نموذج الفئران من التئام الجروح

Summary

نموذج الفئران من التئام الجروح الجلدية التي يمكن استخدامها لتقييم المركبات العلاجية في إعدادات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض.

Abstract

التئام الجروح وإصلاح هي العمليات البيولوجية الأكثر تعقيدا التي تحدث في حياة الإنسان. بعد الإصابة، والمسارات البيولوجية متعددة تصبح تفعيلها. ضعف التئام الجروح، والذي يحدث في مرضى السكري على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية خطيرة مثل بتر. ،، وهناك بالتالي زيادة قوة دافعة لتطوير وكلاء الرواية التي تعزز إصلاح الجرح. وقد تم اختبار هذه تقتصر على النماذج الحيوانية الكبيرة مثل الخنازير، التي غالبا ما تكون غير عملية. وتمثل الفئران النموذج المثالي قبل السريرية، كما أنها اقتصادية وقابلة للتلاعب الجيني، والذي يسمح للتحقيق الآلية. ومع ذلك، التئام الجروح في ماوس تختلف اختلافا جوهريا لأنه من البشر كما يحدث في المقام الأول عن طريق الانكماش. لدينا نموذج الفئران يتغلب على هذا من خلال دمج جبيرة حول الجرح. بواسطة جبيرة الجرح، عملية الإصلاح ومن ثم تعتمد على الاندمال بتشكل النسيج الظهاري، وانتشار الخلايا والأوعية الدموية، والتي تعكس عن كثبالعمليات البيولوجية من التئام الجروح الإنسان. في حين تتطلب الاتساق والرعاية، وهذا نموذج الفئران لا تنطوي على التقنيات الجراحية المعقدة ويسمح للاختبار قوية من وكلاء الواعدة التي قد، على سبيل المثال، وتعزيز الأوعية الدموية أو تمنع الالتهابات. وعلاوة على ذلك، كل الماوس بمثابة ايقاعه كما يتم إعداد اثنين من الجروح، وتمكن من تطبيق كل من مجمع الاختبار والسيطرة على السيارة في نفس الحيوان. في الختام، علينا أن نظهر، ونموذج العملية سهلة التعلم، وقوية من التئام الجروح، والذي هو مشابه لذلك من البشر.

Introduction

ضعف التئام الجروح هي المسؤولة عن المضاعفات والوفيات في جميع أنحاء العالم كبيرة، وهذا صحيح بشكل خاص بالنسبة لمن يعانون من داء السكري ^1،2. في البشر، والتئام الجروح هو سلسلة متصلة من العمليات، التي يوجد فيها تداخل كبير ^3. على الفور تم تهيئتها، عمليات التهابات اصابة التالية. الافراج عن الخلايا الالتهابية العوامل التي تشجع عمليات تكاثر الخلايا، والهجرة والأوعية الدموية. بعد إعادة تشكيل الاندمال بتشكل النسيج الظهاري وأنسجة جديدة هناك مرحلة من إعادة عرض أن يستتبع كلا موت الخلايا المبرمج وإعادة تنظيم البروتينات المصفوفة مثل الكولاجين.

تعقيد التئام الجروح لا يمكن تكرارها حاليا في المختبر، وهذا يتطلب استخدام النماذج الحيوانية. حتى الآن، ودراسات التئام الجروح اقتصرت على نماذج حيوانية كبيرة، مثل الخنازير، للتأكد من أن عمليات الشفاء متكافئين وقابلة للمقارنة إلى البشر. ومع ذلك، باستخدام أنيما كبيرةيمكن ليرة سورية لمثل هذه الدراسات يكون من الصعب منزل وليست دائما عملية ^4. الماوس المختبر يمثل نموذج حيواني الاقتصادية التي يمكن بسهولة التلاعب بها وراثيا لتحقيق الآلية ^5-7. ومع ذلك، الجروح تلتئم بشكل مختلف الفئران إلى الإنسان و، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عملية انكماش ^8. هذا هو في جزء منه، بسبب وجود طبقة تحت الجلد العضلات المخططة واسعة تسمى السبلة العضلية التي هي غائبة إلى حد كبير في البشر. في الفئران، هذه الطبقة العضلات يسمح للجلد على التحرك بشكل مستقل من عضلات أعمق ومسؤولة عن الانكماش السريع من الجلد التالية اصابة.

للتغلب على هذا القيد، التئام الجروح الفئران يمكن تكييفها لتكرار التئام الجروح الإنسان عن طريق استخدام جبيرة (الشكل 1) ^8،9. في هذا الفيديو ونحن لشرح تجبير نموذج الفئران من شأنها أن تزيل الجرح انكماش الجرح وبشكل وثيق يقارب العمليات البشرية من إعادة epithelializaنشوئها وتشكيل أنسجة جديدة. في هذا النموذج يتم إنشاء اثنين من الختان كامل سمك التي تشمل السبلة العضلية على ظهر، واحدة على كل جانب من خط الوسط من الماوس. يتم وضع جبيرة سيليكون حول الجرح بمساعدة من مادة لاصقة ثم حصل على جبيرة مع خيوط متقطعة. كل الماوس بمثابة ايقاعه، مع جرح واحد يتلقون العلاج والسيطرة على السيارة الأخرى، مما يؤدي إلى خفض أعداد الحيوانات. بعد التطبيقات الموضعية، يتم تطبيق تضميد الانسداد شفافة. يمكن إزالة الضمادة عند الحاجة لمزيد من التطبيقات الموضعية و / أو قياس من منطقة الجرح ^10،11. في يمكن تقييم الانتهاء من التجارب، وإغلاق الجرح، والهندسة المعمارية المورفولوجية ودرجة اتساع الأوعية الدموية التي كتبها المناعية. هذه اقتصادية وسهلة لأداء نموذج يمكن أيضا أن تستخدم لتقييم التئام الجروح في سياق داء السكري أو pathophysiologies الأخرى.

Protocol

1. إعداد والجبائر والضمادات الكاتمة

1. الخطوط العريضة 10 ملم على الدوائر 0.5 مم الأغطية سيليكون سميكة واستخدام مقص أو لكمة خزعة لإنشاء أقراص السيليكون.
2. المركز 5 ملم خزعة لكمة في منتصف مم دائرة 10 واضغط بشدة إلى خلق ثقب لتشكيل "دونات" مثل القرص التي سيتم استخدامها بوصفها جبيرة.
3. الخطوط العريضة 10 مم الدوائر على تضميد الانسداد شفافة مثل Opsite ومقص استخدامها لإنشاء الضمادات دائرية.

2. حيوانات التجارب

1. الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات الحيوان لجميع التجارب التي سوف يتم تنفيذها.
2. استخدام 8 أسابيع من العمر (22-26 غرام) ذكر الفئران C57BL/6J من مربي التجارية (مثل مختبرات جاكسون).
3. الحفاظ على الفئران في ظروف قياسية من 21 درجة مئوية والموارد البشرية دورة ضوء الظلام 12 مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
4. (اختياري): مرض السكري يمكن أن يتسبب في الفئران القديمة 6-7 الاسبوع الماضي من البلعة داخل الصفاق injeكشن من 165 ملغ / كغ بالستربتوزوتوسين (في المخزن سيترات، ودرجة الحموضة 4.5)، مع أكده العادية مراقبة نسبة الجلوكوز في الدم (AccuChek غلوكمتر) ارتفاع السكر في الدم. قد يكون الفئران من السكري بوال وهكذا قد تحتاج الفراش لتغييرها بشكل متكرر أكثر للقضاء على الرطوبة وينبغي رصد أوزانها عن كثب.

3. التخدير والتحضير المنطوق

1. لحث على التخدير العام باستخدام 5٪ isoflurane والأكسجين في 100٪ (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة) والحفاظ على التخدير باستخدام 1-3٪ isoflurane و.
2. ضمان ردود الفعل دواسة عميقة من الفأرة يتم منعها ووضع الماوس في وضعية الانبطاح.
3. إعداد المنطقة المنطوق عن طريق إزالة الفراء مع كليبرز من قاعدة الرقبة إلى 3 سم مزيد من أسفل الظهر وبين لوحي الكتف.
4. يمكن تطبيق تطبيق ضوء كريم مزيل الشعر لمدة لا تزيد عن 2 دقيقة. مسحات الشاش الرطب يمكن استخدامها لضمان أن جميع كريم وتتم إزالة ما تبقى الفراء.
5. مسح الجلد معمسحة الكحول وتطبيقين من 10٪ بوفيدون اليود (بيتادين) وثنى الماوس.

4. الختان والتجبير من الجرح

1. يتم تقديم تمثيل بياني للنموذج الفئران التئام الجروح في الشكل 1.
2. استخدام معقم 4 ملم خزعة لكمة إلى الخطوط العريضة نمطين الدائرية لالجرح على جانبي خط الوسط الماوس، على مستوى الكتفين (انظر الشكلين 2A-2B).
3. استخدام ملقط مسنن لرفع الجلد في منتصف المخطط ومقص القزحية لإنشاء الجرح كامل سمك الذي يمتد من خلال الأنسجة تحت الجلد (أرقام 2C-2D)، بما في ذلك السبلة العضلية (2E الشكل)، واستئصال قطعة دائرية من الأنسجة.
4. كرر العملية الجرح على الجانب الآخر من خط الوسط (الشكل 2F).
5. إزالة طبقة واقية من البلاستيك من كل جانب من جبيرة السيليكون.
6. تطبيق cyanoacrylaالشركة المصرية للاتصالات لاصق (مثل سوبر الغراء أو الصمغ كريزي) إلى جانب واحد من جبيرة السيليكون.
7. المركز جبيرة على الجرح (الشكل 2G) ومرساة للجبيرة مع توقف 6-0 خيوط النايلون لضمان تحديد المواقع (الشكل 2H).
8. تكرار عملية التجبير على الجرح أخرى.
9. إذا كان ذلك مطلوبا في هذا الوقت نقطة، وتطبيق المجمع العلاجية لفحصها (ما يصل إلى 100 ​​ميكرولتر) إلى الجرح واحد (الشكل 2I)، والسيطرة على السيارة إلى أخرى.
10. تغطية الجرح بضمادة الانسداد شفافة (على سبيل المثال، OpSite) (الشكل 2J-2K).
11. يتم وضع مسطرة تحت الجبائر وصورة مجهرية تؤخذ (الشكل 2L).

6. إدارة ما بعد الجراحة

1. ويدير كاربروفين (5 ملغ / كلغ) مرة واحدة يوميا عن طريق الحقن تحت الجلد لتخفيف الألم بعد الجراحة.
2. بعد أن يتم بشكل فردي في قفص الحيوانات جراحة والمحافظة على حرارة مATS حتى تعافى تماما.
3. رصد الحيوانات مرتين يوميا لمدة مظاهر الألم وفقدان الوزن. لاحظنا لا يعرض السلوكية الإجمالي من ألم أو فقدان الوزن.

7. قياس الجرح والعلاج

1. الجرح يمكن قياسها يوميا.
2. لحث على التخدير العام باستخدام 5٪ isoflurane والغاز (معدل التدفق 1 لتر / دقيقة)، ومن ثم ضمان ردود الفعل الحسية العميقة من الفأرة يتم منعها باستخدام 1-3٪ isoflurane و.
3. بلطف قشر الظهر خلع الملابس الانسداد بالملقط.
4. استخدام الفرجار الجراحية لقياس قطر الجرح. ونحن نأخذ ما معدله ثلاثة قياسات طول X، Y و Z محور (أرقام 2M-2O) وكذلك صورة مجهرية لتكون مرجعا في المستقبل (الشكل 2P).
5. اختياري: في هذا الوقت يمكن تقييم هذا الحيوان لنضح الدم باستخدام الليزر دوبلر تصوير (الشكل 2Q).
6. يمكن إعادة تطبيق المجمع العلاجية والسيطرة على السيارة يكون ادائهاميد عند هذه النقطة.
7. A نظيفة شفافة خلع الملابس الانسداد ثم يتم إعادة تطبيقها والحيوانات أبقى دافئ حتى تعافى تماما.
8. ملاحظة: إذا لم يتم تأمينها بشكل صحيح الجبائر الجرح ستتعاقد بسهولة (الشكل 2R).

8. التحليل النسيجي

1. الموت ببطء الفئران بعد 10 يوما مع جرعة زائدة من التخدير.
2. باستخدام ملقط وشفرة مشرط إزالة الغرز وقشر بعناية بعيدا جبيرة.
3. استخدام مقص القزحية لخلق واسعة، والاستئصال الكامل حول وتحت منطقة الجرح واحتضان الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
4. نقل الأنسجة لالسكروز 17٪ في حل برنامج تلفزيوني لمدة ساعة على 24 أخرى في 4 درجات مئوية ثم إزالة حل الزائد عن طريق اللمس بعناية على الأنسجة والمكان في شهر أكتوبر من المجمع وتجميد في -80 درجة مئوية.
5. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ يمكن استخدامها لتصور بنية الجرح والفجوة الظهارية. Neovasculويمكن تقييم arisation بواسطة تحليلات المناعى لتحديد عدد من الشعيرات الدموية (باستخدام عامل فون ويلبراند).

النتائج

يتم تحديد منحنى إغلاق الجرح عن طريق حساب متوسط ​​قطرها من الجرح ويعبر عن النتائج كنسبة مئوية، أي 100 - (يوم 0 قطر / يوم القطر X). في هذه التجربة تم تطبيقها على مركب علاجي (أو السيطرة على السيارة) يوميا على الجرح. مجمع العلاجية إغلاق الجرح تسارع إلى حد كبير (الشكل 3)....

Discussion

هذا هو نموذج الفئران التجريبية من التئام الجروح الجلدية. وهناك ميزة هامة من هذا النموذج هو استخدام الجبائر السيليكون لمنع انكماش الجرح بحيث قد تحدث إعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري وتكوين الأنسجة الجديدة، مما يجعلها مشابهة للعملية التي تحدث في البشر. هذا النموذ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986