解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

要約

ゼブラフィッシュは、骨格筋のヒト障害をモデル化するための新たなシステムである。私たちは、胚および幼虫のゼブラフィッシュから骨格筋筋線維を隔離するために迅速かつ効率的な方法が記載されている。この方法は、単一の骨格筋線維の形態、タンパク質の細胞内局在、および筋生理学の研究に適した高密度の線維調製物が得られる。

要約

ゼブラフィッシュは、骨格筋機能を探索するため、およびヒト筋疾患を研究するための貴重なモデル系であることが証明された。ゼブラフィッシュにおける骨格筋のin vivo解析によって提供される多くの利点にもかかわらず、特に全体の胚では、筋肉の機能を担う複雑かつ微細構造化タンパク質環境を可視化する、問題となる可能性がある。この障害は、ゼブラフィッシュの骨格筋（60ミクロン）のサイズが小さく、筋節のさらに小さいサイズに起因しています。ここでは、説明し、ゼブラフィッシュの胚および幼生から骨格筋線維を分離するための簡単​​かつ迅速な方法を示しています。また、筋肉の構造および機能を分析するための便利なポストの調製手法を例示するプロトコルを含む。具体的には、詳細骨格筋タンパク質のその後の免疫細胞化学的局在化および生細胞カルシウムイメージングを介して刺激されたカルシウム放出の定性分析。全体として、このビデオ記事では、ゼブラフィッシュの骨格筋線維の単離および特徴、筋肉の構造と機能の無数のその後の研究のための導管を提供して技術が素直で効率的な方法を提供する。

概要

骨格筋は運動性のために必要な収縮力を発生させるための責任高度に特殊化組織である。収縮は、細胞内貯蔵^1,2からのカルシウム放出に電気信号に変換興奮収縮（EC）のカップリングと呼ばれるプロセスを介して開始される。細胞内カルシウム放出は、力を短縮し、生成するサルコメアをアクティブにします。神経筋接合部の伝達^3、ECカップリング^4,5、およびアクチン-ミオシン依存性収縮^6の媒介に関与する分子機構の多くは、特定のコンポーネントには、熱心な研究の継続的な主題であり続ける。また、収縮^7,8および筋線維と細胞外マトリックスの^7,9の間のシグナリング、その仲介の間に筋肉の膜を安定させるタンパク質が同定されており、非常に詳細に研究した。

筋肉構造aの重要な多数の遺伝子における変異番目の関数は、（ヒト骨格筋疾患の原因として同定されているhttp://www.musclegenetable.org/ ）。臨床的および組織病 ​​理学的特徴に基づく骨格筋障害や筋ジストロフィーなど大きく分けて、これらの疾患は、筋力低下、生涯障害、早期死亡率^10,11に関連している。ゼブラフィッシュは、モデリングおよびヒト骨格筋疾患^8,12,13を研究するための優れたシステムであることが証明されている。それは、新たな遺伝子変異^8を検証する疾患病態生理学^14,15の新たな側面を定義し、新たな治療アプローチ^15,16を同定するために使用されている。ヒトの筋肉疾患を研究するためのゼブラフィッシュのパワーが仔多数の筋構造および機能の急速な発展は、ゼブラフィッシュ胚の光学的透明度、及び現像シマウマの遺伝的および薬理学的操作の容易さに関する魚^17。

私たちは、他の^12,18,19は最近開発ゼブラフィッシュからの筋線維の迅速かつ効率的に分離するための簡単な技術を開発した。この方法論は、全胚分析によって提供できるよりもより詳細に筋線維の検査を可能にした。技術は、タンパク質の細胞内局在²⁰の特徴付けだけでなく、新たに開発された疾患モデル²¹における検証研究の一環として、重要な組織病 ​​理学的特徴の識別に利用されてきた。さらに、孤立した筋線維は、さらにライブイメージング用および電気生理学的研究^22、筋肉機能の重要な側面の問い合わせを可能に技術を使用することができます。その後の分析的実験の2つの例と一緒に筋線維の分離のための特定のプロトコルは、この原稿の残りの部分で詳しく説明している。

プロトコル

1。ポリ-L-リジンコートしたカバーガラスの製造（時間：1時間）

コー​​ティングしたカバーは、急速な筋線維の沈降との密着性を可能にします。これは、筋線維アイソレーション（以下、工程2）の解離工程中に行ってもよい。

1. カットして60ミリメートルペトリ皿（どのブランド）の底にパラフィルムを配置します。
2. 60ミリメートルの組織培養皿にパラフィルム上の顕微鏡カバーガラススリップ（直径12mm）を配置し、24ウェルプレートの単一のウェルに個別に配置します。

注1：これらの小さな丸いカバースリップは、筋線維数を集中し、過剰な抗体の使用量を減らすのに役立つ。

注2：他のサイズのカバーグラスは動作しますが、使用した試薬および胚のボリュームは、それに応じて調整する必要があります。

3. ピペットシャーレ内の各カバーガラス上にポリ-L-リジン溶液（0.01％）の50〜200μL。
4. カバースリップは、少なくとも1のHO座ってできるように37℃でのUR長いインキュベーションは否定的な結果には影響しません。
5. カバーガラスからポリ-L-リジン溶液を除去し、100μlの1X PBS最小で二回洗う。
6. カバーグラスを乾燥させる。
7. カバースリップは今筋線維の準備ができている。

注3：無菌性を保証するために、コーティングはフード内でかつオートクレーブカバースリップ上で行うことができる。

注4：底にパラフィルムで60ミリメートルペトリ皿にしてください。このセットアップでは、筋線維のメッキと免疫標識（後の手順）中に使用されます。

代替案1：代わりに、使用直前にコーティングカバースリップを、コーティングされたカバースリップのストックを使用することができる。 2ミリリットルのポリ-L-リジンの最小値を含む60ミリメートルのペトリ皿は、多数のカバースリップを含有する4℃で保存することができる。この代替では筋線維のためのカバースリップを処理するためにステップ1.5から開始します。

代替2：私たちも、ポリ-L-オルニチンでのコートカバースリップ。 T彼は、より労働集約的であるが、ポリ-L-オルニチンでコーティングしたカバーガラスをUV処理することができるので、長期培養に有用である。 UV処理と慎重な無菌テクニックと一緒に暮らすの筋線維は、一般的に4-7日の培養で維持することができる。

2。筋線維のゼブラフィッシュ胚とメッキ（：1から3時間の時間）の解離

注：標準のプロトコルは3 DPF（日後受精）の胚に最善適用されます。

1. 標準1.5ミリリットル遠心管にゼブラフィッシュ胚を移し、可能な限り余分な魚の水を除去する。典型的には、より少ないけれどもチューブ当たり10〜20の胚を使用することができる。以上の20〜25の胚を使用すると、多くの場合、過剰な濃度の製剤が得られる。
   1. ＃5鉗子を使用して手動で、解離前絨毛膜を除去します。あるいは、化学的絨毛膜の除去は、10〜15分間プロナーゼ処理によって達成される。一般的に、絨毛膜の前の除去にのみ必要とされるときMUTの事前確認アリ表現型または形態が必要とされる、または段階を使用するときに胚を自然に絨毛膜から孵化される場合。
2. 胚を含むチューブに、CO ₂の独立したメディアの900を添加する。
3. 100コラゲナーゼタイプIIのμL、最終濃度3.125 mg / mlの解離を開始します（31.25ミリグラム/ 1X PBSで希釈したミリリットルの在庫コラゲナーゼ溶液）を追加します。コラゲナーゼIVはまた、解離のために使用することができる。
4. オービタルシェーカー上で胚を回転させ、チュレーション用P1000ピペットマンを使用して、室温で30分ごとに粉砕する。

注2：慎重に胚の解離を監視し、プロトコル障害の最も一般的な理由である以上、または解離の下（特に上で）。消化のための時間は粉砕、チューブあたり胚の数、および胚の時代の強さに応じて異なります。また、骨格筋の変異体からの胚（野生型に比較して）以下であることが多い。

ノート3：胚歳あたりの平均消化時間= 1時間1 DPF、2 DPF = 1.5時間、3 DPF = 2時間、および= 2-2.5時間4 DPF。

5. 何胚全体が表示されていない、まだ固体部分がまだ表示されているとき、消化を停止する- これは過剰消化を防ぐために不可欠です。
6. ペレット細胞に3〜5分間0.8から2.3 XGで解離胚と遠心管。
7. ペレット化した細胞からの上清を除去し、CO ₂の独立したメディアで2回洗う。
8. 細胞を再懸濁するため、新鮮なCO ₂の独立したメディアを追加します。 1mlの典型的に10〜20胚のプレップのために使用される。ボリュームは、胚番号に基づいてスケーリングすることができる。
9. P1000ピペットを用いて、70μmのフィルターを介して胚サスペンションを渡します。これは準備から不要な破片を除去するのに役立ちます。

注4：胚の懸濁液は、さらに不要な破片を除去するために40μmのフィルターを通して再度濾過することができる。二重ろ過から、回復がapproximです1ミリリットルの出発体積からately 800μL。

10. 各ポリ-L-リシン被覆カバーガラスに筋線維懸濁液の約50〜100μLを加える。

注5：底にパラフィルムでペトリ皿のステップ2.9を実行して、先に調製した。パラフィルムをコートしたカバーガラスをオフに実行しているから、筋線維のサスペンションを保持します。蒸発を防ぐためにカバーされたペトリ皿にしてください。

11. 筋線維は、室温でコーティングしたカバーガラス上に約1時間を決済することができます。

注6：筋線維は、5〜10分以内に安定し始めます。しかしながら、良好な筋線維結合のために、1時間（1〜2時間）の最小を推奨します。筋線維が長いために解決できるようにすると、準備に害を与えない。 （一晩を含む）より長いインキュベーションのために、抗生物質を培地に添加することができる。抗生物質や、無菌技術を用いて生きた培養は通常、1〜2日間維持することができる。

12. ライブMyofibersこの時点で観察することができる。胚2 DPFの筋繊維、後に横紋と細長い細胞（ 図1）として認識されます。この時点では、筋線維現在ライブ解析用または免疫標識の準備ができている。

注7：胚DPF 1からの骨格筋は、細長い明確横紋繊維プレートはありません。その代わりに、大規模なmyoballsが表示されます。また、ペレット化相ポスト解離（ステップ2.6）中に、1のdpf myoballsペレットを達成するために、5000×gで8分間遠心分離し、最低される必要がある。この段階で胚の解析のために、骨格筋²³で特異的にEGFPを発現するトランスジェニックラインを使用することをお勧めします。これは、他のソース対筋起源からの細胞の同定を可能にする。

3。解離ゼブラフィッシュ筋線維の蛍光免疫染色（時間：約1日）

3.1。免疫標識

1. の一部を除去コー​​ティングされたカバーガラスに付着した筋線維からメディア
2. 4％パラホルムアルデヒドやメタノールを用いて細胞を固定します。 PFAの場合は、メディアの容量½削除して、PFA、同量と交換してください。 、総ボリュームを削除し、PFAの50〜100μlで交換し、さらに10分間固定した後、室温で10分間固定してください。アルコール固定のために、氷冷メタノールまたはアセトンは、それぞれ、10分又は5分間、4℃で適用することができる。
3. 筋線維を少なくとも1×PBSまたは1x PBSで3-5X +0.1％のTweenを洗う。平均洗浄量は、カバースリップあたり50〜100μLです。
4. 筋線維を解決（作業ストック）をブロックに追加し、室温で20〜60分間インキュベートする。ブロッキング溶液は、一次および二次抗体によって異なります。実験室で使用される2つの最も一般的なものは、（1）1×PBS、2 mg / mlのBSA、1％ヒツジ血清、0.25％トリトンX-100を最終的なものであり、（2）0.2％トリトンX-100、2 mg / mlのである（0.2 ％のBSA）および5％ヒツジ/ヤギ血清。
5. ブロッキング溶液外し、Bのいずれかで希釈した一次抗体を追加溶液又はPBSをロックする。 4℃で一晩筋線維をインキュベートパラフィルムのいずれかにいることを確認し、または抗体でコーティングされた筋線維にロードされたカバースリップを含むペトリ皿をサランラップでラップします。湿らせたペーパータオルの小片を、加湿チャンバを作成するために添加することができる。
6. カバースリップからの一次抗体を除去し、PBSまたはブロッキング溶液で5分間カバーグラスを3-5Xを洗う。
7. 1X PBSまたはRTで1〜2時間ブロッキング溶液中に希釈した適切な濃度で二次抗体を加える。
8. 二次抗体を除去し、室温で5分間ずつ筋繊維PBS中の3-5Xを洗う。

3.2。マウントカバースリップ

9. 顕微鏡スライドに退色防止剤の1〜2滴を適用します。
10. 慎重にピックアップコーティングされたとimmunolabledカバーガラスをピンセットと場所（筋線維ダウン）を使用して、顕微鏡スライド上の退色防止剤にカバースリップを。

注1：Cの向きに注意oatedカバーガラスは非常に重要です。

11. 硬い固体表面上に1〜2キムワイプを置く。すぐに退色防止剤に載っコートしたカバーガラスとスライドを反転させ、キムワイプ上（下カバースリップ）に置きます。
12. 過剰退色を削除し、スライドとカバーガラスの間に緊密なシールを形成するために、顕微鏡スライドの隅に光の圧力を加える
13. 退色はRTで5〜10分間乾燥さ残りを許可し、筋線維は、画像（ 図2AおよびB）または4℃で保存する準備が整いました

4。 GCaMP3を使用した生細胞カルシウムイメージング

生きた細胞実験の前（ステップ2.10以下）に固定筋線維を行うことができる。次のプロトコルはGCaMP3 ^24、骨格筋の特定のゼブラフィッシュのα-アクチンプロモーター^（pSKM）23で表さ遺伝的にコード化されたカルシウム指示薬を発現する筋線維のライブイメージングを説明します。別の方法として、この技術は、容易にこのようなフラ-2カルシウムインジケーター色素を使用するように適合させることができる。

1. pSKMで胚を注入：GCaMP3は1〜2細胞期の構築
2. 3 DPFで、幼虫を収集し、セクション1と2で説明したように筋線維を準備。筋線維は、1時間の最低付着することができます。この技術については、24ウェル皿にカバーガラスを製造することが必要である。
3. 慎重に余分なメディアを取り出して、室温で新鮮なCO ₂の独立したメディアの300μlを加える。
4. 倒立顕微鏡で細胞を観察します。 GCaMP3正筋線維は、緑色の蛍光の下で表示されるはずです。
5. 必要に応じて、記録するためのカメラをセットアップします。
6. CO ₂の独立したメディアが30mmのカフェイン溶液を調製する。細胞を刺激するために、ゆっくりと拡大してウェルにカフェイン溶液を300μlをピペットで。 5月10日秒以内、GCaMP正筋線維は、蛍光の急激な増加（ 図3）とカフェインに反応する必要があります。 MyofibERSは、契約があります。注目すべきは、カフェインは、筋小胞体店²⁵からのカルシウム放出を誘導する。例えば^、26のKCl及びリアノジン⁴などの他の薬剤は、誘導性カルシウム放出を研究するために使用することができる。

結果

筋線維の蛍光免疫標識（ 図2）

筋線維から予想される蛍光標識パターンを示す画像が正常な分離とめっき後に免疫染色。筋線維は抗リアノジン受容体（1:100）（ 図2A）または抗α-アクチニン（1:100）（ 図2B）抗体のいずれかで標識し、それぞれトライアドとZ帯の免疫染色を明らかにしてきた。使用した二次抗体は、アレクサフ...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、 生体内で ^25,27,28 での筋肉の発達や機能を研究するための強力な脊椎動物のモデルシステムである。彼らはまた、人間の筋肉の病気^{14,15,20,29を}モデル化するための貴重な資産として浮上している。長足の進歩は、筋機能および筋肉疾患の研究のためにゼブラフィッシュを使用して、アプリケーションを進めるためにとられているが、遺伝的?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750