Modelo Murino de Cicatrização

Resumo

Um modelo murino de cicatrização de feridas cutâneas que podem ser utilizados para avaliar compostos terapêuticos em contextos fisiológicos e patológicos.

Resumo

A cicatrização de feridas e reparação são os processos biológicos mais complexas que ocorrem na vida humana. Após lesão, múltiplos caminhos biológicos se tornam ativadas. Cicatrização de feridas prejudicada, o que ocorre em pacientes diabéticos, por exemplo, pode levar a resultados desfavoráveis ​​graves, como amputação. Existe, portanto, um impulso crescente de desenvolver novos agentes que promovem a cicatrização de feridas. O teste destes foi limitado a grandes modelos animais, tais como porcos, os quais são muitas vezes impraticável. Ratos representam o modelo pré-clínico ideal, uma vez que são económicos e passíveis de manipulação genética, a qual permite uma investigação mecanicista. No entanto, a cicatrização de feridas num ratinho é fundamentalmente diferente da dos seres humanos, uma vez que ocorre primeiramente através de contração. O nosso modelo murino supera esta incorporando uma tala em torno da ferida. Por imobilização da ferida, o processo de reparação é, então, dependentes de epitelização, proliferação celular e angiogênese, que de perto espelhar aprocessos biológicos de cicatrização de feridas humanas. Embora requerendo consistência e cuidado, este modelo murino não envolvem técnicas cirúrgicas complicadas e permite o teste de agentes promissores robusta que pode, por exemplo, promover a angiogénese ou inibir a inflamação. Além disso, cada rato actua como o seu próprio controlo de duas feridas são preparados, possibilitando a aplicação de tanto o composto de teste e o veículo de controlo no mesmo animal. Em conclusão, foi demonstrado um modelo prático, fácil de aprender e robusta de cicatrização da ferida, o que é comparável com a dos seres humanos.

Introdução

Cicatrização de feridas prejudicada é responsável pela morbidade e mortalidade em todo o mundo significativo, isto é particularmente verdadeiro para pessoas que sofrem de diabetes mellitus ^1,2. Nos seres humanos, a cicatrização de feridas é um processo contínuo de processos, em que há sobreposição significativa ^3. Imediatamente seguintes processos ferindo, inflamatórias são iniciadas. As células inflamatórias liberam fatores que incentivam os processos de proliferação celular, migração e angiogênese. Depois de re-epitelização e formação de tecido novo, há uma fase de remodelação, que implica tanto a apoptose ea re-organização das proteínas da matriz, como o colágeno.

A complexidade da cicatrização da ferida não pode actualmente ser replicado in vitro, e isto requer o uso de modelos animais. Até à data, os estudos de cicatrização de feridas têm-se limitado a modelos grandes animais, tais como porcos, para assegurar que os processos de cura são equivalentes e comparáveis ​​aos seres humanos. No entanto, usando o grande animals de tais estudos pode ser difícil para a casa e nem sempre são ⁴ prático. O rato de laboratório representa um modelo animal económico que pode ser facilmente manipulado geneticamente para investigação mecanicista ^5-7. No entanto, as feridas cicatrizar murino diferente ao ser humano, principalmente devido ao processo de contracção ^8. Isto é, em parte, devido a uma grande camada de músculo estriado subcutânea chamado o panículo carnoso que é praticamente ausente em humanos. Em ratinhos, esta camada muscular permite que a pele se mover independentemente dos músculos profundos e é responsável pela rápida contracção da pele a seguir ferimento.

Para superar esta limitação, a cicatrização de feridas de murino pode ser adaptado para replicar a cicatrização de feridas humana por utilização de uma tala (Figura 1) ^8,9. Neste vídeo demonstramos o modelo murino ferida splinted que elimina a contração da ferida e mais se aproxima dos processos humanos de re-epithelialização e formação de tecido novo. Neste modelo, duas excisões de espessura total, que incluem o panículo carnoso são criadas no dorso, uma em cada lado da linha média do rato. A tala de silicone é colocado em torno da ferida, com o auxílio de adesivo e, em seguida, a tala protegido com suturas interrompidas. Cada rato actua como o seu próprio controlo, com uma ferida a receber tratamento e do outro veículo de controlo, reduzindo assim o número de animais. Após aplicações tópicas, um curativo oclusivo transparente é aplicada. O penso pode ser removido quando necessário para outras aplicações tópicas e / ou para a medição da área da ferida ^10,11. Após a conclusão de experiências, o fechamento da ferida, a arquitectura morfológica e grau da neovascularização pode ser avaliada por imuno-histoquímica. Este económico e fácil de realizar modelo também pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas, no contexto da diabetes mellitus ou outros pathophysiologies.

Protocolo

1. Preparação de talas e curativos oclusivos

1. Esboço 10 círculos mm em 0,5 milímetros de espessura folhas de silicone e usar uma tesoura ou um soco biópsia para criar discos de silicone.
2. Centro de uma biópsia de punção 5 mm no centro do círculo de 10 mm e pressiona firmemente para criar um orifício para formar um "doughnut" semelhante a disco que irá ser utilizada como uma tala.
3. Esboço 10 círculos milímetros em um curativo oclusivo transparente como Opsite e usar a tesoura para criar curativos circulares.

2. Animais Experimentais

1. Obter a aprovação do Comitê de Ética Animal para todos os experimentos que serão realizados.
2. Use 8 semanas de idade (22-26 gramas) camundongos C57BL/6J machos de um criador comercial (por exemplo, os laboratórios Jackson).
3. Manter ratinhos em condições-padrão de 21 ° C e uma hora ciclo claro-escuro de 12, com livre acesso a comida e água.
4. (Opcional): A diabetes pode ser induzida em 6 a 7 semanas de idade por um bolus intraperitoneal injecção de 165 mg / kg de estreptozotocina (em tampão citrato, pH 4,5), com hiperglicemia confirmada pelo monitoramento de glicose no sangue regular (accuchek glicosímetro). Camundongos diabéticos podem ter poliúria e por isso a sua cama pode necessitar ser alterado com mais freqüência para eliminar a umidade e seus pesos devem ser cuidadosamente monitorizados.

3. Anestesia e Preparação operativo

1. Induzir a anestesia geral, utilizando 5% de isoflurano em 100% de oxigénio (caudal de 1 L / min) e manter a anestesia utilizando 1-3% de isoflurano.
2. Garantir os reflexos profundos pedal do mouse são suprimidas e coloque o mouse na posição prona.
3. Preparar a região operativa através da remoção da pele com cortadores a partir da base do pescoço, a 3 cm na parte inferior da volta e entre as duas omoplatas.
4. A aplicação de luz de creme depilatório pode ser aplicado durante o período de 2 min. Compressas de gaze molhada pode ser utilizado para garantir que todo o creme e pele remanescente é removido.
5. Limpe a pele com umalgodão embebido em álcool e duas aplicações de 10% iodopovidona (Betadine) e armar o mouse.

4. Excisão e Splinting de Wound

1. Representação esquemática do modelo de cicatrização de murino é apresentada na Figura 1.
2. Usar uma solução estéril 4 milímetros biópsia de apresentar dois padrões circulares para a ferida em ambos os lados da linha média do rato ao nível dos ombros (ver as figuras 2a-2b).
3. Utilização fórceps serrilhados para levantar a pele, no meio do contorno da íris e tesouras para criar uma ferida de espessura total, que se prolonga através do tecido subcutâneo (Figuras 2c-2d), incluindo o panículo carnoso (figura 2e) e, em especial sobre o consumo da parte circular de tecido.
4. Repita o processo para a ferida do outro lado da linha média (Figura 2f).
5. Remover o revestimento protector plástico de cada lado da tala de silicone.
6. Aplicar cyanoacrylate adesiva (por exemplo, Super Cola ou Krazy Glue) para um lado de uma tala de silicone.
7. Centre a tala sobre a ferida (Figura 2g) e ancorar o splint com interrompidos 6-0 nylon para garantir o posicionamento (Figura 2h).
8. Repetir o processo de imobilização sobre a outra ferida.
9. Se necessário, neste ponto do tempo, aplicar o composto terapêutico a ser testado (até 100 ul) para uma ferida (Figura 2i), e o controlo do veículo para o outro.
10. Cobrir a ferida com uma compressa oclusiva transparente (por exemplo, Opsite) (Figura 2j-2k).
11. Uma régua é colocada abaixo das talas e uma fotomicrografia tomada (Figura 2d).

6. Gestão de pós-operatório

1. Carprofeno (5 mg / kg) é administrado uma vez por dia por meio de injecção sub-cutânea para o alívio da dor pós-operatória.
2. Após a cirurgia, os animais são colocados em gaiolas individuais e mantidos sob calor mats até que esteja totalmente recuperado.
3. Monitorar os animais duas vezes por dia para as manifestações de dor e perda de peso. Não observamos aspectos comportamentais graves de dor ou perda de peso.

7. Medição e Tratamento de Feridas

1. A ferida pode ser medido diariamente.
2. Induzir a anestesia geral, utilizando 5% de gás isoflurano (caudal de 1 L / min), e depois assegurar os reflexos profundos sensoriais do rato são suprimidas utilizando 1-3% de isoflurano.
3. Delicadamente descascar o curativo oclusivo com uma pinça.
4. Use pinças cirúrgicas para medir o diâmetro da ferida. Tomamos a média de três medições ao longo de X, Y e Z (Figuras 2m-2o), bem como uma fotomicrografia para futura referência (Figura 2p).
5. Opcional: Neste momento o animal pode ser avaliada para a perfusão de sangue através de um gerador de imagens Doppler a laser (figura 2q).
6. Re-aplicação do composto terapêutico e do controlo do veículo pode ser desemmed neste momento.
7. Um curativo oclusivo transparente limpo é então re-aplicado e os animais mantidos aquecidos até que esteja totalmente recuperado.
8. Nota: se talas não são protegidos adequadamente a ferida será prontamente contratar (Figura 2R).

8. Análise Histológica

1. Eutanásia dos ratos após 10 dias, com uma overdose de anestesia.
2. Utilizando uma pinça e uma lâmina de bisturi remover as suturas e cuidadosamente descascar a tala.
3. Use uma tesoura íris para criar uma largura, a excisão completa em torno e sob a área da ferida e incubar o tecido em 4% de paraformaldeído em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante a noite.
4. Transferência de tecido para 17% de sacarose na solução de PBS durante mais 24 horas a 4 ° C, em seguida, remover o excesso de solução, esfregando cuidadosamente sobre o tecido e em lugar outubro composto e congelar a -80 ° C.
5. Hematoxilina-eosina pode ser utilizado para visualizar a estrutura da ferida e gap epitelial. Neovascularisation pode ser avaliada por análises de imuno-histoquímica para determinar o número de capilares (utilizando o factor de von Willebrand).

Resultados

Uma curva de encerramento da ferida é determinada através do cálculo da média do diâmetro da ferida e expressando os resultados como uma percentagem, ou seja, 100 - (Dia 0 diâmetro / diâmetro Dia X). Nesta experiência, um composto terapêutico (ou de controlo do veículo) foi aplicada diariamente à ferida. O composto terapêutico fechamento da ferida grandemente acelerada (Figura 3). É importante notar que as talas devem ser mantidos durante o período de ensaio, como a remoção de t...

Discussão

Este é um modelo experimental murino de cicatrização de feridas cutâneas. Uma característica importante deste modelo é o uso de tampões de silicone para evitar a contracção da ferida de modo que pode ocorrer a re-epitelização e formação de tecido de novo, tornando-se o processo semelhante ao que ocorre em seres humanos. Este modelo é versátil e pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas em ambientes fisiológicos e patológicos (por exemplo, diabetes mellitus). O modelo pode tamb...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986