركيز 3.125 ملغ / مل (حل الأسهم في كولاجيناز 31.25 ملغ / مل مخففة في برنامج تلفزيوني 1X) لبدء التفكك. ويمكن أيضا أن تستخدم كولاجيناز الرابع لتفارق.
4. تدوير الأجنة على شاكر المداري، ويسحن كل 30 دقيقة في RT باستخدام P1000 Pipetman للسحن.

ملاحظة 2: مراقبة الجنين بعناية التفكك؛ فوق أو تحت التفكك (وخاصة فوق) هي الأسباب الأكثر شيوعا لفشل البروتوكول. سوف تختلف مرات للهضم اعتمادا على شدة سحن، عدد الأجنة في الأنبوب، والعمر الأجنة. كما أنها غالبا ما تكون أقل (بالمقارنة مع أنواع البرية) لأجنة من المسوخ العضلات والهيكل العظمي.

مذكرة3: متوسط ​​زمن الهضم في سن الجنين: 1 DPF = 1 ساعة، 2 DPF = 1.5 ساعة، 3 DPF = 2 ساعة، و 4 DPF = 2-2.5 ساعة.

5. وقف الهضم عندما لا الأجنة كلها واضحة، ولكن القطع الصلبة لا تزال مرئية - وهذا أمر ضروري لمنع overdigestion.
6. أنابيب الطرد المركزي مع الأجنة فصلها في 0،8-2،3 x ج لمدة 3-5 دقيقة لخلايا بيليه.
7. إزالة طاف من الخلايا مكعبات وغسل 2X مع CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة.
8. إضافة جديدة CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة ل resuspend الخلايا. 1 عادة ما تستخدم لمحضرات مل من 10-20 الأجنة. يمكن تحجيم حجم يعتمد على عدد الأجنة.
9. باستخدام ماصة P1000، يمر الجنين تعليق من خلال مرشح 70 ميكرون. هذا يساعد على إزالة الحطام غير المرغوب فيها من الإعدادية.

ملاحظة 4: تعليق الأجنة يمكن أن تتم تصفيته للمرة الثانية خلال مرشح 40 ميكرون إلى مزيد من إزالة الحطام غير المرغوب فيها. من الترشيح المزدوج، والانتعاش هو approximately 800 ميكرولتر من حجم ابتداء من 1 مل.

10. إضافة حوالي 50-100 ميكرولتر من ليف عضلي التعليق على كل بولي-L-يسين المغلفة ساترة.

ملاحظة 5: نفذ الخطوة 2.9 في أطباق بتري مع parafilm على الجزء السفلي، الذي أعد سابقا. وParafilm تحافظ على تعليق ليف عضلي من يلوذ بالفرار لل coverslips المغلفة. الحفاظ على أطباق بتري مغطاة لمنع التبخر.

11. تسمح myofibers لتسوية ما يقرب من 1 ساعة على لل coverslips المغلفة في درجة حرارة الغرفة.

ملاحظة 6: ستبدأ Myofibers لتسوية في غضون 5-10 دقيقة. ومع ذلك، لمرفق ليف عضلي جيد، فمن المستحسن الحد الأدنى من 1 ساعة (1-2 ساعة). وسوف يسمح myofibers لتسوية لفترة أطول لا تضر الإعدادية. للحضانات أطول (بما في ذلك بين عشية وضحاها)، والمضادات الحيوية يمكن أن تضاف إلى وسائل الإعلام. مع المضادات الحيوية وتقنية معقمة الثقافات الحية يمكن عادة أن يستمر لمدة 1-2 أيام.

12. الحية مyofibers يمكن ملاحظتها عند هذه النقطة. Myofibers من أجنة DPF 2 وبعد ذلك سوف ينظر إليها على أنها خلايا مخططة وممدود (الشكل 1). عند هذه النقطة، myofibers هي الآن جاهزة للتحليل حية أو لimmunolabeling.

ملاحظة 7: العضلات الهيكلية من 1 DPF الأجنة لا لوحة ألياف كما ممدود ومخططة بشكل واضح. بدلا من ذلك، myoballs كبيرة مرئية. بالإضافة إلى ذلك، خلال آخر مرحلة التفكك التكوير (الخطوة 2.6)، 1 DPF بحاجة myoballs إلى أن طرد لمدة لا تقل عن 8 دقائق في 5،000 x ج لتحقيق بيليه. لتحليل الأجنة في هذه المرحلة، فمن المستحسن لاستخدام خط المعدلة وراثيا معربا عن EGFP تحديدا في العضلات والهيكل العظمي ^23. وهذا سوف يسمح تحديد الخلايا من أصل العضلات مقابل مصادر أخرى.

3. مضان المناعية من تنفصل الزرد Myofibers (الوقت: حوالي 1 اليوم)

3.1. Immunolabeling

1. إزالة جزء منوسائل الإعلام من myofibers انضمت إلى ساترة المغلفة
2. إصلاح الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ أو الميثانول. لمنهاج العمل، وإزالة ½ حجم وسائل الإعلام واستبدالها مع نفس الكمية من PFA. إصلاح لمدة 10 دقيقة في RT، ثم إزالة الحجم الإجمالي، مع استبدال 50-100 ميكرولتر من PFA، وإصلاح لمدة 10 دقيقة إضافية. يمكن لتثبيت الكحول، والميثانول الجليد الباردة أو الأسيتون تطبيقها في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو 5 دقائق، على التوالي.
3. غسل myofibers ما لا يقل عن 3-5X مع برنامج تلفزيوني 1X أو برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى 0.1٪ توين. متوسط ​​حجم غسل هو 50-100 ميكرولتر في ساترة.
4. إضافة إلى عرقلة الحل myofibers (الأسهم العمل)، واحتضان 20-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سوف عرقلة الحل تختلف اعتمادا على الأجسام المضادة الأولية والثانوية. وهما الأكثر شيوعا التي تستخدم في المختبر هي (1) برنامج تلفزيوني 1X، 2 ملغ / مل جيش صرب البوسنة، 1٪ مصل الأغنام، 0.25٪ تريتون X-100 والنهائي (2) 0.2٪ تريتون X-100، 2 ملغ / مل (0.2 ٪ BSA) و 5٪ مصل الأغنام / الماعز.
5. إزالة عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأولية مخففة في إما بتأمين حل أو برنامج تلفزيوني. احتضان myofibers بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد إما Parafilm أو التفاف ساران التفاف في طبق بتري تحتوي لل coverslips محملة ليف عضلي المغلفة مع الأجسام المضادة. يمكن إضافة قطع صغيرة من منشفة ورقية مبللة لإنشاء غرفة ترطيب.
6. إزالة الأجسام المضادة الأولية من coverslips وغسل coverslips 3-5X لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني أو حل حظر.
7. إضافة الأجسام المضادة الثانوية في التركيز المناسب مخففة في برنامج تلفزيوني 1X أو عرقلة الحل لمدة 1-2 ساعة على RT.
8. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل myofibers 3-5X في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق كل في RT.

3.2. coverslips تصاعد

9. تطبيق 1-2 قطرات من كاشف antifade إلى شريحة المجهر.
10. البيك اب بعناية ساترة المغلفة وimmunolabled باستخدام ملقط ومكان (myofibers أسفل) ساترة على كاشف antifade على شريحة المجهر.

ملاحظة 1: الانتباه إلى التوجه للجساترة oated أمر بالغ الأهمية.

11. وضع 1-2 Kimwipes على سطح صلب الثابت. عكس بسرعة الشريحة مع لل coverslips المغلفة يستريح على كاشف antifade ووضعه (ساترة لأسفل) على Kimwipes.
12. تطبيق الضغط الخفيف إلى زوايا الشريحة المجهر لإزالة antifade الزائدة وتشكيل ختم ضيق بين الشرائح وساترة
13. السماح للantifade المتبقية لتجف لمدة 5-10 دقائق على RT، ثم myofibers مستعدون للصورة (أرقام 2A وباء) أو تخزينها في 4 درجة مئوية.

4. خلية الحية التصوير الكالسيوم عن طريق GCaMP3

التجارب الخلية الحية لا يمكن أن يؤديها على myofibers قبل التثبيت (الخطوة التالية 2.10). يصف بروتوكول التالية التصوير الحي في التعبير عن myofibers GCaMP3 ^24، وهو مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا، التي أعرب عنها العضلات والهيكل العظمي محددة الزرد-α أكتين المروج (pSKM) ^23. بدلا من ذلك،هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام الأصباغ مؤشر الكالسيوم مثل FURA-2.

1. حقن الأجنة مع pSKM: GCaMP3 بناء في مرحلة 1-2 خلايا
2. في 3 DPF، وجمع اليرقات وإعداد myofibers كما هو موضح في المقاطع 1 و 2. تسمح myofibers الالتزام لمدة لا تقل عن 1 ساعة. لهذه التقنية، مطلوب إعداد coverslips في أطباق 24 أيضا.
3. إزالة بعناية أي وسائط الزائدة، وإضافة 300 ميكرولتر من الطازجة CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة في RT.
4. مراقبة الخلايا تحت مجهر مقلوب. وينبغي أن تكون إيجابية myofibers GCaMP3 مرئية تحت مضان أخضر.
5. إعداد الكاميرا للتسجيل، وإذا رغبت في ذلك.
6. يعد حل الكافيين 30 ملم في CO ₂ وسائل الإعلام المستقلة. لتحفيز الخلايا، ماصة بلطف 300 ميكرولتر من محلول مادة الكافيين في البئر تحت التكبير. في غضون 5-10 ثانية، ينبغي myofibers إيجابية GCaMP الرد على الكافيين مع الزيادة السريعة في مضان (الشكل 3). Myofibالمتطلبات البيئية قد تعاقد أيضا. من المذكرة، والكافيين يؤدي الى الافراج الكالسيوم من مخازن شبكية الهيولى العضلية ^25. غيرها من العوامل، مثل بوكل ²⁶ وryanodine ^4، ويمكن استخدامها لدراسة الافراج الكالسيوم محرض.

النتائج

immunolabeling الفلورسنت من myofibers (الشكل 2)

الصور تظهر نمط وضع العلامات الفلورية المتوقعة من myofibers immunostained بعد العزلة الناجحة والطلاء. وقد وصفت myofibers مع أي المضادة للمستقبلات ryanodine (1:100) (الشكل 2A) أو المضادة للα-actinin (1:...

Discussion

الزرد هي نظام نموذجي الفقاريات قوية لدراسة تنمية العضلات وظيفة في الجسم الحي ^25،27،28. ظهرت أنها أيضا رصيدا قيما لنمذجة أمراض العضلات البشرية ^{14،15،20،29.} بينما اتخذت خطوات كبيرة لتعزيز استخدام وتطبيق الزرد لدراسة وظيفة العضلات وأمراض العضلات، وهناك حاجة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750