伤口愈合的小鼠模型

摘要

甲小鼠模型的皮肤伤口愈合，可用于评估治疗化合物在生理和病理生理设置。

摘要

伤口愈合和修复，是发生在人类生活中最复杂的生物过程。伤好后，多种生物途径被激活。伤口愈合受损，发生在糖尿病患者中，例如，可导致截肢等严重的不利后果。因此，有动力开发新的药物，促进伤口修复。检测这些已经被限制到大动物模型，如猪，这往往是不切实际的。老鼠代表了理想的临床前模型，因为它们是经济和适合的遗传操作，它允许进行机械的调查。然而，伤口愈合的小鼠，人类是根本不同的，因为它主要通过收缩发生。我们的小鼠模型，克服这将夹板在伤口周围。夹板伤口，然后修复过程依赖于上皮细胞增殖和血管生成，密切镜像人的伤口愈合的生物学过程。虽然这个小鼠模型需要一致性和护理，不涉及复杂的外科技术，并允许为可靠的测试有前途的代理，例如，可能会促进血管生成或抑制炎症。此外，各小鼠作为它自己的控制制备两个伤口，使应用程序的试验化合物，并在同一个动物的车辆控制。总之，我们展示了一个实用，易于学习，伤口愈合，这是与人类相媲美的强大的模型。

引言

伤口愈合的受损是负责重大的发病率和死亡率全球糖尿病患者^1,2，这是尤其如此。在人类中，伤口愈合是一个连续的过程，其中有显着的重叠^3。紧随伤人，炎症过程的开始。炎症细胞释放的因素，鼓励细胞增殖，迁移和血管生成的过程。再上皮化和新组织形成后重构的相位，既需要细胞凋亡及基质蛋白如胶原蛋白的重新组织。

复杂伤口愈合目前尚未在体外复制，这需要使用的动物模型。迄今为止，伤口愈合的研究已被限制到大型动物模型中，如猪，以确保愈合过程是等价的，与人类。但是，使用大阿尼玛LS这类研究可能是困难的房子，并总是不踏实^4。该实验室的的鼠标代表经济动物模型，可以很容易地操纵基因机制研究^5-7。然而，小鼠的伤口愈合不同的人类的，主要是由于收缩的过程中^，8。这部分是由于广泛皮下横纹肌层脂膜肉质是主要缺席的人类。在小鼠中，该肌肉层使皮肤更深的肌肉独立移动，负责皮肤以下伤人的迅速收缩。

为了克服这个限制，可以适应小鼠的伤口愈合，用夹板固定（ 图^1）8,9复制人类伤口愈合。在这段视频中，我们展示了夹板小鼠伤口模型，消除伤口收缩和更接近人类的过程中重新epithelialization和新组织的形成。在此模型中，两个全层切除，包括脂膜肉质上创建的背部，一个在中线的每一侧的鼠标。有机硅夹板放置在伤口周围与粘合剂的援助和夹板然后间断缝合固定。各小鼠作为它自己的控制，与接受治疗的伤口与其他车辆控制，从而降低动物数量。局部应用后，透明的闭塞敷料被应用。该敷料可以被删除，当需要用于进一步的局部应用和/或测定伤口面积^10,11。通过免疫组化的实验，在完成伤口缝合，形态结构和新生血管的程度可以评估。这种经济和容易执行的模型也可以被用来评估糖尿病或其它病理生理学的上下文中的伤口愈合。

研究方案

1。夹板包扎敷料的制备

1. 0.5毫米厚的硅薄膜和使用剪刀或活检冲床创建硅磁盘上，勾勒出10毫米的圆圈。
2. 中心一个5毫米的穿刺活检拳打在10 mm的圆圈中间，然后用力按压，创建一个孔洞，形成一个"甜甜圈"般的光盘将被用来作为夹板。
3. 纲要10毫米的圆圈，在一个透明的闭塞敷料，如Opsite和使用剪刀创建循环敷料。

2。实验动物

1. 获取将要执行的所有实验动物伦理委员会批准。
2. 使用8周龄（22-26克）的雄性小鼠从商业饲养员（ 如杰克逊实验室）。
3. 养老鼠在标准条件下，21℃，12小时免费获得食物和水的光暗周期。
4. （可选）:糖尿病可在6〜7周龄小鼠诱导由丸腹腔仁济CTION 165毫克/公斤菌素（柠檬酸缓冲液，pH值4.5），高血糖定期血糖监测（血糖仪AccuChek）确认。糖尿病小鼠有尿，所以他们的床上用品可能需要更频繁地更换，以消除潮湿，应密切监测它们的权重。

3。麻醉和手术的准备

1. 诱导全身麻醉，用5％异氟醚在100％的氧气（流速1升/分钟），并用1-3％异氟烷维持麻醉。
2. 确保深踩油门反射被抑制的鼠标和鼠标放置在俯卧位。
3. 准备手术的区域，从基地的脖子，用指甲刀去除毛皮〜3厘米进一步回落的背部和两个肩胛骨之间。
4. 脱毛霜轻应用，可申请不超过2分钟。可以使用湿纱布，以确保所有的奶油，并除去剩余的毛皮。
5. 擦拭皮肤与酒精棉签和两个应用程序10％的聚维酮碘（优碘）和悬垂鼠标。

4。伤口的切除和夹板

1. 在图1中图解表示的小鼠的伤口愈合模型。
2. 使用无菌4毫米活检冲床概述两个圆形型态的伤口上的鼠标的中线的两侧肩的水平（参见图2a-2b的 ）。
3. 使用锯齿钳，解除皮肤的轮廓和虹膜剪创建一个全层伤口穿过皮下组织（ 图2C-2D），包括脂膜肉质（ 图2e）在中间，和消费的一块圆形组织。
4. 重复该过程中线的另一侧（ 图2f）上的伤口。
5. 撕下的保护涂层从硅夹板的每一侧。
6. 应用cyanoacryla"特粘合剂（ 如强力胶或胶疯狂）一侧的硅酮夹板。
7. 中心夹板的伤口（ 图2g）和夹板固定中断6-0尼龙线缝合，以确保定位（ 图2H）。
8. 重复的夹板上的其他伤口的过程。
9. 如果需要在此时间点，适用于一个伤口（ 图2i），车辆控制的其他的治疗化合物以进行测试（100微升）。
10. 用透明闭塞敷料（例如，OpSite）（ 图2j的-2k的 ）覆盖伤口。
11. 一把尺子放在下面的夹板和采取的显微照片（ 图21）。

6。术后管理

1. 卡洛芬（5毫克/公斤），每天服用一次通过皮下注射液用于手术后疼痛缓解。
2. 手术后动物笼和维护热米安非他明类兴奋剂，直到完全康复。
3. 监控动物每天两次，表现为疼痛和体重减轻。我们没有观察到毛的行为显示疼痛或减肥。

7。伤口的测量和处理

1. 每天可以测量伤口。
2. 诱导全身麻醉，用5％异氟醚气体（流速为1升/分钟），然后确保鼠标深感觉反射被抑制使用1-3％异氟醚。
3. 轻轻剥开闭塞敷料钳。
4. 手术使用的游标卡尺来测量伤口的直径。沿X，Y和Z轴（ 图2米-2°），以及以供将来参考的显微照片（ 图2p）的三个测量值的平均值。
5. 可选:在这个时候，可以评估的动物的血液灌流，用激光多普勒成像仪（ 图2Q）。
6. 可以重新适用的治疗化合物的车辆控制的perforMED在这一点上。
7. 一个干净透明的包扎，然后再应用和动物保持温暖，直到完全康复。
8. 注:如果没有正确固定夹板，伤口会很容易收缩（2R图 ）。

8。组织学分析

1. 安乐死过量的麻醉小鼠后10天。
2. 使用镊子和，手术刀刀片去除缝线，并仔细剥离夹板。
3. 使用虹膜剪创建一个宽，全切除伤口区域周围和下孵育组织中的4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水（PBS），在4℃下过夜。
4. 组织转移到17％蔗糖的PBS溶液中的另外24小时，在4℃，然后除去多余的溶液在-80℃下通过仔细地涂抹在OCT化合物中，冷冻的组织和地点
5. 苏木精和伊红染色，可以使用可视化的卷绕结构和上皮缺口。 Neovascularisation免疫组化分析，可以评估的数量来确定的毛细血管（血管性血友病因子）。

结果

甲伤口闭合曲线确定伤口的平均直径，通过计算和表达的结果的百分比， 即 100 - （0天的直径/天×直径）。在这个实验中的治疗化合物（或车辆用控制）每天施加到伤口。的治疗化合物大大加速伤口闭合（ 图3）。重要的是要注意，夹板必须维持的持续时间的实验，去除夹板会导致伤口迅速收缩（ 图2R）和伤口愈合的人类中观察到的模式偏离。

讨论

这是一个实验小鼠模型皮肤伤口愈合。在此模型中阿显着的特征是利用硅胶夹板，以防止伤口收缩，使再上皮化，形成新的组织，可能会发生，类似的过程发生在人类。此模型是通用的，可以用来评估在生理和病理（ 如糖尿病）的设置的伤口愈合。该模型也可使用在一种经济的环境中，以评估潜在的伤口愈合或血管生成疗法。每个鼠标作为自己的控制，动物数量最小化。此模型所需的外科...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986