Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

Riepilogo

Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.

Abstract

Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema valido modello per esplorare la funzione del muscolo scheletrico e per lo studio delle malattie muscolari umane. Nonostante i numerosi vantaggi offerti da analisi in vivo del muscolo scheletrico nel zebrafish, visualizzando l'ambiente proteina complesso e finemente strutturato responsabile per la funzione muscolare, soprattutto in embrioni interi, può essere problematico. Questo ostacolo deriva dalla piccola dimensione del muscolo scheletrico zebrafish (60 micron) e le dimensioni ancora più piccolo del sarcomero. Qui descriviamo e dimostrare un metodo semplice e rapido per isolare miofibre scheletriche da embrioni di zebrafish e larve. Abbiamo anche i protocolli che illustrano le tecniche di preparazione post utili per analizzare la struttura e la funzione muscolare. In particolare, abbiamo dettaglio la successiva localizzazione immunocitochimica delle proteine ​​dei muscoli scheletrici e l'analisi qualitativa del rilascio del calcio stimolato via live Calcio Imaging cellulare. Nel complesso, questo videoarticolo fornisce un metodo straight-forward ed efficace per l'isolamento e la caratterizzazione di miofibre scheletriche zebrafish, una tecnica che prevede un condotto per la miriade di successivi studi di struttura e funzione muscolare.

Introduzione

Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente specializzato responsabile della generazione delle forze necessarie motilità contrattili. La contrazione è iniziata attraverso un processo noto come eccitazione-contrazione (EC) di accoppiamento che converte i segnali elettrici di rilascio di calcio dai depositi intracellulari ^1,2. Rilascio di calcio intracellulare attiva il sarcomero di accorciare e generare forza. I numerosi componenti specifici della macchina molecolare responsabile mediare la trasmissione neuromuscolare svincolo ^3, accoppiamento EC ^4,5, e actina-miosina contrazioni dipendenti ⁶ continuano ad essere oggetto continuo di intensa ricerca. Inoltre, le proteine ​​che stabilizzano la membrana del muscolo durante la contrazione ^7,8 e che mediano la segnalazione tra il myofiber e la matrice extracellulare ^7,9 sono stati identificati e studiati nei minimi dettagli.

Mutazioni in un certo numero di geni importanti per una struttura muscolarefunzione nd sono stati identificati come causa di malattie del muscolo scheletrici umani ( http://www.musclegenetable.org/ ). Queste malattie, classificati in linea di massima come miopatie scheletriche e distrofie muscolari basati su caratteristiche cliniche e istopatologiche, sono associati a debolezza muscolare, invalidità permanente e ^10,11 mortalità precoce. Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema eccezionale per la modellazione e lo studio delle malattie del muscolo scheletrici umani ^8,12,13. E 'stato impiegato per validare nuove mutazioni del gene ^8, definire nuovi aspetti della malattia fisiopatologia ^14,15, e identificare nuovi approcci terapeutici ^15,16. La potenza della zebrafish per studio delle malattie muscolo umano riferisce al maggior numero di figli, il rapido sviluppo della struttura muscolare e funzione, la chiarezza ottica dell'embrione zebrafish, e la facilità di manipolazione genetica e farmacologica della zebra sviluppopesce ^17.

Noi e altri ^12,18,19 recentemente sviluppato una tecnica semplice per l'isolamento rapido ed efficiente miofibre dal zebrafish sviluppo. Questo metodo ha permesso l'esame di miofibre in maggior dettaglio che può essere fornita da intera analisi embrione. La tecnica è stata sfruttata per la caratterizzazione della proteina localizzazione subcellulare ²⁰ nonché per l'identificazione di importanti caratteristiche istopatologiche come parte di studi di validazione in modelli di malattia di nuova concezione ^21. Inoltre, miofibre isolate possono inoltre essere utilizzati per l'imaging dal vivo e per gli studi elettrofisiologici ^22, tecniche che consentono l'interrogatorio di aspetti fondamentali della funzione muscolare. Il protocollo specifico per l'isolamento miofibre, insieme a due esempi di esperimenti successivi analitiche, è dettagliata nelle parti rimanenti di questo manoscritto.

Protocollo

1. Preparazione del Poli-L-lisina Rivestito Coprivetrini (Tempo: 1 ora)

Lamelle di rivestimento consente una rapida decantazione myofiber e l'adesione. Ciò può essere eseguita durante la fase di dissociazione dell'isolamento miofibre (passo 2).

1. Tagliare e posizionare Parafilm sul fondo di un piatto 60 millimetri Petri (di qualsiasi marca).
2. Posizionare scivola vetro di copertura microscopio (diametro 12 mm) su parafilm in un piatto di coltura tissutale a 60 mm o posizionare singolarmente in singoli pozzetti di piastre da 24 pozzetti.

Nota 1: Questi piccoli coprioggetto rotondi aiutano a concentrarsi myofiber numeri e ridurre l'utilizzo di anticorpi in eccesso.

Nota 2: Altri vetrini di dimensioni lavoreranno, tuttavia, i volumi di reagenti e di embrioni utilizzati dovranno essere adeguati di conseguenza.

3. Pipettare 50-200 microlitri di soluzione di poli-L-lisina (0,01%) su ciascun vetrino coprioggetto nella capsula di Petri.
4. Lasciare i coprioggetti di sedersi almeno una hour a 37 ° C. Incubazione più lungo non influenzeranno negativamente i risultati.
5. Rimuovere poli-L-lisina soluzione dal vetro di copertura e lavare due volte con un minimo di 100 microlitri di PBS 1x.
6. Lasciare coprioggetto asciugare.
7. Coprivetrini sono ora pronti per miofibre.

Nota 3: Al fine di garantire la sterilità, il rivestimento può essere fatto in un cappuccio e su vetrini in autoclave.

Nota 4: Mantenere il piatto 60 millimetri Petri con Parafilm sul fondo. Questa configurazione verrà utilizzato durante myofiber placcatura e immunomarcatura (fasi successive).

Alternativa 1: invece di lamelle di rivestimento immediatamente prima dell'uso, un vetrino rivestito magazzino può essere utilizzato. Un piatto 60 millimetri Petri contenente un minimo di 2 ml di poli-L-lisina può essere conservato a 4 ° C con numerosi coprioggetto. Con questa alternativa iniziare dal punto 1.5 per elaborare le lamelle per miofibre.

Alternativa 2: Abbiamo anche coprioggetto cappotto in poli-L-ornitina. Til suo è più alta intensità di manodopera, ma è utile per la coltura a lungo termine perché vetrini rivestiti di poli-L-ornitina può essere trattato UV. Con il trattamento UV e attenta tecnica sterile myofibers vivi in ​​genere può essere mantenute in coltura 4-7 giorni.

2. Dissociazione di embrioni di zebrafish e placcatura di miofibre (Tempo: da 1 a 3 ore)

Nota: il protocollo norma si applica meglio al 3 dpf (giorni dopo la fecondazione) gli embrioni.

1. Trasferire embrioni di zebrafish in un 1,5 ml provetta standard ed eliminare quanta più acqua i pesci in eccesso il più possibile. Tipicamente, possono essere utilizzati 10-20 embrioni per provetta, anche se meno. Utilizzando più di 20-25 embrioni traduce spesso in una preparazione di densità eccessiva.
   1. Rimuovere chorions prima di dissociazione, manualmente utilizzando # 5 pinze. In alternativa, la rimozione corion chimica si ottiene con 10-15 minuti di trattamento Pronase. Tipicamente, la rimozione precedente del corion è necessaria solo quando prima conferma di un mutè necessario fenotipo formica o morfologia, o quando si utilizza fasi in cui gli embrioni sono naturalmente tratteggiata da loro corion.
2. Aggiungere 900 ml di CO ₂ media indipendenti per il tubo contenente gli embrioni.
3. Aggiungere 100 ml di collagenasi di tipo II, finali concentrazione 3,125 mg / ml (soluzione della collagenasi a 31,25 mg / ml diluito in 1x PBS) per iniziare dissociazione. Collagenasi IV può essere utilizzato anche per la dissociazione.
4. Ruotare embrioni in un agitatore orbitale, e triturare ogni 30 min a temperatura ambiente usando una P1000 Pipetman per la triturazione.

Nota 2: monitorare attentamente embrione dissociazione, sopra o sotto di dissociazione (soprattutto over) sono le ragioni più comuni per il fallimento del protocollo. I tempi per la digestione variano a seconda dell'intensità di triturazione, il numero di embrioni per provetta, e l'età degli embrioni. E 'anche spesso meno (rispetto ai tipi selvatici) per embrioni da mutanti muscolari scheletriche.

Appunto3: tempo medio di digestione per età dell'embrione: 1 dpf = 1 ora, 2 dpf = 1,5 ore, 3 dpf = 2 ore e 4 dpf = 2-2,5 ore.

5. Smettere di digestione quando non interi embrioni sono visibili, ma pezzi solidi sono ancora visibili - questo è essenziale per prevenire overdigestion.
6. Provette da centrifuga con embrioni dissociate a 0,8-2,3 g per 3-5 minuti per le cellule pellet.
7. Rimuovere il surnatante dalle cellule pellet e lavare 2x con CO ₂ media indipendenti.
8. Aggiungere CO fresco ₂ media indipendenti per risospendere le cellule. 1 ml è tipicamente utilizzata per preparazioni di 10-20 embrioni. Il volume può essere scalata basata sul numero embrione.
9. Usando una pipetta P1000, passare sospensione embrione attraverso un filtro da 70 micron. Questo aiuta a rimuovere i residui indesiderati dalla preparazione.

Nota 4: sospensione embrione può essere filtrato una seconda volta attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere ulteriori residui indesiderati. Da una doppia filtrazione, il recupero è approximdiatamente 800 microlitri da un volume iniziale di 1 ml.

10. Aggiungere circa 50-100 microlitri di sospensione miofibre ad ogni coprioggetto rivestiti con poli-L-lisina.

Nota 5: Eseguire il passaggio 2.9 in piastre di Petri con Parafilm sul fondo, precedentemente preparato. Il Parafilm mantiene la sospensione myofiber di scappare coprioggetto rivestiti. Tenere piastre di Petri coperti per evitare l'evaporazione.

11. Consentire myofibers di stabilirsi a circa 1 ora sui vetrini rivestiti a temperatura ambiente.

Nota 6: myofibers inizieranno a comporre entro 5-10 min. Tuttavia, per buon attacco myofiber, si raccomanda un minimo di 1 ora (1-2 ore). Permettere myofibers di stabilirsi a lungo non danneggia la prep. Per incubazioni più lunghi (notti comprese), antibiotici possono essere aggiunti ai media. Con antibiotici e tecnica sterile fermenti vivi in ​​genere può essere mantenuta per 1-2 giorni.

12. Live myofibers può osservare a questo punto. Miofibre da embrioni 2 dpf e successivamente sarà visto come cellule striate e allungate (Figura 1). A questo punto, miofibre sono ora pronti per l'analisi diretta o per immunomarcatura.

Nota 7: muscolo scheletrico dal 1 dpf embrioni non piastra fibre come allungate e chiaramente striati. Invece, grandi myoballs sono visibili. Inoltre, durante la fase di post dissociazione pellet (punto 2.6), 1 dpf myoballs devono essere centrifugati per un minimo di 8 min a 5000 xg per ottenere un pellet. Per l'analisi degli embrioni in questa fase, si consiglia di utilizzare la linea transgenica che esprime EGFP specificamente nel muscolo scheletrico ^23. Ciò consentirà identificazione di cellule di origine muscolare contro altre fonti.

3. Fluorescenza Immunostaining di dissociati Zebrafish miofibre (Durata: circa 1 giorno)

3.1. Immunomarcatura

1. Rimuovere una porzione disupporti da myofibers aderito al vetrino rivestito
2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% o metanolo. Per PFA, rimuovere ½ il volume del supporto e sostituire con la stessa quantità di PFA. Fix per 10 min a RT, quindi rimuovere volume totale, sostituirlo con 50-100 ml di PFA, e fissare per altri 10 min. Per la fissazione alcool, ghiaccio metanolo freddo o acetone può essere applicato a 4 ° C per 10 min o 5 min, rispettivamente.
3. Lavare myofibers almeno 3-5x con PBS 1x o 1x PBS più 0,1% di Tween. Il volume medio di lavaggio è 50-100 microlitri per coprioggetto.
4. Aggiungere soluzione bloccante a myofibers (Stock di lavoro) e incubare 20-60 minuti a temperatura ambiente. Soluzione bloccante varierà a seconda delle condizioni anticorpi primari e secondari. I due più comuni utilizzate in laboratorio sono (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA, siero di pecora 1%, 0,25% Triton X-100 e finale (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) e siero di pecora / capra 5%.
5. Rimuovere soluzione bloccante e aggiungere anticorpo primario diluito in due bsoluzione o PBS bloccaggio. Incubare myofibers notte a 4 ° C. Assicurati di entrambi Parafilm o avvolgere nella pellicola trasparente scatola di Petri contenente i coprioggetti myofiber-caricato rivestite con anticorpi. Piccoli pezzi di carta assorbente inumidito possono essere aggiunti per creare una camera umidificata.
6. Rimuovere l'anticorpo primario da coprioggetto e lavare coprioggetto 3-5x per 5 minuti con PBS o la soluzione di blocco.
7. Aggiungi anticorpo secondario a concentrazione adeguata diluito in 1x PBS o soluzione di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente.
8. Rimuovere anticorpo secondario e lavare myofibers 3-5x in PBS per 5 minuti ciascuno a RT.

3.2. Lamelle di montaggio

9. Applicare 1-2 gocce di reagente antifade ad un vetrino da microscopio.
10. Pick-up con attenzione il vetrino rivestito e immunolabled con pinze e luogo (myofibers giù) il vetrino sul reagente antifade sul vetrino del microscopio.

Nota 1: L'attenzione per l'orientamento del cvetrino oated è critica.

11. Lay 1-2 Kimwipes su una superficie solida dura. Invertire rapidamente la slitta con i vetrini rivestiti riposo sul reagente antifade e posizionarlo (coprioggetto in diminuzione) in Kimwipes.
12. Applicare una leggera pressione agli angoli del vetrino da microscopio per rimuovere l'eccesso antifade e formare una perfetta tenuta tra il vetrino e coprioggetto
13. Consentire la antifade restante asciugare per 5-10 minuti a temperatura ambiente, poi le miofibre sono pronti ad immagine (Figure 2A e B) o conservare a 4 ° C.

4. Cellulare dal vivo Imaging di calcio Utilizzo GCaMP3

Esperimenti sulle cellule in diretta possono essere eseguite su myofibers prima fissaggio (seguito passo 2.10). Il protocollo che segue descrive l'imaging dal vivo in miofibre esprimono GCaMP3 ^24, un indicatore di calcio geneticamente codificato, espressa dal muscolo scheletrico specifico zebrafish α-actina promotore (pSKM) ^23. Alternativamente,questa tecnica può essere facilmente adattato per usare pigmenti indicatori del calcio, come Fura-2.

1. Iniettare embrioni con pSKM: GCaMP3 costruire nella fase di 1-2 cellule
2. A 3 dpf, raccogliere le larve e preparare myofibers come descritto nelle sezioni 1 e 2. Consentire myofibers di aderire per un minimo di 1 ora. Per questa tecnica, vetrini preparano in piatti da 24 pozzetti è necessaria.
3. Rimuovere con cura i supporti in eccesso, e aggiungere 300 ml di fresca CO ₂ media indipendenti a RT.
4. Osservare le cellule sotto un microscopio invertito. GCaMP3 myofibers positivi devono essere visibili sotto fluorescenza verde.
5. Installazione della fotocamera per la registrazione, se lo si desidera.
6. Preparare una soluzione di caffeina 30 mm di CO ₂ media indipendenti. Per stimolare le cellule, pipettare delicatamente 300 ml di soluzione di caffeina nel pozzo sotto ingrandimento. Da 5-10 sec, GCaMP miofibre positivi dovrebbero rispondere agli caffeina con un rapido aumento della fluorescenza (Figura 3). MyofibERS può anche contrarre. Da segnalare, la caffeina induce rilascio di calcio dai depositi del reticolo sarcoplasmatico ^25. Altri agenti, come ad esempio KCl ²⁶ e ryanodine ^4, possono essere utilizzati per studiare il rilascio di calcio inducibile.

Risultati

Immunomarcatura fluorescente di miofibre (Figura 2)

Immagini che mostrano atteso modello di marcatura fluorescente da myofibers immunostained dopo l'isolamento di successo e placcatura. Le miofibre sono stati etichettati sia con anti-recettore ryanodine (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticorpi, e rivelare rispettivamente immunocolorazione della triade e la Z-band. Anticorpi secondari utilizzati erano ...

Discussione

Zebrafish sono un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo muscolare e la funzione in vivo ^25,27,28. Essi hanno anche emerso come un bene prezioso per la modellazione di malattie muscolari umane ^14,15,20,29. Mentre i grandi passi avanti sono stati compiuti per promuovere l'uso e l'applicazione di zebrafish per lo studio della funzione muscolare e delle malattie del muscolo, vi è una necessità critica costante per sviluppare strumenti che consentano più approfo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750