نموذج من تسريب المغذيات المزمنة في الفئران

Summary

يوصف بروتوكول للدفعات المزمن من الجلوكوز وIntralipid في الفئران. هذا النموذج يمكن استخدامه لدراسة تأثير المغذيات الزائدة على وظيفة الجهاز والمعلمات الفسيولوجية.

Abstract

فإنه يفترض التعرض المزمن لمستويات مفرطة من المغذيات تؤثر على وظيفة من عدة أعضاء وأنسجة والإسهام في تطوير العديد من المضاعفات المرتبطة بالسمنة ومتلازمة التمثيل الغذائي، بما في ذلك السكري من النوع 2. لدراسة الآليات التي مستويات مفرطة من الجلوكوز والأحماض الدهنية تؤثر على البنكرياس خلايا بيتا وإفراز الأنسولين، أنشأنا نموذجا ضخ المواد الغذائية المزمنة في الفئران. يتكون هذا الإجراء من القسطرة في الوريد الوداجي الأيمن والشريان السباتي الأيسر تحت التخدير العام، والسماح فترة النقاهة لمدة 7 أيام؛ ربط القسطرة إلى مضخات باستخدام قطب ونظام موازنة التي تمكن الحيوان من التحرك بحرية في القفص، وغرس الجلوكوز و / أو Intralipid (مستحلب زيت فول الصويا الذي يولد خليط من ما يقرب من 80٪ unsaturated/20٪ الأحماض الدهنية المشبعة عندما غرست مع الهيبارين) لمدة 72 ساعة. هذا النموذج يقدم عدة ADVANTAغيس، بما في ذلك إمكانية لتعديل ناعما المستويات المستهدفة لتعميم الجلوكوز والأحماض الدهنية، وخيار المشاركة في ضخ المركبات الدوائية، والإطار الزمني قصير نسبيا بالمقارنة مع النماذج الغذائية. ويمكن استخدامه لدراسة آليات الخلل الناجم عن المغذيات في مجموعة متنوعة من الأجهزة واختبار فعالية الأدوية في هذا السياق.

Introduction

وقد اقترحت مستويات مرتفعة مزمنة من الجلوكوز والدهون في الدورة الدموية إلى المساهمة في التسبب في مرض السكري نوع 2 عن طريق تغيير وظيفة من عدة أجهزة المتورطين في الحفاظ على توازن الجلوكوز بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، والبنكرياس خلايا بيتا (مراجعة في ^1). وتذهب فرضية أن glucotoxicity ارتفاع السكر في الدم المزمن يؤدي إلى تفاقم الخلل خلايا بيتا التي أدت إلى ارتفاع السكر في الدم في المقام الأول، وبالتالي خلق حلقة مفرغة، والمساهمة في تدهور السيطرة على مستويات الجلوكوز في نوع 2 مرضى السكري. وعلى نحو مماثل، يقترح فرضية glucolipotoxicity أن الارتفاعات ما يصاحب ذلك من مستويات الجلوكوز والدهون، وغالبا ما لوحظ في مرض السكري من النوع 2، تضر خلايا بيتا.

فك رموز الآليات الخلوية والجزيئية من الآثار الضارة من المواد الغذائية مرتفعة بشكل مزمن في البنكرياس وظيفة خلايا بيتا هو المفتاح لunderstandiنانوغرام من التسبب في مرض السكري من النوع 2 ^1. تحقيقا لهذه الغاية، وعدد كبير من الدراسات التي بحثت آليات المغذيات الزائدة المزمنة فيفو السابقين في الجزر المعزولة لانجرهانز في المختبر أو في النسيلي، خطوط الخلايا إفراز الانسولين. ومع ذلك، وترجمة النتائج التي تم الحصول عليها في هذه النظم نموذج للكائن الحي كله المعقدة، ولا سيما لأن تركيزات الأحماض الدهنية المستخدمة في الخلايا المستزرعة أو الجزر نادرا ما تتطابق مع مستويات تداولها في المنطقة المجاورة للخلايا بيتا في الجسم الحي ^2. من ناحية أخرى، وقد تم فحص آليات فشل خلايا بيتا في استجابة لزيادة المغذيات في نماذج القوارض من مرض السكري، كما يتضح من زوكر السكري الفئران الدهنية ^3،4، ويربوع Psammomys obesus ⁽⁵⁾ وعالية من الدهون نظام غذائي بنك الاحتياطي الفيدرالي الماوس ^6. هذه النماذج، ومع ذلك، تتميز حالات الشذوذ الأيضي الجوهرية وليست قابلة بسهولة للتلاعب من الجلوكوز في الدمو / أو مستويات الدهون في وضع أكثر سيطرة وأقل المزمنة. لتكون قادرة على تغيير تعميم مستويات المغذيات في إطار زمني من الأيام في الحيوانات العادية خلاف ذلك، قمنا بتطوير نموذج التسريب المزمنة في الفئران العادية والتي تمكننا من دراسة آثار الدهون والجلوكوز، وحده أو في الجمع، وعلى المعلمات الفسيولوجية وظيفة ^7،8.

Protocol

لمحة عامة: الإجراء يتكون من القسطرة في الوريد الوداجي الأيمن والشريان السباتي الأيسر تحت التخدير العام، والسماح فترة النقاهة لمدة 7 أيام؛ ربط القسطرة إلى مضخات باستخدام قطب ونظام موازنة التي تمكن الحيوان من التحرك بحرية في القفص؛ وغرس الجلوكوز و / أو Intralipid (مستحلب زيت فول الصويا الذي يولد خليط من ما يقرب من 80٪ unsaturated/20٪ الأحماض الدهنية المشبعة عندما غرست مع الهيبارين ⁹⁾ لمدة 72 ساعة.

1. Canulation من حبل الوريد الأيمن والشريان السباتي الأيسر

1. تعقيم الأدوات الجراحية. يجب أن تكون أنابيب Canulation أيضا الباردة تعقيمها باستخدام عامل تعقيم السائل (2.6٪ غلوتارالدهيد) قبل الإجراء. تزج الأنبوب في حاوية تعقيمها ل16-24 ساعة. شطف ومسح جيدا بالماء المقطر المعقم لإزالة كل آثار غلوتارالدهيد قبل الاستخدام.
2. وزن الفئران على حسابجرعات المخدرات:
   كاربروفين 5 ملغ / كغ: التخفيف 1/10 = وزن الجسم (ز) × 0.001 مل SC (مسكن)
   غليكوبيرولات 0.01 مغ / كغ: التخفيف 1/10 = BW (ز) X 0.0012 مل SC (مضادات الكولين)
3. تخدير الفئران باستخدام isoflurane والأكسجين و.
4. وضع فأر على بطنه. حلاقة المنطقة خلف الأذنين إلى قاعدة الكتفين. وضع فأر على ظهرها. حلاقة المنطقة تحت الرقبة إلى الجبهة الكفوف.
5. الإعدادية على موقع الجراحية بالكلورهيكسيدين، والكحول، واليود. إدارة المخدرات.
6. نقل الفئران إلى الميدان الجراحية.
7. باستخدام تقنية العقيم، canulate حبل الوريد اليمين واليسار الشريان السباتي مع قنية PE-50 تعلق على حقنة 1 مل مليئة 5 U من المياه المالحة heparinized. مسح canulas مع 50 U من المياه المالحة heparinized لتجنب تخثر خلال فترة النقاهة. استخدام الإبر 23G اضعافها. إغلاق كل قنية مع دبوس 23G.
8. بعد الجراحة، وتقليم حوالي 2.5 ملم قبالةالقواطع السفلية ومكان الفئران في سترة التسريب لمنع canulas من اكلتها.
9. توفير الأوكسجين (1 لتر / دقيقة لمدة 10 دقيقة) للمساعدة في اجلاء isoflurane و.
10. وضع الفئران في قفص ساخنة حتى يكون مستيقظا تماما.
11. تشغيل أربعة الفئران لاستخدام واحد في حالة التسريب (الجدول 1).

2. العناية بعد الجراحة (العلاج بعد العمليات الجراحية والقسطرة من اتصال)

1. وزن الفئران في يوم 1 و 2 يوم بعد الجراحة.
2. إدارة غليكوبيرولات (BW (ز) × 0.00048 ML) SC مرتين في يوم 1 بعد الجراحة ومرة ​​واحدة في اليوم 2 بعد الجراحة.
3. يمكن أن تدار العلاجات إضافية داعمة إذا لزم الأمر: السوائل، وسادة التدفئة، والنظام الغذائي الرطب، والعلاج الأوكسجين، المسكنات، مضادات الكولين.
4. في يوم 7 بعد الجراحة، وزن الفئران لحساب معدلات التدفق للتسريب.
5. ربط كل فأر إلى نظام التسريب باستخدام حبل وقطب التي شنت على قفص شواء الأعلى (الشكل 1).
6. مسح canulas مع 5 U من المياه المالحة heparinized لإزالة جلطات. مسح canulas مرة أخرى مع 50 U من المياه المالحة heparinized لمنع تخثر الدم.
7. السماح للفئران حتى يتأقلم على حبل وقطب لمدة 24 ساعة على الأقل قبل بدء التسريب.

3. صب

1. رسم 0.15 مل من الدم من الشريان السباتي من كل الفئران سكر الدم وقياس. مسح canulas الوداجي. استخدام 50 U من المياه المالحة heparinized لمنع تخثر في كلا canulas من كل فأر.
2. نقل عينة الدم إلى مل أنبوب جمع 0.5 تحتوي على 2٪ EDTA. الطرد المركزي في 10،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة وتجميد البلازما عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3. ملء اثنين من المحاقن 60 مل لكل من ظروف التسريب المدرجة أدناه. مكان الحقنة 1 على موقف الجبهة من المضخة والحقنة 2 مكان على موقف الخلفي من المضخة.
4. تاريخ كل زوج من الحلول معا مع Y-الموصلات وCO-EX أنابيب T22 التي تم تعقيمها. وضع الحقن على هارفارد 33ضخ حقنة المزدوج.
5. تغيير أسفل القفص، وإزالة جميع المواد الغذائية من القفص شواء الأعلى.
6. تزن 150 غرام من معيار تشو ووضعت على القفص شواء الأعلى.
7. توصيل الحقن إلى قطب على استجواب القفص. تدفق الحقن بشكل صحيح لإزالة الهواء المحبوس من خطوط.
8. حساب معدلات تدفق التسريب باستخدام وزن الجسم التي تم اتخاذها قبل توصيل الفئران لنظام التسريب. وتحسب معدلات مع ملف Microsoft Excel الذي يحول معدل ضخ الجلوكوز (جير) في مل / ساعة.
9. تعيين مضخة لإدارة معدلات تدفق لمدة 60 مل المحاقن وفقا للإعدادات الشركة المصنعة. أدخل سعر للحقنة 1 (حقنة الجبهة) وبسعر لالحقنة 2 (حقنة الظهر).
10. بدء ضخ.

4. الرصد

1. بعد بدء تشغيل المضخة، تحقق من أنه لا يوجد أي تسرب من قطب أو من canulas وغير الملتوية التي أنابيب التسريب. تحقق أيضا من عدم وجود فقاعات الهواء فيالأنبوب.
2. بعد 3 ساعة من الحقن، أخذ عينة الدم لمراقبة سكر الدم. كرر بعد 6، 24، 48، و 72 ساعة من الحقن في الوريد. وكإجراء وقائي، يتم مراقبة سكر الدم أيضا بعد 30، 34، 54، و 60 ساعة من الحقن في الوريد. نسبة الجلوكوز في الدم ويمكن قياسها باستخدام قطرة واحدة من الدم الكامل باستخدام جهاز الجلوكوز المحمولة. هذا يحد من كمية الدم المسحوب خلال التسريب وبالتالي يتجنب إحداث تغييرات كبيرة حجم الدم و / أو الهيماتوكريت.
3. يتم تعديل معدل للحقنة 1 على أساس القيم سكر الدم للحفاظ على مستوى السكر في الدم في 220-250 ملغ / دل. معدل لالحقنة 2 لا يتغير خلال ساعة 72 من التسريب لأنه يتم الحفاظ على الأحماض الدهنية الحرة في 1 مليمول / لتر.
4. يتم إقران ظروف التسريب بحيث حجم ردت للحيوانات مراقبة ما يعادل حجم ردت للحيوانات الاختبار (الجدول 1).
5. بعد 24 ساعة من الحقن، تغيير أسفل القفص وتزن المتبقية في قفص شواء الطعام. العودة الجزء ر غير مأكوليا شواء القفص. كرر بعد 48 ساعة.
6. المحاقن عبوة يوميا حسب الحاجة خلال ساعة 72 من التسريب.
7. خلال التسريب، دائما مراقبة الفئران لأي علامات الالتهاب أو عدم الراحة. إدارة الرعاية المناسبة إذا لزم الأمر.

5. القتل الرحيم بعد التسريب

1. بعد 72 ساعة من الحقن، الفئران هي تخدير في الوريد مع 0.5 مل من كوكتيل الكيتامين / زيلازين (182 ملغم / كغم من الكيتامين و 11.6 ملغم / كغم من زيلازين المخفف 01:02 مع 0.9٪ كلوريد الصوديوم).
2. يتم استخدام منعكس أخمص القدمين قرصة للتحقق من مستوى التخدير. يدار مخدر إضافية حسب الحاجة.
3. عندما الفئران هو تخدير، يتم فتح تجويف البطن مع مقص جراحي. وexsanguinated الفئران عن طريق رسم 10-15 مل من الدم في حقنة من الشريان الأورطي أو الوريد الأجوف.

النتائج

للخروج من سلسلة من 42 الفئران التي خضعت لعملية جراحية، قد فقدت 5 الفئران خلال فترة ما بعد الجراحة، وكان خسر 1 الفئران خلال التسريب، وهو ما يمثل نسبة النجاح الإجمالية 86٪. وكان متوسط ​​وزن الجسم للفئران 37 التي تم غرست في نهاية المطاف 608 ± 5 ز قبل الجراحة و 588 ± 6 غرام عند الش...

Discussion

ورغم أن عددا من الدراسات السابقة قد استخدمت الحقن المزمن من الجلوكوز (مثلا ^10-15) أو الدهون (مثل ^16،17) في القوارض، على حد علمنا قد فقط تم الإبلاغ عن ضخ المؤتلفة لكل من الوقود في الفئران ^18. نموذج التسريب المزمنة المقدمة هنا تقدم العديد من المزايا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602