Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

Zusammenfassung

Zebrafische sind ein Schwellensystem zur Modellierung menschlichen Erkrankungen der Skelettmuskulatur. Wir beschreiben eine schnelle und effiziente Methode, um Skelettmuskel Muskelfasern aus embryonalen Zebrafisch-Larven und zu isolieren. Dieses Verfahren ergibt eine hohe Dichte myofiber Vorbereitung für Untersuchung von einzelnen Skelettmuskelfasermorphologie, Protein subzelluläre Lokalisierung und Muskelphysiologie.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch hat sich als ein wertvolles Modellsystem für die Erforschung der Skelettmuskelfunktion und für das Studium der menschlichen Muskelerkrankungen sein. Trotz der vielen Vorteile, die durch in vivo-Analyse von Skelettmuskel im Zebrafisch angeboten, die Visualisierung der komplexen und fein strukturierten Protein Milieu für die Muskelfunktion verantwortlich, insbesondere im gesamten Embryos, kann problematisch sein. Dieses Hindernis ergibt sich aus der geringen Größe des Zebrafisch-Skelettmuskel (60 um) und der noch geringeren Größe des Sarkomers. Hier beschreiben wir und zeigen, eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Skelett Muskelfasern von Zebrafisch-Embryonen und Larven. Wir berücksichtigen auch Protokolle, die Postvorbereitungstechniken für die Analyse von Muskel-Aufbau und Funktion zu veranschaulichen. Insbesondere haben wir ausführlich die anschließende immunzytochemische Lokalisation von Skelettmuskelproteine ​​und die qualitative Analyse der Calcium-Freisetzung stimuliert via Live-Zelle Kalzium-Imaging. Insgesamt ist dieses VideoArtikel bietet eine unkomplizierte und effiziente Methode für die Isolierung und Charakterisierung von Zebrafisch-Skelett-Muskelfasern, eine Technik, die eine Leitung für unzählige nachfolgende Studien der Muskelstruktur und-Funktion bietet.

Einleitung

Die Skelettmuskulatur ist ein hoch spezialisiertes Gewebe für die Erzeugung der für die Motilität notwendig Kontraktionskräfte verantwortlich. Die Kontraktion wird durch einen Prozess wie Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung, die elektrische Signale an Calcium-Freisetzung aus intrazellulären Speichern ^1,2 wandelt bekannt initiiert. Intrazelluläre Calcium-Freisetzung aktiviert die Sarkomer zu verkürzen und zu erzeugen Kraft. Die vielen spezifischen Komponenten der molekularen Maschinen für die Vermittlung der neuromuskulären Synapse Getriebe ³ EG-Kupplung ^4,5, und Aktin-Myosin-abhängigen Kontraktionen ⁶ verantwortlich weiterhin die anhaltende Gegenstand intensiver Forschung. Darüber hinaus Proteine, die die Muskelmembran während der Kontraktion ^7,8 und dieser mittelbaren Signalisierung zwischen der myofiber und der extrazellulären Matrix ^7,9 stabilisieren wurden identifiziert und untersucht im Detail.

Mutationen in mehreren Genen, die für ein Muskelstrukturnd Funktion haben als Ursachen der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen identifiziert ( http://www.musclegenetable.org/ ). Diese Krankheiten, allgemein als Skelett Myopathien und Muskeldystrophien, basierend auf klinischen und histopathologischen Merkmalen klassifiziert, werden mit Muskelschwäche, lebenslange Behinderung und frühe Sterblichkeit ^10,11 verbunden. Der Zebrafisch hat sich als ein hervorragendes System zur Modellierung und Untersuchung der menschlichen Skelettmuskelerkrankungen ^8,12,13 sein. Es wurde eingesetzt, um neue Gen-Mutationen ⁸ validieren, definieren neue Aspekte der Krankheit Pathophysiologie ^14,15, zu erkennen und neue Therapieansätze ^15,16. Die Leistung des Zebrafisches zur Untersuchung menschlicher Muskelerkrankung bezieht sich auf die große Anzahl von Nachkommen, die rasche Entwicklung der Muskelstruktur und-funktion, die optische Klarheit des Zebrafischembryos, und der Leichtigkeit der genetischen und pharmakologischen Manipulation der EntwicklungszebraFisch ^17.

Wir und andere ^12,18,19 haben vor kurzem eine einfache Technik für die schnelle und effiziente Isolierung von Muskelfasern aus dem Zebrafisch-Entwicklung entwickelt. Diese Methode wurde die Prüfung von Muskelfasern näher, als durch ganze Embryo Analyse zur Verfügung gestellt werden aktiviert. Die Technik hat sich für die Charakterisierung von Protein subzelluläre Lokalisation ²⁰ als auch für die Identifizierung von wichtigen histopathologischen Merkmale als Teil der Validierungsstudien in neu entwickelten Krankheitsmodelle ²¹ genutzt. Darüber hinaus können isolierte Muskelfasern zusätzlich für Live-Bildgebung und für elektrophysiologische Studien ^22, Techniken, die für die Abfrage der Schlüsselaspekte der Muskelfunktion ermöglichen verwendet werden. Das spezifische Protokoll für myofiber Isolierung sowie zwei Beispiele für nachfolgende analytische Experimente ist in den übrigen Teilen des Manuskripts detailliert.

Protokoll

1. Herstellung von Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser (Dauer: 1 h)

Deckbeschichtung ermöglicht eine schnelle Einschwingzeit myofiber und Haftung. Dies kann während der Dissoziationsstufe der myofiber Trennung (Schritt 2 unten) durchgeführt werden.

1. Schneiden und Parafilm auf dem Boden einer 60 mm Petrischale (alle Marken).
2. Zeigen Mikroskop Deckglas rutscht (12 mm Durchmesser) auf Parafilm in einer 60-mm-Gewebekulturschale oder sie einzeln in einzelnen Wells der 24-Well-Platten.

Anmerkung 1: Diese kleine, runde Deckgläser helfen, myofiber Zahlen konzentrieren und reduzieren überschüssige Antikörper Nutzung.

Hinweis 2: Andere Größe Deck funktionieren wird, jedoch werden die Volumina der Reagenzien und Embryonen verwendet werden, müssen entsprechend angepasst werden.

3. Pipette 50-200 ul Poly-L-Lysin-Lösung (0,01%) auf jedem Deckglas in der Petrischale.
4. Lassen Sie die Deckgläser zu sitzen mindestens eine hour bei 37 ° C. Längere Inkubationen nicht negativ beeinflussen Ergebnisse.
5. Entfernen Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Deckglas und zweimal waschen mit einem Minimum von 100 ul 1x PBS.
6. Deck ermöglichen zu trocknen.
7. Die Deckgläser sind nun bereit für Muskelfasern.

Hinweis 3: Um die Sterilität zu gewährleisten, kann die Beschichtung in einer Haube und autoklaviert Deckgläschen durchgeführt werden.

Anmerkung 4: Halten Sie die 60 mm Petrischale mit Parafilm auf der Unterseite. Dieses Setup wird während myofiber Beschichtungs-und Immunmarkierung (später Stufen) verwendet werden.

Alternative 1: Statt der Deckbeschichtung unmittelbar vor der Anwendung kann eine beschichtete Deck Lager verwendet werden. Eine 60 mm-Petrischale, die ein Minimum von 2 ml Poly-L-Lysin kann bei 4 ° C mit zahlreichen Deck gespeichert werden. Bei dieser Alternative beginnen Sie mit Schritt 1,5 bis die Deckgläser für Muskelfasern zu verarbeiten.

Alternative 2: Wir haben auch Decklack in Poly-L-Ornithin. Tseiner ist arbeitsintensiv, aber ist nützlich für längerfristige Kultivierung da Poly-L-Ornithin-beschichteten Deckgläsern können UV behandelt sein. Mit UV-Behandlung und sorgfältige steriler Technik Live Muskelfasern können in der Regel in der Kultur 4-7 Tage aufrecht erhalten werden.

2. Die Dissoziation von Zebrafischembryonen und Oberflächen von Muskelfasern (Dauer: 1 bis 3 Std.)

Hinweis: Die Standard-Protokoll gilt besten bis 3 dpf (Tage nach der Befruchtung) Embryonen.

1. Übertragen Zebrafischembryonen in ein Standard 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie so viel überschüssige Wasser Fische wie möglich. Typischerweise können 10-20 Embryos pro Rohr, wenn auch weniger eingesetzt werden. Verwendung von mehr als 20-25 Embryonen führt oft zu einer Herstellung von übermäßiger Dichte.
   1. Chorion vor der Dissoziation entfernen, manuell mit Nr. 5 Pinzette. Alternativ wird chemische Chorion Entfernung mit 10-15 min Pronase Behandlung erreicht. Typischerweise wird die vorherige Entfernung der Chorion nur notwendig, wenn vor der Bestätigung des MUTant Phänotyp oder Morphologie erforderlich ist, oder bei der Verwendung Bühnen, auf denen Embryonen werden natürlich von ihren Chorion geschlüpft.
2. In 900 ul der CO _{2-unabhängigen} Medien an der Röhre, die die Embryonen.
3. 100 l Collagenase Typ II, Endkonzentration 3,125 mg / ml (Auf Collagenase-Lösung mit 31,25 mg / ml in 1x PBS), um die Dissoziation zu beginnen. Collagenase IV auch zur Spaltung verwendet werden.
4. Drehen Embryonen auf einem Orbitalschüttler und verreiben alle 30 min bei RT mit einem Pipetman P1000 für das Verreiben.

Hinweis 2: Embryo Dissoziation sorgfältig zu überwachen; über oder unter Dissoziation (vor allem über) sind die häufigsten Gründe für die Protokoll-Fehler. Zeiten für die Verdauung wird je nach Intensität der Verreibung, die Anzahl der Embryonen pro Röhrchen und Alter des Embryos variieren. Es ist auch oft weniger (im Vergleich zu Wildtypen) für Embryonen aus der Skelettmuskulatur Mutanten.

Anmerkung3: Durchschnittlich Verdauungszeit pro Embryoalter: 1 dpf = 1 h, 2 dpf = 1,5 h, 3 dpf = 2 h und 4 dpf = 2-2,5 Stunden.

5. Stoppen Sie die Verdauung, wenn keine ganze Embryonen sind sichtbar, aber feste Stücke sind noch sichtbar - das ist wichtig, overdigestion verhindern.
6. Zentrifugenröhrchen mit dissoziierten Embryonen bei 0,8 bis 2,3 g für 3-5 min auf Pellet-Zellen.
7. Überstand entfernen von pelletierten Zellen und waschen 2x mit CO ₂ unabhängige Medien.
8. Add frischen CO ₂ unabhängige Medien, um Zellen zu resuspendieren. 1 ml wird typischerweise für Preps von 10-20 Embryonen verwendet. Die Lautstärke kann auf Basis Embryo Anzahl skaliert werden.
9. Mit einer Pipette P1000, vorbei Embryo Suspension durch ein 70-um-Filter. Dies hilft, entfernen Sie unerwünschte Ablagerungen aus dem prep.

Anmerkung 4: Embryo Suspension kann ein zweites Mal durch ein 40-um-Filter gefiltert, um weiter zu entfernen unerwünschte Ablagerungen werden. Von einem Doppelfiltration, ist die Wiederherstellung approximLICH 800 ul von einem Ausgangsvolumen von 1 ml.

10. Füllen Sie ungefähr 50-100 ul myofiber Suspension in jede Poly-L-Lysin beschichteten Deckglas.

Anmerkung 5: Führen Sie den Schritt 2.9 in die Petrischalen mit Parafilm auf dem Boden, die zuvor vorbereitet. Der Parafilm hält die Aussetzung myofiber Verlaufen die beschichtete Deckgläser. Halten Petrischalen abgedeckt, um Verdunstung zu verhindern.

11. Lassen Muskelfasern auf ca. 1 Stunde auf die beschichtete Deckgläser bei Raumtemperatur zu regeln.

Anmerkung 6: Muskelfasern beginnen, innerhalb von 5-10 min zu begleichen. Doch für gute myofiber Anhang, mindestens 1 h (02.01 h) wird empfohlen. Zulassen von Muskelfasern, für längere begleichen werden nicht schaden, die prep. Für längere Inkubationen (inkl. Übernachtung), können Antibiotika zu den Medien geben. Mit Antibiotika und steriler Technik lebenden Kulturen typischerweise für 1-2 Tage gehalten.

12. Live-myofibers kann an dieser Stelle beobachtet werden. Muskelfasern aus Embryonen 2 dpf und wird später als Rillen und längliche Zellen (Fig. 1) zu sehen. An diesem Punkt sind nun bereit für die Live-Muskelfasern Analyse oder zur Immunmarkierung.

Anmerkung 7: Die Skelettmuskulatur von 1 dpf Embryonen nicht als Lang und deutlich quergestreiften Fasern plattieren. Stattdessen sind groß myoballs sichtbar. Zusätzlich wird während der Pelletierung Phase Post-Dissoziation (Schritt 2.6), 1 dpf myoballs müssen für ein Minimum von 8 min bei 5.000 g zentrifugiert, um ein Pellet zu erreichen. Für die Analyse von Embryonen in diesem Stadium, ist es empfehlenswert, den transgenen Linie EGFP speziell im Skelettmuskel ²³ zu verwenden. Dies wird Identifikation von Zellen aus Muskel Herkunft im Vergleich zu anderen Quellen zu ermöglichen.

3. Fluoreszenz-Immunfärbung von Dissoziierte Zebrafisch Muskelfasern (Dauer: ca. 1 Tag)

3.1. Immunomarkierung

1. Einen Teil entfernenMedien von Muskelfasern auf die beschichtete Deckglas geklebt
2. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd oder Methanol. Für PFA, ½ Volumen der Medien entfernen und ersetzen mit der gleichen Menge an PFA. Fix für 10 min bei RT, dann entfernen Gesamtvolumen, ersetzen mit 50-100 ul PFA, und befestigen Sie für weitere 10 min. Alkoholfixierung, eiskaltem Methanol oder Aceton bei 4 ° C für 10 min oder 5 min aufgebracht werden, auf.
3. Muskelfasern mindestens 3-5x mit 1x PBS oder 1x PBS plus 0,1% Tween waschen. Durchschnittliche Waschvolumen beträgt 50-100 ul pro Deckglas.
4. In Blocklösung zu Muskelfasern (Arbeits Lager) und Inkubation von 20-60 min bei Raumtemperatur. Blockierungslösung wird je nach den primären und sekundären Antikörper variieren. Die beiden häufigsten im Labor verwendet werden, sind (1) 1 × PBS, 2 mg / ml BSA, 1% Schafserum, 0,25% Triton X-100 final und (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) und 5% Schaf / Ziegenserum.
5. Blockierlösung entfernen und hinzufügen primären Antikörper entweder b verdünntVerriegelungslösung oder PBS. Muskelfasern über Nacht Inkubation bei 4 ° C. Stellen Sie sicher, dass Sie entweder Parafilm oder wickeln Sie sie in Frischhaltefolie die Petrischale mit den myofiber belasteten Deckgläser mit einem Antikörper beschichtet. Kleine Stücke von angefeuchteten Papiertuch kann hinzugefügt werden, um eine befeuchtete Kammer zu erzeugen.
6. Entfernen primären Antikörper aus Deckgläser Deckgläser und waschen 3-5x für 5 min mit PBS oder Blocking-Lösung.
7. In sekundären Antikörper in geeigneter Konzentration in 1x PBS oder Blockierungslösung für 1-2 h bei RT verdünnt.
8. Sekundärantikörper entfernen und waschen Muskelfasern 3-5x in PBS für jeweils 5 min bei RT.

3.2. Montagedeck

9. 1-2 Tropfen Antifade Reagenz auf einen Objektträger.
10. Sorgfältig Abholung der beschichteten und immunolabled Deckglas mit einer Pinzette und Ort (Muskelfasern nach unten) das Deckglas auf der Antifade Reagenz auf dem Objektträger.

Anmerkung 1: Die Beachtung der Ausrichtung der coated Deck ist kritisch.

11. Legen 1-2 Kimwipes auf eine harte feste Oberfläche. Invertieren Sie schnell den Schlitten mit den beschichteten Deckgläser auf der Antifade Reagenz ruht und legen Sie es (Deckglas nach unten) auf der Kimwipes.
12. Wenden Sie leichten Druck auf die Ecken des Mikroskop-Objektträger, um überschüssige Antifade entfernen und eine gute Abdichtung zu bilden zwischen dem Schieber und Deckglas
13. Veröffentlichung der verbleibende, für 5-10 min bei RT trocknen Antifade, dann die Muskelfasern sind bereit, Bild (2A und B) oder bei 4 ° C

4. Live Cell Calcium Imaging Mit GCaMP3

Lebendzellexperimenten auf Muskelfasern vor der Fixierung (nach Schritt 2.10) durchgeführt werden. Das folgende Protokoll beschreibt die Live-Darstellung in Muskelfasern exprimieren GCaMP3 ^24, eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator, der Skelettmuskel-spezifischen Zebrafisch-α-Aktin-Promotor (PSKM) ²³ ausgedrückt. AlternativDieses Verfahren kann leicht angepasst werden, um Calcium-Indikator-Farbstoffe, wie Fura-2 verwendet werden.

1. Inject Embryonen mit PSKM: GCaMP3 bauen an der 1-2 Zell-Stadium
2. Bei 3 dpf, sammeln und bereiten Larven Muskelfasern wie in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Muskelfasern zu ermöglichen für ein Minimum von 1 Stunde zu halten. Für diese Technik bereitet Deckgläschen in 24-Well-Platten erforderlich.
3. Überschüssiges Material vorsichtig entfernen, und 300 ml frisches CO ₂ unabhängige Medien bei RT.
4. Beachten Zellen unter einem inversen Mikroskop. GCaMP3 positive Muskelfasern sollte unter grünen Fluoreszenz sichtbar sein.
5. Richten Sie die Kamera für die Aufnahme, wenn gewünscht.
6. Bereiten Sie eine 30 mM Koffein-Lösung in CO ₂ unabhängige Medien. Um Zellen zu stimulieren, sanft Pipette 300 ul von Koffein-Lösung in die gut unter Vergrößerung. Innerhalb von 5-10 sec, soll GCaMP positiven Muskelfasern Koffein mit einem schnellen Anstieg der Fluoreszenz (Fig. 3) zu reagieren. Myofibten kann auch schrumpfen. Zu beachten ist, induziert Koffein Calcium-Freisetzung aus den Retikulum speichert ^25. Andere Mittel, wie KCl ²⁶ und ^Ryanodin-4, verwendet werden, um induzierbare Calciumfreisetzung zu untersuchen.

Ergebnisse

Fluoreszenz-Immunmarkierung von Muskelfasern (Fig. 2)

Bilder, die erwarteten Fluoreszenzmarkierungsmuster von Muskelfasern immun nach erfolgreicher Isolierung und Beschichtung. Die Muskelfasern wurden mit entweder Anti-Ryanodin-Rezeptor (1:100) (2A) oder anti-α-Actinin (1:100) (2B) Antikörpern markiert worden sind, und zeigen die Immunfärbung der Triade und der Z-Bande auf. Sekundäre Antikörper waren Alexa Fluor 555 (1:500). Bi...

Diskussion

Zebrafische sind ein leistungsfähiges Wirbeltier-Modellsystem für die Untersuchung der Muskelentwicklung und Funktion in vivo ^25,27,28. Sie haben auch gezeigt, als ein wertvolles Gut für die Modellierung menschlichen Muskelerkrankungen ^14,15,20,29. Während große Schritte unternommen wurden, um die Nutzung und Anwendung der Zebrafisch für die Untersuchung der Muskelfunktion und Muskelerkrankungen voranzubringen, gibt es eine ständige kritische Notwendigkeit, Werkzeuge, die mehr in di...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well culture plate	Corning	3524
10x PBS	Invitrogen Gibco	70011
CO2 Independent medium	Invitrogen Gibco	18045
Collagenase Type II	Worthington Biochemical	LS004186	Lot 41H12764
Collagenase Type IV	Worthington Biochemical	L5004188
8% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8
Methanol	Sigma	322415
Triton X-100	Sigma	X100
BSA	Sigma	A2153
Sheep serum	Sigma	S3772
Goat serum	Sigma	G9023
Glass coverslips	Fischerbrand	12-545-82 12CIR-1D
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707
Pronase	Sigma	P5147
40 μm Filter	BD Biosciences	352340
70 μm Filter	BD Biosciences	352350
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36931
Anti-α-Actinin antibody	Sigma	A5044
Anti-RYR antibody	Abcam	34C
Alexa Fluor antibody	Invitrogen	A-21425
TWEEN 20	Sigma	P1379
60 mm Petri dish	Fischerbrand	0875713A
Poly-L-Ornithine	Sigma	P4957
Microscope slide	Fischerbrand	12-550-15
Caffeine	Sigma	C0750