从解离分析准备胚胎和幼体斑马鱼骨肌纤维

摘要

斑马鱼是用于模拟骨骼肌的人类疾病的一个新兴的系统。我们描述了一个快速，高效的方法从胚胎和幼虫的斑马鱼隔离骨骼肌肌纤维。这种方法产生了高密度的肌纤维制备适合的单骨骼肌纤维形态的研究中，蛋白质的亚细胞定位，以及肌肉生理学。

摘要

斑马鱼已被证明是一个有价值的模型系统研究骨骼肌功能和研究人类肌肉疾病。尽管通过体内分析骨骼肌在斑马鱼提供的，可视化的复杂和精细结构的蛋白质环境负责的肌肉功能，尤其是在整个胚胎中的诸多优点，可能会产生问题。这个障碍源于斑马鱼的骨骼肌（60微米）和肌节的甚至更小尺寸的小尺寸。在这里，我们描述和演示从斑马鱼胚胎和幼虫分离骨骼肌纤维的简单和快速的方法。我们还包括了协议，说明后期制备技术用于分析的肌肉结构和功能非常有用。具体来说，骨骼肌蛋白质我们详细介绍了随后的免疫细胞化学定位，并通过活细胞钙成像刺激钙释放的定性分析。总体来说，这款视频本文提供了斑马鱼的骨骼肌纤维的分离和表征，一种技术，它提供了一种导管，用于肌肉结构和功能的无数的后续研究的直向前和有效的方法。

引言

骨骼肌是负责生成所必需的蠕动收缩力高度专业化的组织。收缩是通过称为兴奋-收缩（欧共体）耦合，转换电信号从细胞内贮存^1,2钙释放的过程开始。细胞内钙释放激活的肌节缩短和产生力量。负责调解神经肌肉接头处传递^3，EC耦合^​​4,5，和肌动蛋白-肌球蛋白依赖性收缩⁶的分子机器的许多具体的组件继续深入研究的持续主题。此外，在收缩^7,8和介导的肌纤维和细胞外基质^7,9之间的信令稳定肌细胞膜蛋白已经确定，并研究了很详细。

在许多基因的肌肉结构的重要突变ND功能已被确定为人体骨骼肌肉疾病的原因（ http://www.musclegenetable.org/ ）。这些疾病，大致分类为基础的临床和病理特征骨骼肌肌病和肌营养不良症，都与肌肉无力，终身残疾，早期死亡率^10,11相关联。斑马鱼已被证明是用于建模和研究人类骨骼肌肉疾病^8,12,13一个优秀的系统。它已被用来验证新的基因突变^8，确定疾病的病理生理学^14,15的新内容，并找出新的治疗方法^15,16。斑马鱼研究人类肌肉疾病的功率涉及大量的后代，肌肉结构和功能，斑马鱼胚胎的光学透明度，并且易于显影斑纹的遗传药理学和操纵的快速发展的鱼^17。

我们和其他人^12,18,19最近开发出一种简单的技术为肌纤维来自发展中国家斑马鱼的快速，高效的隔离。这种方法使肌纤维的考试比可以通过全胚胎分析提供更多细节。该技术已被开发用于蛋白质亚细胞定位²⁰以及表征为重要病理特征为在新开发的疾病模型²¹的验证研究的一部分的识别。此外，孤立的肌纤维还可以用于实时成像和电生理研究^22，技术，允许对肌肉功能的关键方面的审讯。的特定协议为肌纤维隔离，随着后续的分析实验的两个例子，在该原稿的其余部分详细说明。

研究方案

1。聚-L-赖氨酸的制备涂层盖玻片（时间：1小时）

涂层盖玻片允许快速肌纤维的沉降和附着。这可能在肌纤维隔离（下面的步骤2）的解离步骤中进行。

1. 切割和封口膜放置在60毫米培养皿（任何品牌）的底部。
2. 放置显微镜盖玻璃卡瓦（12毫米直径）上的Parafilm在60mm组织培养皿或单独放置在单个井的24孔板中。

注1：这些小圆形盖玻片有助于集中肌纤维数量和减少多余抗体的使用。

注2：其他大小的盖玻片也行，不过，使用的试剂和胚胎的体积将需要进行相应的调整。

3. 移液器50-200微升的聚-L-赖氨酸上的每个玻璃盖在培养皿溶液（0.01％）。
4. 让盖玻片坐至少一个浩乌尔在37°C再孵育不会产生负面影响的结果。
5. 从玻璃盖除去聚-L-赖氨酸溶液中，用最少的100μl的1×PBS中洗两次。
6. 允许盖玻片干燥。
7. 盖玻片现在已经准备好为肌纤维。

注3：为了确保无菌，涂层可以在发动机罩和高压灭菌的盖玻片进行。

注4：保持底部60毫米培养皿用封口膜。这种设置将肌纤维电镀和免疫标记（后面的步骤）期间使用。

选择1：相反涂层盖玻片在使用前立即的，涂覆的盖玻片库存都可以使用。可以存储在包含众多盖玻片4℃含有至少2毫升聚L-赖氨酸60毫米培养皿。用这种替代从步骤1.5处理盖玻片肌纤维。

方案2：我们也聚-L-鸟氨酸大衣盖玻片。 Ŧ他是劳动密集型的，而且是用于较长期培养有用的，因为多聚-L-鸟氨酸涂布的盖玻片上可以是紫外线处理。用紫外线治疗和精心无菌技术活肌纤维通常可以维持在培养4-7天。

2。斑马鱼胚胎和电镀肌纤维（1至3小时的时间）的解离

注：标准协议适用最好3旦（天受精后）胚胎。

1. 转移斑马鱼胚胎成一个标准的1.5 ml离心管中，去除尽可能多的多余的鱼水之成为可能。通常情况下，每管10-20胚，虽然少都可以使用。使用超过20-25胚胎通常导致过度的制备密度。
   1. 删除之前解离绒毛膜，手动使用＃5镊子。另外，化学绒毛膜去除与一个10-15分钟链霉蛋白酶处理来实现。通常情况下，以前的去除绒毛膜只需要当MUT事先确认蚂蚁的表型或形态是必需的，或者使用阶段时，其中胚胎是自然地从他们的绒毛膜孵化。
2. 加入900微升的CO ₂的独立媒体，以含有胚胎的试管。
3. 加入100μl胶原酶II型，终浓度3.125毫克/毫升，开始解离（31.25毫克/毫升稀释在1×PBS中免胶原酶溶液）。 Ⅳ型胶原酶也可用于分离。
4. 旋转在轨道摇床胚胎，并使用P1000的Pipetman的研磨磨碎，每30分钟，在室温。

注2：仔细监测胚胎分离;过高或过低解离（尤其是以上）是协议失败的最常见原因。次消化将取决于研磨，每管胚胎数，和胚胎的年龄的强度而变化。它也往往较少（相比于野生型），用于从骨骼肌突变体胚胎。

注3：每胚龄平均消化时间：1 DPF = 1小时，2 DPF = 1.5小时，3 DPF = 2小时，4 DPF = 2-2.5小时。

5. 终止消化时，没有整个胚胎是可见的，但坚固件仍清晰可见- 这是必不可少的，以防止过 ​​量。
6. 离心管中，以离解的胚胎在0.8〜xg离心3-5分钟以沉淀细胞。
7. 从沉淀的细胞除去上清液，用CO ₂独立媒体洗2倍。
8. 加入新鲜的CO ₂独立媒体重悬细胞。 1毫升通常用于10-20胚胎的棉片。的体积可以根据胚胎数进行缩放。
9. 使用P1000的移液管，通过一个70微米的过滤器通过胚胎停牌。这有助于从预习中删除不需要的杂物。

注4：胚胎悬浮液进行过滤，第二次通过一个40微米的过滤器，以进一步去除不必要的杂物。从双重过滤，回收是逼近的ately 800微升从1毫升的起始体积。

10. 加约50-100微升肌纤维悬浮液的各聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。

注5：用封口膜底部执行在培养皿中的步骤2.9，先前准备的。该封口膜保持运行脱涂盖玻片的肌纤维悬浮液。保持覆盖，以防止水分蒸发的培养皿中。

11. 允许肌纤维沉降约1小时到涂覆的盖玻片在室温下。

注6：肌纤维将开始在5-10分钟解决。然而，良好的肌纤维附着，最低1小时（1-2小时）的建议。使肌纤维定居更长不会伤害准备。对于较长的孵育（包括过夜），抗生素可以被添加到该介质。用抗生素和无菌技术的活培养物通常可以维持1-2天。

12. 现场米yofibers可以在这一点上被观察到。从胚胎2旦肌纤维和以后将被看作是横纹肌和伸长的细胞（ 图1）。此时，肌纤维现在已经准备好现场分析或免疫标记。

注7：从1骨骼肌DPF胚胎不板作为拉长，并明确横纹肌纤维。相反，大myoballs是可见的。此外，丸粒化阶段后的解离过程中（步骤2.6），1旦myoballs要被离心的最低的8分钟，在5000×g离心来实现沉淀。胚胎在此阶段的分析，它是推荐使用表达EGFP特异性骨骼肌²³的转基因株系。这将允许鉴定细胞的肌肉起源与其他来源。

3。游离斑马鱼肌纤维的荧光免疫染色（时间：约1天）

3.1。免疫标记

1. 除去的部分从肌纤维粘附到涂覆的盖玻片媒体
2. 用4％多聚甲醛或甲醇固定细胞。对于PFA，取出半的媒体音量，更换有PFA的量相同。修正了在室温下10分钟，然后取出总量，取代50-100微升的PFA，并编定一个额外的10分钟。对于酒精固定，冰冷甲醇或丙酮可以在4℃，分别施加10分钟或5分钟。
3. 洗肌纤维至少3到5倍用1×PBS或1x PBS加0.1％吐温。一般洗涤量为每盖玻片50-100微升。
4. 加入封闭液，以肌纤维（股份合作），并孵育20-60分钟，在室温下。封闭液将根据第一和第二抗体而异。两种最常见的在实验室中使用的是（1）的1×PBS，2毫克/毫升牛血清白蛋白，1％绵羊血清，0.25％的Triton X-100的最终和（2）0.2％的Triton X-100，2毫克/毫升（0.2 ％BSA）和5％绵羊/山羊血清。
5. 除去封闭液，加入​​稀释为B一抗锁定的解决方案或PBS。过夜孵育肌纤维在4℃下请务必要么封口膜或包裹在保鲜膜含有涂有抗体的肌纤维装盖玻片的培养皿中。可以添加小件浸湿纸巾来创建一个加湿室。
6. 从盖玻片除去第一抗体和洗涤盖玻片3 - 5×5分钟，用PBS或阻断溶液。
7. 加入二抗，适当的浓度稀释在1×PBS或1-2小时在室温封闭液。
8. 去除二级抗体并在PBS中，每次5分钟，在室温洗肌纤维3〜5倍。

3.2。安装盖玻片

9. 适用于1-2滴抗淬灭剂对载玻片。
10. 使用镊子和地点（肌纤维向下）盖玻片上的载玻片的抗淬灭剂仔细回升的涂层和immunolabled盖玻片。

注1：注意到c的方向oated盖玻片是至关重要的。

11. 躺在1-2的Kimwipes在坚硬的固体表面。快速反转与涂盖玻片搁在抗淬灭剂的幻灯片，并将其放置（盖玻片下）上的Kimwipes。
12. 轻轻按压在显微镜幻灯片的角落，以除去多余的抗淬灭，并形成滑动和盖玻片之间的密封
13. 允许残留干燥在室温5-10分钟的抗淬灭，然后将肌纤维准备图像（ 图2A和B），或储存于4℃。

4。活细胞钙成像使用GCaMP3

活细胞的实验可以在肌纤维前固定（以下步骤2.10）来进行。以下协议描述了肌纤维表达GCaMP3 ^24，一种基因编码的钙指示剂，由骨骼肌特异性的斑马鱼α-肌动蛋白启动子^（pSKM）23表达的实时成像。另外，这种技术可以很容易地适合于使用钙指示剂染料如Fura-2的。

1. 注射胚胎pSKM：GCaMP3构建在1-2细胞期
2. 在3 DPF，收集幼虫和在第1和2中所述准备肌纤维。使肌纤维附着了至少1小时的。对于该技术中，在24孔培养皿中制备盖玻片是必需的。
3. 小心地取出多余的介质，并加入300微升新鲜的CO ₂的独立媒体在室温。
4. 观察在倒置显微镜下的细胞。 GCaMP3阳性肌纤维应根据绿色荧光可见。
5. 设置相机用于记录，如果需要的话。
6. 准备中的CO ₂独立媒体30毫米咖啡因的解决方案。为刺激细胞，轻轻吸取300微升的咖啡因溶液倒入井中下放大倍率。在5-10秒，GCaMP阳性肌纤维应该响应与咖啡因（ 图3），在荧光的快速增长。 MyofibERS也可能收缩。值得注意的是，咖啡因诱导的肌浆网卖场²⁵钙释放。其它试剂，如氯化钾²⁶和兰尼^4，可用于研究诱导的钙释放。

结果

肌纤维的荧光免疫染色（ 图2）

从显示预期的肌纤维荧光标记图形图像成功分离和电镀后免疫染色。在肌纤维已被标记为与抗兰尼碱受体（1:100）（ 图2A）或抗α-辅肌动蛋白（1:100）（ 图2B）的抗体，并分别揭示三联及Z带的免疫染色。用二抗的Alexa Fluor 555（1:500）。图像利用共聚焦显微镜拍摄的。

从肌纤维...

讨论

斑马鱼是研究体内 ^25,27,28肌肉发育和功能的有力脊椎动物模型系统。他们也成为一笔宝贵的财富用于模拟人类肌肉疾病^{14,15,20,29。}虽然大踏步已采取提前斑马鱼的肌肉功能和肌肉疾病的研究的使用和应用，有一个恒定的迫切需要开发工具，让更多的深入分析，赞美的遗传，形态，行为和功能优点斑马鱼已经提供^17。因此，我们已经适应，并开发了一个简单和强大的技...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750