Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

Resumen

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Resumen

El pez cebra ha demostrado ser un sistema modelo valioso para la exploración de la función del músculo esquelético y para el estudio de enfermedades musculares humanas. A pesar de las muchas ventajas que ofrece el análisis in vivo de los músculos esqueléticos en el pez cebra, visualizando el complejo y finamente estructurada entorno proteína responsable de la función muscular, especialmente en los embriones en su conjunto, puede ser problemático. Este obstáculo se deriva del pequeño tamaño del músculo esquelético pez cebra (60 m) y el tamaño aún más pequeño del sarcómero. Aquí describimos y demostrar un método sencillo y rápido para el aislamiento de miofibras esqueléticas a partir de embriones de pez cebra y larvas. También se incluyen los protocolos que muestran técnicas de correos de preparación útiles para el análisis de la estructura y la función muscular. Concretamente, se detalla la localización inmunocitoquímica posterior de las proteínas del músculo esquelético y el análisis cualitativo de la liberación de calcio estimulado a través de imágenes de calcio de células vivas. En general, este videoartículo proporciona un método sencillo y eficiente para el aislamiento y caracterización de miofibras esqueléticas de pez cebra, una técnica que proporciona un conducto para estudios posteriores miríada de estructura y la función muscular.

Introducción

El músculo esquelético es un tejido altamente especializado responsable de generar las fuerzas contráctiles necesarias para la motilidad. La contracción se inicia a través de un proceso conocido como excitación-contracción (CE) de acoplamiento que convierte las señales eléctricas a la liberación de calcio desde las reservas intracelulares ^1,2. La liberación de calcio intracelular activa el sarcómero se acorte y generar fuerza. Los numerosos componentes específicos de la maquinaria molecular responsable de mediar la transmisión unión neuromuscular ^3, acoplamiento CE ^4,5, y la actina-miosina contracciones dependientes ⁶ continúan siendo objeto de una intensa investigación en curso. Además, las proteínas que estabilizan la membrana muscular durante ^7,8 contracción y que median la señalización entre la miofibras y la matriz extracelular ^7,9 se han identificado y estudiado en gran detalle.

Las mutaciones en un número de genes importantes para la estructura de un músculoND función se han identificado como causas de enfermedades del músculo esquelético humanos ( http://www.musclegenetable.org/ ). Estas enfermedades, que se clasifican en términos generales como miopatías esqueléticas y distrofias musculares basados ​​en las características clínicas e histopatológicas, se asocian a debilidad muscular, incapacidad permanente y ^10,11 mortalidad temprana. El pez cebra ha demostrado ser un sistema excelente para modelar y estudiar las enfermedades del músculo esquelético humanos ^8,12,13. Se ha empleado para validar nuevas mutaciones del gen ^8, definir nuevos aspectos de la fisiopatología de la enfermedad ^14,15, e identificar nuevos enfoques terapéuticos ^15,16. El poder del pez cebra para el estudio de la enfermedad de músculo humano se refiere a la gran cantidad de el rápido desarrollo de la estructura muscular y la función, la claridad óptica del embrión de pez cebra, y la facilidad de manipulación genética y farmacológica de la cebra el desarrollo de la descendencia,pescado ^17.

Nosotros y otros ^12,18,19 hemos desarrollado recientemente una técnica simple para el aislamiento rápido y eficiente de las miofibras del pez cebra en desarrollo. Esta metodología ha permitido el examen de las miofibras en mayor detalle que puede ser proporcionada por el análisis de embriones conjunto. La técnica se ha explotado para la caracterización de la proteína de localización subcelular ^20, así como para la identificación de importantes características histopatológicas como parte de los estudios de validación en modelos de enfermedad de nuevo desarrollo ^21. Además, las miofibras aisladas, además, se pueden usar para formación de imágenes en vivo y para los estudios electrofisiológicos ^22, técnicas que permiten la interrogación de los aspectos clave de la función muscular. El protocolo específico para el aislamiento de miofibras, junto con dos ejemplos de experimentos analíticos posteriores, se detalla en las partes restantes de este manuscrito.

Protocolo

1. Preparación de poli-L-lisina recubierto cubreobjetos (Tiempo: 1 hr)

Cubreobjetos de recubrimiento permite una rápida sedimentación de miofibras y adhesión. Esto se puede realizar durante la etapa de disociación del aislamiento de miofibras (paso 2 a continuación).

1. Cortar y colocar Parafilm en la parte inferior de una placa de 60 mm de Petri (de cualquier marca).
2. Coloca los resbalones de la cubierta de vidrio de microscopio (12 mm de diámetro) en Parafilm en un 60 mm placa de cultivo de tejidos o colocarlos individualmente en pocillos individuales de placas de 24 pocillos.

Nota 1: Estos pequeños cubreobjetos redondos ayudan a concentrarse miofibras números y reducir el uso de exceso de anticuerpo.

Nota 2: Otros cubreobjetos tamaño trabajarán, sin embargo, tendrán que ajustarse en consecuencia los volúmenes de los reactivos y de los embriones utilizados.

3. Pipeta de 50-200 l de solución de poli-L-lisina (0,01%) en cada vidrio de cubierta en la placa de Petri.
4. Deje que los portaobjetos para sentarse por lo menos una hour a 37 ° C. Incubaciones más largas no influirán negativamente en los resultados.
5. Retire la solución de poli-L-lisina de la cubierta de vidrio y se lava dos veces con un mínimo de 100 l de PBS 1x.
6. Permitir cubreobjetos se sequen.
7. Cubreobjetos ya están listos para las miofibrillas.

Nota 3: Para asegurar la esterilidad, de recubrimiento se puede hacer en una campana y en cubreobjetos tratados en autoclave.

Nota 4: Mantener el 60 mm placa de Petri con Parafilm en la parte inferior. Esta configuración se utilizará durante miofibra galvanoplastia y immunolabeling (posteriores pasos).

Alternativa 1: En lugar de cubreobjetos de revestimiento inmediatamente antes del uso, un cubreobjetos de papel estucado se puede utilizar. Un plato de 60 mm de Petri que contiene un mínimo de 2 ml de poli-L-lisina se puede almacenar a 4 ° C que contiene numerosos cubreobjetos. Con esta alternativa comience en el paso 1.5 para procesar los cubreobjetos de las miofibrillas.

Alternativa 2: También cubreobjetos capa de poli-L-ornitina. Tla suya es más mano de obra, pero es útil para el cultivo a largo plazo porque cubreobjetos recubiertos con poli-L-ornitina puede ser tratado UV. Con el tratamiento UV y una técnica estéril cuidado miofibras en vivo típicamente se pueden mantener en cultivo de 4-7 días.

2. Disociación de embriones de pez cebra y Plating de miofibras (Tiempo: 1 a 3 horas)

Nota: el protocolo estándar se aplica mejor a 3 dpf (días después de la fecundación) embriones.

1. Transferencia de embriones de pez cebra en un tubo de centrífuga de 1,5 ml estándar y eliminar la mayor cantidad de agua el exceso de pescado como sea posible. Por lo general, se pueden utilizar 10 a 20 embriones por tubo, aunque menos. El uso de más de 20-25 embriones a menudo resulta en una preparación de densidad excesiva.
   1. Eliminar chorions antes de la disociación, usando manualmente # 5 fórceps. Alternativamente, la eliminación corion química se consigue con un 10-15 min tratamiento con pronasa. Por lo general, sólo es necesaria la eliminación previa del corion cuando la confirmación previa de un mutSe requiere fenotipo hormiga o morfología, o cuando se utilizan etapas donde los embriones son, naturalmente, nacido de su corion.
2. Añadir 900 l de CO ₂ medios de comunicación independientes para el tubo que contiene los embriones.
3. Añadir 100 l de colagenasa de tipo II, una concentración final de 3,125 mg / ml (solución madre colagenasa a 31,25 mg / ml diluida en 1X PBS) para comenzar la disociación. La colagenasa IV también se puede utilizar para la disociación.
4. Girar embriones en un agitador orbital, y se tritura cada 30 min a temperatura ambiente usando un P1000 Pipetman para la trituración.

Nota 2: Es importante vigilar cuidadosamente la disociación de embriones; sobre o debajo de la disociación (sobre todo mayores) son las razones más comunes para el fracaso del protocolo. Los tiempos para la digestión pueden variar dependiendo de la intensidad de la trituración, el número de embriones por tubo, y la edad de los embriones. También es a menudo menos (en comparación con los tipos salvajes) para embriones de los mutantes del músculo esquelético.

Nota3: tiempo de digestión promedio por edad del embrión: 1 dpf = 1 hora, 2 dpf = 1,5 horas, 3 dpf = 2 h, y 4 dpf = 2-2,5 horas.

5. Detener la digestión cuando no hay embriones enteros son visibles, todavía trozos sólidos siguen siendo visibles - esto es esencial para prevenir overdigestion.
6. Tubos centrífuga con embriones disociadas a 0,8-2,3 g durante 3-5 minutos a las células de pellets.
7. Aspirar el sobrenadante de células sedimentadas y lavar 2 veces con CO ₂ medios de comunicación independientes.
8. Añadir CO fresco ₂ medios de comunicación independientes para volver a suspender las células. 1 ml se utiliza normalmente para preparaciones de 10-20 embriones. El volumen se puede escalar basada en el número de embriones.
9. Con una pipeta P1000, pasar la suspensión del embrión a través de un filtro de 70 micras. Esto ayuda a eliminar los residuos no deseados de la preparación.

Nota 4: suspensión de embriones se puede filtrar una segunda vez a través de un filtro de 40 micras para eliminar adicionalmente los desechos no deseados. A partir de una doble filtración, la recuperación es aproximadam ente 800 l de un volumen inicial de 1 ml.

10. Añadir aproximadamente 50-100 l de suspensión de miofibras a cada cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina.

Nota 5: Realice el paso 2.9 en las placas de Petri con Parafilm en la parte inferior, previamente preparado. El Parafilm mantiene la suspensión miofibra escurra los cubreobjetos recubiertos. Mantenga placas Petri cubiertas para evitar la evaporación.

11. Permitir miofibras se asienten aproximadamente 1 hr en los cubreobjetos recubiertos a temperatura ambiente.

Nota 6: miofibras comenzarán a instalarse dentro de 5-10 min. Sin embargo, para un buen agarre miofibra, se recomienda un mínimo de 1 hora (1-2 horas). Permitir que las miofibrillas se asienten durante más tiempo no dañará la preparación. Para incubaciones más largas (incluyendo durante la noche), los antibióticos pueden ser añadidos a los medios de comunicación. Con antibióticos y técnica estéril cultivos vivos normalmente se pueden mantener durante 1-2 días.

12. Vivo myofibers se puede observar en este punto. Miofibrillas de embriones 2 DPF y más tarde se verá como células estriadas y alargadas (Figura 1). En este punto, las miofibras ya están listas para análisis en vivo o para immunolabeling.

Nota 7: El músculo esquelético de 1 fdd embriones no platear fibras alargadas y claramente estriadas. En cambio, las grandes myoballs son visibles. Además, durante la fase de granulación mensaje de disociación (paso 2.6), 1 dpf myoballs necesitan ser centrifuga durante un mínimo de 8 minutos a 5000 xg para obtener un pellet. Para el análisis de los embriones en esta etapa, se recomienda utilizar la línea transgénica que expresa EGFP específicamente en el músculo esquelético ^23. Esto permitirá la identificación de las células de origen muscular en comparación con otras fuentes.

3. Fluorescencia inmunotinción de disociadas de pez cebra miofibras (Tiempo: aproximadamente 1 día)

3.1. Immunolabeling

1. Retire una parte demedios de miofibras adheridas a la cubreobjetos recubierto
2. Fijar las células utilizando paraformaldehído al 4% o metanol. Para PFA, retire ½ el volumen de los medios de comunicación y reemplazar con la misma cantidad de PFA. Fijar durante 10 minutos a temperatura ambiente, a continuación, extraiga el volumen total, reemplace con 50-100 l de PFA, y fijar, por una suma adicional de 10 min. Para la fijación de alcohol, metanol enfriado con hielo o acetona se puede aplicar a 4 º C durante 10 min o 5 min, respectivamente.
3. Lávese las miofibrillas al menos 3 a 5 veces con 1x PBS o 1x PBS más 0,1% de Tween. El volumen medio de lavado es de 50 a 100 l por cubreobjetos.
4. Añadir la solución de bloqueo a las miofibrillas (solución de trabajo) e incubar 20-60 minutos a temperatura ambiente. El bloqueo de solución variará dependiendo de los anticuerpos primarios y secundarios. Los dos más comunes utilizados en el laboratorio son (1) 1x PBS, 2 mg / ml de BSA, 1% de suero de ovejas, 0,25% de Triton X-100 final y (2) 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % de BSA) y 5% de suero de oveja / cabra.
5. Eliminar la solución de bloqueo y añadir anticuerpo primario diluido en cualquiera de bsolución de PBS o de bloqueo. Incubar miofibras la noche a 4 ° C. Asegúrese de que sea Parafilm o envuelva en Saran Wrap la placa de Petri que contiene los cubreobjetos miofibras cargada recubiertas con anticuerpos. Pequeños trozos de toalla de papel humedecida se pueden añadir para crear una cámara humidificada.
6. Eliminar el anticuerpo primario de cubreobjetos y lavar cubreobjetos 3-5x por 5 min con PBS o solución de bloqueo.
7. Añadir anticuerpo secundario a una concentración apropiada diluida en 1X PBS o solución de bloqueo durante 1-2 horas a TA.
8. Se quita el anticuerpo secundario y lavar miofibras 3-5x en PBS durante 5 min cada uno a temperatura ambiente.

3.2. Cubreobjetos de montaje

9. Aplicar 1-2 gotas de antifade reactivo a un portaobjetos de microscopio.
10. Pick-up con cuidado el cubreobjetos recubierto y immunolabled utilizando fórceps y lugar (miofibrillas hacia abajo) el cubreobjetos sobre la antifade reactivo en el portaobjetos de un microscopio.

Nota 1: La atención a la orientación de la ccubreobjetos oated es crítica.

11. Coloque 1-2 Kimwipes sobre una superficie sólida duro. Invertir rápidamente la diapositiva con los cubreobjetos recubiertos de descanso en la antifade reactivo y colocarlo (cubreobjetos hacia abajo) en la Kimwipes.
12. Aplique una leve presión sobre las esquinas del portaobjetos para retirar el exceso Antifade y formar un sello hermético entre el portaobjetos y cubreobjetos
13. Permitir la Antifade restante secar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente, y luego las fibras musculares están listos para la imagen (Figuras 2 A y B) o se almacenan a 4 ° C.

4. Celular en vivo Imagen de calcio Usando GCaMP3

Experimentos con células vivas pueden ser realizados en fibras musculares antes de la fijación (siguientes paso 2,10). El siguiente protocolo describe imágenes en vivo en miofibras que expresan GCaMP3 ^24, un indicador de calcio codificado genéticamente, expresado por el promotor pez cebra específica del músculo esquelético-α actina (pSKM) ^23. Alternativamente,esta técnica se puede adaptar fácilmente para utilizar colorantes indicadores de calcio tales como Fura-2.

1. Inyectar embriones con pSKM: GCaMP3 construir en la etapa de 1-2 células
2. A las 3 dpf, recoger larvas y preparar las miofibrillas como se describe en las secciones 1 y 2. Permitir miofibras que se adhieran durante un mínimo de 1 hora. Para esta técnica, se requiere la preparación de cubreobjetos en placas de 24 pocillos.
3. Retire con cuidado el exceso de medios de comunicación, y añadir 300 l de fresco CO ₂ medios de comunicación independientes a TA.
4. Observar las células bajo un microscopio invertido. Miofibras GCaMP3 positivos deben ser visibles bajo fluorescencia verde.
5. Preparar la cámara para la grabación, si se desea.
6. Prepare una solución de cafeína 30 mM en CO ₂ medios de comunicación independientes. Para estimular las células, pipetear suavemente 300 l de solución de cafeína en el pozo con una lupa. Dentro de 5-10 segundos, miofibras GCaMP positivos deben responder a la cafeína con un rápido aumento de la fluorescencia (Figura 3). Myofibres también pueden contraer. Es de destacar que la cafeína induce la liberación de calcio de los almacenes de retículo sarcoplásmico ^25. Otros agentes, como KCl ²⁶ y rianodina ^4, se pueden utilizar para estudiar la liberación de calcio inducible.

Resultados

Inmunomarcaje fluorescente de miofibras (Figura 2)

Las imágenes que muestra un patrón marcado fluorescente que se espera de las miofibrillas inmunotiñeron después del aislamiento y de las planchas de éxito. Las fibras musculares se han etiquetado con cualquier anti-receptor de rianodina (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticuerpos, y revelar la inmunotinción de la tríada y la banda Z, respectivamente...

Discusión

El pez cebra es un modelo de sistema de vertebrados de gran alcance para el estudio de desarrollo de los músculos y la función en vivo ^25,27,28. Ellos también se han convertido en un activo valioso para el modelado de enfermedades musculares humanas ^14,15,20,29. Aunque se han dado grandes pasos para avanzar en el uso y aplicación de pez cebra para el estudio de la función muscular y la enfermedad del músculo, hay una necesidad crítica constante para desarrollar herramientas que perm...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750