Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

Özet

Zebra balığı iskelet kası bozuklukları insan modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Biz embriyonik ve larva zebrafish iskelet kası myofibers izole etmek için hızlı ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek bir iskelet kas lifi morfolojisi çalışma için uygun olan yüksek yoğunluklu miyofiberde oluşan hazırlama, protein hücre içi lokalizasyonu ve kas fizyolojisi verir.

Özet

Zebra balığı iskelet kası fonksiyonunu keşfetmek için ve insan kas hastalıklarının araştırılmasında değerli bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle bütün embriyolar, kas fonksiyonu için sorumlu karmaşık ve ince yapılı protein ortam görselleştirme, Zebra balığı iskelet kasının in vivo analizi tarafından sunulan birçok avantajlara rağmen, sorunlu olabilir. Bu engel Zebrafish iskelet kası (60 mikron) ve sarkomerinde daha küçük boyutu küçük boyutu kaynaklanmaktadır. Burada tarif ve zebra balığı embriyolar ve larva iskelet myofibers izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz de kas yapısını ve fonksiyonunu analiz için yararlıdır sonrası hazırlama tekniklerini göstermek protokollerini içerir. Özellikle, biz detay iskelet kas proteinlerinin sonraki immünositokimyasal yerelleştirme ve canlı hücre kalsiyum görüntüleme yoluyla uyarılan kalsiyum sürümü kalitatif analizi. Genel olarak, bu videozebra balığı madde iskelet myofibers izolasyonu ve karakterizasyonu, kas yapısı ve fonksiyonu, sayısız sonraki çalışmalar için bir oluk sağlayan bir teknik için, doğrudan ve etkili bir yöntem sağlar.

Giriş

İskelet kası motilite için gerekli kasılma kuvvetleri üreten sorumlu son derece özel bir dokudur. Daralma içi mağazalardan ^1,2 kalsiyum serbest elektrik sinyalleri dönüştüren eksitasyon-kasılma (EC) bağlantı olarak bilinen bir süreç yoluyla başlatılır. Hücre içi kalsiyum bırakma kuvvetinin kısaltmak ve oluşturmak için sarkomerinde geçirir. Nöromüsküler kavşak iletimi ^3, AK kaplin ^4,5 ve aktin-miyozin bağımlı kasılmalar ⁶ aracılık sorumlu moleküler makinelerin çok özel bileşenler yoğun araştırma devam eden konu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, daralma ^7,8 ve miyofiberde oluşan ve hücre-dışı matris ^7,9 arasında sinyal olduğu mediate sırasında kas membranı stabilize proteini, tespit edilmiştir ve ayrıntılı olarak incelenmiştir.

Kas yapısı a için önemli olan bir dizi genlerde mutasyonlarnd fonksiyonu (insan iskelet kası hastalıklarının nedeni olarak tanımlanmıştır http://www.musclegenetable.org/ ). Klinik ve histopatolojik özelliklere dayanarak iskelet miyopatilerde ve kas distrofilerinde gibi genel olarak sınıflandırılabilir Bu hastalıklar, kas güçsüzlüğü, yaşam boyu sakatlık ve erken mortalite ^10,11 ile ilişkilidir. Zebra balığı insan iskelet kası hastalıkları ^8,12,13 modelleme ve eğitim için olağanüstü bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Bu, yeni gen mutasyonları ⁸ doğrulamak hastalığın patofizyolojisi ^14,15 yeni yönlerini tanımlamak ve yeni tedavi yaklaşımları ^15,16 tanımlamak için istihdam edilmiştir. Insan kas hastalığı incelemek için Zebra balığı gücü yavrular, kas yapısı ve fonksiyonu, Zebra balığı embriyo optik netlik ve gelişmekte olan zebra genetik ve farmakolojik manipülasyon kolaylığı hızlı gelişme çok sayıda ilgilidirbalık ^17.

Biz ve diğerleri ^12,18,19 son zamanlarda gelişen zebrafish myofibers hızlı ve verimli izolasyonu için basit bir teknik geliştirdik. Bu yöntem, tüm embriyo analiz edilmesi için daha fazla ayrıntılı olarak myofibers incelenmesini sağladı. Bu teknik, yeni geliştirilmiş hastalık modellerinde ²¹ doğrulama çalışmalarının bir kısmı olarak önemli histopatolojik özelliklerinin tanımlanması için protein alt hücresel lokalizasyonu ²⁰ hem de karakterizasyonu için istifade edilmiştir. Ayrıca, izole myofibers ayrıca canlı görüntüleme ve elektrofizyolojik çalışmalar ^22, kas fonksiyonlarının temel yönleri sorgulama için izin teknikleri kullanılabilir. Sonraki analitik deneyler iki örnekleriyle birlikte miyofiberde oluşan izolasyon için özel bir protokol, bu yazının geri kalan bölümlerinde ayrıntılı.

Protokol

1.. Poli-L-Lizin hazırlanması kaplı kapak (Süre: 1 saat)

Kaplama lamelleri hızlı miyofiberde oluşan çökmesi ve yapışma sağlar. Bu miyofiberde oluşan izolasyonu (Adım 2) 'in ayrışma aşaması esnasında gerçekleştirilebilir.

1. Kesme ve bir 60 mm Petri kabı (herhangi bir marka) altındaki Parafilm yerleştirin.
2. Bir 60 mm doku kültürü çanağı içinde Parafilm mikroskop kapak camı fişleri (12 mm çapında) yerleştirilir ya da 24 oyuklu plakalar, tekli oyuklar içerisinde tek tek yerleştirin.

Not 1: Bu küçük yuvarlak lamelleri miyofiberde oluşan sayılar konsantre ve aşırı antikor kullanımını azaltmaya yardımcı olur.

Not 2: Diğer boyutu lamelleri çalışacaktır ancak, kullanılan reaktif ve embriyoların hacimleri buna göre ayarlanması gerekir.

3. Pipet Petri kabındaki her bir kapak camı ile ilgili poli-L-lizin çözeltisi (% 0.01) 50-200 ul.
4. Lamelleri en az bir ho oturmak için izin37 ° C'de ur Uzun inkubasyon olumsuz sonuçlarını etkilemeyecektir.
5. Kapak cam, poli-L-lisin çözüm çıkarın ve 100 ul 1 x PBS, en az iki kez yıkayın.
6. Lamelleri kurumasını bekleyin.
7. Lameller şimdi myofibers için hazırız.

Not 3: sterilite sağlamak için, kaplama, bir başlık ve otoklav lamelleri yapılabilir.

Not 4: alt Parafilm ile 60 mm Petri kabı tutun. Bu kurulum miyofiberde oluşan kaplama ve immunolabeling (daha sonra adım) sırasında kullanılan olacaktır.

Alternatif 1: Bunun yerine, kullanımdan hemen önce kaplama lamelleri, kaplanmış bir lamel stok kullanılabilir. 2 ml poli-L-lizin ihtiva eden en az bir 60 mm Petri kabı, çok sayıda lamelleri içeren 4 ° C'de saklanabilir. Bu alternatif ile myofibers için lamelleri işlem aşamasında 1,5 başlar.

Alternatif 2: Ayrıca, poli-L-omitin kat lamelleri. Tonun daha yoğun emek olmakla birlikte, poli-L-ornitin kaplı lamelleri UV muamele edilmiş olabilir, çünkü daha uzun süreli kültür için yararlıdır. UV tedavisi ve dikkatli steril tekniği ile canlı myofibers genellikle 4-7 gün kültür içinde muhafaza edilebilir.

2. Myofibers Zebra balığı Embriyolar ve Kaplama (: 1 ila 3 saat Süresi) Ayrışma

Not: standart protokol 3 dpf'e (gün sonrası fertilizasyon) embriyolar için en iyi geçerlidir.

1. Standart bir 1.5 ml santrifüj tüpüne zebra balığı embriyo transferi ve mümkün olduğu kadar fazla balık suyu çıkarmak. Tipik olarak, daha az olsa da tüp başına 10-20 embriyo, kullanılabilir. Birden fazla 20-25 embriyo kullanılması genellikle aşırı bir yoğunluk hazırlanması ile sonuçlanır.
   1. Elle 5 forseps # kullanarak, önce disosiyasyonundan chorions çıkarın. Seçenek olarak ise, kimyasal koryon kaldırma 10-15 dakika Pronaz tedavisi ile elde edilir. Tipik olarak, koryon önceki kaldırma sadece gerektiğinde bir mut önceden onaykarınca fenotip veya morfoloji gereklidir, ya da aşamaları kullanırken embriyolar doğal koryon yumurtadan nerede.
2. Embriyoları içeren tüp CO ₂ bağımsız medya 900 ul ekleyin.
3. 100 kollajenaz tip II ul, nihai konsantrasyonu 3.125 mg / ml ayrışmasını başlatmak için (31.25 mg / 1x PBS içinde seyreltilmiş ml Stock at kolajenaz solüsyon) eklenir. Kollajenaz IV, aynı zamanda ayrılması için de kullanılabilir.
4. Orbital bir karıştırıcı üzerinde embriyolar döndürün ve toz haline getirme için bir P1000 Pipetman kullanılarak oda sıcaklığında 30 dakika çiğnemek.

Not 2: Dikkatle embriyo ayrışmayı izlemek; (özellikle over) üzerinden veya ayrışma altında protokol başarısızlığın en yaygın nedenleri vardır. Sindirim için Times toz haline getirme, tüp başına embriyo sayısı ve embriyo yaşı yoğunluğuna bağlı olarak değişecektir. Ayrıca kas iskelet mutantlardan embriyolar için (doğal tür ile karşılaştırıldığında), genellikle daha azdır.

Not3: embriyo yaş Ortalama sindirim süresi: = 1 saat 1 dpf, 2 dpf'e = 1.5 saat, 3 dpf'e = 2 hr ve = 2-2.5 saat 4 dpflik.

5. Hayır bütün embriyolar görünür, ama sağlam parçaları hala görünür olduğunda sindirim Dur - Bu Overdigestion önlemek için şarttır.
6. Pelet hücrelere 3-5 dakika boyunca 0,8-2,3 xg'de ayrışmış embriyolar ile santrifüj tüpleri.
7. Peletleşmiş hücrelerden süpernatant kaldırmak ve CO ₂ bağımsız medya ile 2x yıkayın.
8. Hücrelerin tekrar süspansiyon taze CO ₂ bağımsız medya ekleyebilirsiniz. 1 ml tipik haliyle, 10-20 embriyo preparatlarıyla için kullanılır. Hacmi embriyo sayısına göre ölçeklenebilir.
9. P1000 bir pipet kullanarak, 70 um'lik bir filtreden embriyo süspansiyon geçmektedir. Bu hazırlık istenmeyen enkaz kaldırmak yardımcı olur.

Not 4: Embriyo Süspansiyon istenmeyen birikintileri temizlemek için bir 40 um'lik bir filtreden bir kez daha filtre edilebilir. Bir çift filtrasyon, kurtarma approxim olduğunu1 ml 'lik bir başlangıç ​​hacminden rilmesi 800 ul.

10. Her bir poli-L-lizin kaplı lamel miyofiberde oluşan süspansiyonu yaklaşık 50-100 ul ekleyin.

Not 5: alt Parafilm ile Petri tabaklarında adım 2.9 yapın, önceden hazırlanmış. Parafilm kaplı lamelleri akıp miyofiberde oluşan süspansiyon tutar. Buharlaşmasını önlemek için kapalı Petri yemekleri tutun.

11. Myofibers oda sıcaklığında kaplanan kapak slipleri üzerine, yaklaşık 1 saat yerleşmeye izin verin.

Not 6: myofibers 5-10 dakika içinde yerleşmeye başlayacak. Ancak, iyi miyofiberde oluşan bağlanması için, 1 saat (1-2 saat) bir minimum tavsiye edilir. Myofibers uzun yerleşmek için izin hazırlık zarar vermez. (Gece ​​boyunca dahil) daha uzun inkubasyon için, antibiyotikler ortama ilave edilebilir. Antibiyotik ve steril tekniği ile canlı kültürler genellikle 1-2 gün süreyle muhafaza edilebilir.

12. Canlı myofibers bu noktada görülmektedir. Embriyolar 2 dpf den myofibers ve daha sonra çizgili ve uzunlamasına hücreleri (Şekil 1) olarak görülecektir. Bu noktada, myofibers şimdi canlı analiz veya immunolabeling için hazırız.

Not 7: embriyolardan dpf'e 1'den İskelet kası gibi uzun ve açıkça çizgili lifleri plaka değil. Bunun yerine, büyük myoballs görebilir. Buna ek olarak, peletleme sonrası faz ayrışması sırasında myoballs bir pelet elde etmek için 5000 x g'de 8 dakika boyunca santrifüje tabi az olması gerekir 1 dpf (2.6 adım). Bu aşamada embriyolar analizi için, bu özellikle iskelet kası ²³ EGFP ifade eden transgenik hat kullanmak tavsiye edilir. Bu, diğer kaynaklardan karşı kas kökenli hücrelerin tanımlanmasına izin verir.

3. Disosiye Zebra balığı myofibers floresan İmmünoboyama (Saat: yaklaşık 1 gün)

3.1. Immunolabeling

1. Bir kısmını çıkarmakkaplanmış lamel yapışık myofibers medya
2. % 4 paraformaldehit ya da metanol kullanılarak, hücreler. PFA için, medya hacmi ½ kaldırmak ve PFA aynı miktarda değiştirin. , Tüm hacim kaldırmak, daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca saptamak PFA 50-100 ul ile değiştirin ve ek bir 10 dakika boyunca düzeltin. Alkol tespiti, buzla soğutulmuş metanol ya da aseton için, sırasıyla, 10 dakika ya da 5 dakika boyunca 4 ° C 'de uygulanabilir.
3. Myofibers en az 1 adet 1 x PBS ya da PBS ile 3-5x artı% 0.1 TWEEN yıkayın. Ortalama yıkama hacmi lamel ortalama 50-100 ul.
4. Myofibers solüsyonu (stokları çalışma) bloke edin ve oda sıcaklığında 20-60 dakika kuluçkalayın. Bloke edici çözelti, birincil ve ikincil antikorlar bağlı olarak değişecektir. Laboratuarda kullanılan en yaygın iki (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA,% 1 serum koyun,% 0.25 Triton X-100, kesin ve (2)% 0.2 Triton X-100, 2 mg / ml (0.2 olan % BSA) ve% 5 koyun / keçi serumu.
5. Çözümü engelleme çıkarın ve b ya seyreltilmiş primer antikor ekleyinçözeltisi ya da PBS kilitleme. 4 ° C de bir gece inkübe myofibers Parafilm ya emin olun veya antikor ile kaplanmış miyofiberde oluşan yüklü lamelleri içeren Petri şal saran sarın. Nemli bir kağıt havlu küçük parçalar nemlendirilmiş odası oluşturmak için ilave edilebilir.
6. Lamelleri primer antikor çıkarın ve 5 dakika PBS ile veya engelleme çözümü için lamelleri 3-5x yıkayın.
7. 1x PBS ya da oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun konsantrasyonda ikincil antikor ekleyin.
8. İkinci antikorunu çıkarın ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika boyunca PBS içinde myofibers 3-5x yıkayın.

3.2. Montaj lamelleri

9. Bir mikroskop lamı antifade ayıracı 1-2 damla uygulayın.
10. Dikkatle pick-up kaplamalı ve immunolabled lamel mikroskop lamı üzerine antifade reaktif üzerinde lamel (myofibers aşağı) forseps ve yer kullanarak.

C yönüne Dikkat: Not 1oated lamel kritiktir.

11. Sert ve katı bir yüzeye 1-2 Kimwipes yatıyordu. Çabuk antifade reaktif üzerinde oturan kaplı lamelleri ile slayt ters ve Kimwipes (aşağı lamel) yerleştirin.
12. Aşırı antifade kaldırmak ve slayt ve lamel arasında sıkı bir mühür formu mikroskop lamı köşelerine hafif bir basınç uygulayın
13. , Oda sıcaklığında 5-10 dakika için kurumaya kalan antifade ardından myofibers 4 ° C 'de (Şekil 2A ve B) veya imajı hazır izin ver

4. GCaMP3 kullanarak canlı hücre Kalsiyum Görüntüleme

Canlı hücre deneyleri (adım 2.10 aşağıdaki gibi) önceden tespit etmek myofibers yapılabilir. Aşağıdaki protokol GCaMP3 ^24, iskelet kası, belirli zebra balığı α-aktin promoteri (pSKM) ²³ ile ifade edilen bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi, ifade myofibers canlı görüntüleme açıklar. Seçenek olarak,Bu teknik hali hazırda bu tür Fura-2 kalsiyum göstergesi boyalar kullanmak için adapte edilebilir.

1. PSKM ile embriyolar enjekte: GCaMP3 1-2 hücreli aşamada inşa
2. 3 dpf, larvaları toplamak ve bölümler 1 ve 2 de tarif edildiği gibi myofibers hazırlar. Myofibers 1 saat arasında, en az yapışmaya izin verin. Bu teknik için, 24 oyuklu tabaklarda lamelleri hazırlanması gereklidir.
3. Dikkatle fazla ortamı çıkartın ve oda sıcaklığında taze CO ₂ bağımsız medya 300 ul ekleyin.
4. Bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. GCaMP3 olumlu myofibers yeşil floresan altında görünür olmalıdır.
5. Istenirse, kayıt için kamerayı ayarlayın.
6. CO ₂ bağımsız medya 30 mM kafein çözeltisi hazırlayın. Hücreleri uyarmak için, yavaşça büyütme altında kuyuya kafein çözeltisi 300 ul pipet. 5-10 sn içinde, GCaMP olumlu myofibers floresan hızlı bir artış (Şekil 3) ile kafein yanıt vermelidir. Myofibers da sözleşme olabilir. Notun, kafein sarkoplazmik retikulum mağazalardan ²⁵ kalsiyum salınımını uyarır. Bu tür KCl ²⁶ ve riyanodin ⁴ gibi diğer maddeler, uyarılabilir kalsiyum serbest incelemek için kullanılabilir.

Sonuçlar

Myofibers floresan immün (Şekil 2)

Myofibers beklenen floresan etiketleme modelini gösteren resimler başarılı izole edilmesi ve sonra kaplama immunohistokimyasal. Myofibers anti-riyanodin reseptörü (1:100) (Şekil 2A) ya da anti-α-aktinin (1:100) (Şekil 2B) ya da antikorları ile etiketlenmiş ve sırasıyla üçlü ve Z-bandın immün ortaya edilmiştir. Kullanılan ikincil antikorlar, Alexa Fluor 555 (1:500) idi. Görün...

Tartışmalar

Zebra balığı vivo ^25,27,28 kas gelişimi ve işlevi çalışmak için güçlü bir omurgalı model sistem. Onlar da insan kas hastalıkları ^14,15,20,29 modelleme için değerli bir varlık olarak ortaya çıkmıştır. Büyük atılımlar kas fonksiyonu ve kas hastalığı çalışma için zebrafish uygulanmasını ve kullanımını geliştirmek için alınmış olsa da, davranışsal ve fonksiyonel genetik, morfolojik, övgü daha derinlemesine analiz sağlayacak araçları g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750