Un modello del Chronic Infusion nutrienti nel ratto

Riepilogo

Un protocollo per infusioni cronici di glucosio e Intralipid nei ratti è descritto. Questo modello può essere utilizzato per studiare l'impatto di un eccesso di nutrienti in funzione degli organi e dei parametri fisiologici.

Abstract

Esposizione cronica a livelli eccessivi di nutrienti è postulata a pregiudicare la funzione di diversi organi e tessuti e per contribuire allo sviluppo delle molte complicazioni associate con l'obesità e la sindrome metabolica, compreso il diabete di tipo 2. Per studiare i meccanismi con cui livelli eccessivi di glucosio e acidi grassi influenzano la beta pancreatiche cellule e la secrezione di insulina, abbiamo stabilito un modello infusione di sostanze nutrienti cronica nel ratto. La procedura consiste di cateterizzazione della vena giugulare destra e sinistra arteria carotide in anestesia generale; consentendo un periodo di recupero di 7 giorni; collega i cateteri alle pompe utilizzando una girevole e sistema di contrappesi che consente all'animale di muoversi liberamente nella gabbia; ed infondendo glucosio e / o Intralipid (un'emulsione di olio di soia che genera una miscela di circa 80% unsaturated/20% di acidi grassi saturi quando infuso con eparina) per 72 hr. Questo modello offre diversi vantagGES, compresa la possibilità di modulare finemente i livelli target di glucosio circolante e di acidi grassi, la possibilità di co-infusione composti farmacologici, e il lasso di tempo relativamente breve rispetto a modelli alimentari. Può essere usato per esaminare i meccanismi della disfunzione nutrienti indotta in una varietà di organi e testare l'efficacia dei farmaci in questo contesto.

Introduzione

Livelli cronicamente elevati di glucosio e lipidi in circolo sono state proposte per contribuire alla patogenesi del diabete di tipo 2 alterando la funzione dei vari organi implicati nel mantenimento dell'omeostasi del glucosio compreso, ma non limitato a, il pancreas cellule beta (recensione in ^1). Le ipotesi postula glucotossicità che l'iperglicemia cronica aggrava il difetto delle cellule beta che ha dato origine alla iperglicemia, in primo luogo, creando così un circolo vizioso e contribuendo al deterioramento del controllo glicemico nei pazienti con diabete di tipo 2. Allo stesso modo, l'ipotesi glucolipotoxicity propone che aumenti concomitanti dei livelli di glucosio e di lipidi, come spesso osservati nel diabete di tipo 2, sono dannosi per la cellula beta.

Decifrare i meccanismi cellulari e molecolari degli effetti deleteri di nutrienti cronicamente elevati di funzionalità delle cellule beta del pancreas è la chiave per il understanding della patogenesi del diabete di tipo 2 ^1. A tal fine, un gran numero di studi hanno esaminato i meccanismi della cronica nutrienti in eccesso ex vivo in isole di Langerhans isolate o in vitro in linee cellulari clonali, secernono insulina. Tuttavia, la traduzione dei risultati ottenuti in questi sistemi modello per l'intero organismo è complesso, in particolare perché le concentrazioni di acidi grassi utilizzati in cellule coltivate o isolotti raramente corrispondono i livelli circolanti nelle vicinanze delle cellule beta in vivo ^2. D'altra parte, i meccanismi di guasto beta-cellula in risposta ad eccesso di nutrienti sono stati esaminati in modelli di roditori di diabete, come esemplificato dal ratto Zucker Diabetic Fatty ^3,4, il gerbillo Psammomys obesus ⁵ e l'alta percentuale di grassi dieta- fed del mouse ^6. Questi modelli, tuttavia, sono caratterizzati da intrinseche anomalie metaboliche e non sono facilmente suscettibili di manipolazioni di glicemiae / o livelli di lipidi in un ambiente più controllato e meno cronica. Per essere in grado di alterare i livelli circolanti di nutrienti in un lasso di tempo di giorni in animali altrimenti normali, abbiamo sviluppato un modello di infusione cronica in ratti normali che ci permette di esaminare gli effetti di lipidi e del glucosio, da soli o in combinazione, su parametri fisiologici e funzionali ^7,8.

Protocollo

Sommario: La procedura consiste cateterizzazione della vena giugulare destra e sinistra arteria carotide in anestesia generale; consentendo un periodo di recupero di 7 giorni; collega i cateteri alle pompe utilizzando una girevole e sistema di contrappesi che consente all'animale di muoversi liberamente nella gabbia; e infondendo glucosio e / o Intralipid (un'emulsione di olio di soia che genera una miscela di circa 80% unsaturated/20% di acidi grassi saturi quando infuso con eparina ⁹⁾ per 72 hr.

1. Canulation della Vena giugulare destra e l'arteria carotide sinistra

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici. Canulation tubazione deve essere sterilizzato a freddo usando un agente sterilizzante liquido (2,6% glutaraldeide) prima della procedura. Immergere il tubo in un contenitore sterilizzato per 16-24 ore. Risciacquare e lavare abbondantemente con acqua distillata sterile per rimuovere tutte le tracce di glutaraldeide prima dell'uso.
2. Pesare il ratto per calcolaredosaggi di farmaci:
   Carprofene 5 mg / kg: diluizione 1/10 = Peso corporeo (g) x 0.001 ml SC (analgesico)
   Glicopirrolato 0,01 mg / kg: diluizione 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (anticolinergici)
3. Anestetizzare il ratto utilizzando isoflurano e ossigeno.
4. Posizionare il topo sul suo stomaco. Radere la zona dietro le orecchie alla base delle spalle. Posare il ratto sulla sua schiena. Radersi la regione sotto il collo per le zampe anteriori.
5. Preparazione del sito chirurgico con clorexidina, alcol e iodio. Somministrare farmaci.
6. Trasferire il ratto al campo chirurgico.
7. Utilizzando una tecnica asettica, canulate vena giugulare destra e l'arteria carotide sinistra con una cannula PE-50 attaccato ad una siringa da 1 ml riempita con 5 U di soluzione fisiologica eparinizzata. Lavare le cannule con 50 U di soluzione fisiologica con eparina per evitare la coagulazione durante il periodo di recupero. Utilizzare aghi 23G smussati. Chiudere ogni cannula con un perno 23G.
8. Dopo l'intervento chirurgico, tagliare circa 2,5 mm dalincisivi inferiori e il luogo del ratto in una giacca di infusione per evitare che le cannule da essere mangiato.
9. Fornire ossigeno (1 L / min per 10 minuti) per aiutare evacuare isoflurano.
10. Collocare il ratto in una gabbia riscaldata finché non è completamente sveglio.
11. Operare quattro ratti di utilizzare uno per condizione infusione (Tabella 1).

2. Assistenza post-operatoria (trattamento post-chirurgico e di collegamento dei cateteri)

1. Pesare i ratti al giorno 1 e giorno 2 post-chirurgico.
2. Somministrare glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC due volte al giorno 1 post-chirurgico e una volta il giorno 2 post-chirurgico.
3. Ulteriori trattamenti di supporto possono essere somministrati se necessario: liquidi, rilievo di riscaldamento, la dieta umida, ossigenoterapia, analgesici, anticolinergici.
4. Il giorno 7 post-chirurgia, pesare i topi per calcolare le portate per infusione.
5. Collegare ogni ratto di un sistema di infusione con un laccio e girevole montata su un grill da gabbia (Figura 1).
6. Lavare le cannule con 5 U di soluzione fisiologica con eparina per rimuovere i coaguli. Lavare le cannule, una volta di più con 50 U di soluzione fisiologica con eparina per prevenire la coagulazione.
7. Lasciare i ratti si adatti al laccio e girevole per almeno 24 ore prima di iniziare l'infusione.

3. Infusione

1. Disegnare 0,15 ml di sangue dalla carotide di ciascun ratto e misurare glicemia. Lavare le cannule giugulari. Utilizzare 50 U di soluzione fisiologica con eparina per prevenire la coagulazione sia cannule di ogni ratto.
2. Trasferire il campione di sangue di un tubo di raccolta ml 0,5 contenente il 2% di EDTA. Centrifugare a 10.000 rpm per 2 min e congelare il plasma a -20 ° C.
3. Riempire due siringhe 60 ml per ciascuna delle condizioni di infusione sotto elencate. Siringa 1 posto sulla posizione anteriore della pompa e siringa 2 posto sulla posizione posteriore della pompa.
4. Unisciti a ogni coppia di soluzioni con y-connettori e CO-EX tubi T22 che è stato sterilizzato. Mettere le siringhe su un Harvard 33doppia pompa siringa.
5. Modificare il fondo della gabbia e rimuovere tutti gli alimenti alla griglia superiore della gabbia.
6. Pesare 150 g di cibo standard e posto sulla griglia superiore della gabbia.
7. Collegare le siringhe per la girella sulla griglia della gabbia. Lavare le siringhe correttamente per rimuovere l'aria intrappolata dalle linee.
8. Calcolare le portate di infusione utilizzando il peso corporeo che è stata presa prima di collegare il ratto al sistema di infusione. Le tariffe sono calcolate con un file di Microsoft Excel che converte il tasso di infusione di glucosio (GIR) in ml / h.
9. Impostare la pompa per amministrare le portate per 60 ml siringhe in base alle impostazioni del produttore. Inserire il tasso di siringa 1 (siringa anteriore) e il tasso per siringa 2 (torna siringa).
10. Avviare la pompa.

4. Monitoraggio

1. Dopo aver avviato la pompa, verificare che non vi sia fuoriuscita dalla girevole o dalle cannule e tubi di infusione non sia attorcigliata. Verificare inoltre che non vi siano bolle d'aria nelil tubo.
2. Dopo 3 ore di infusione, prelevare un campione di sangue per monitorare la glicemia. Ripetere dopo 6, 24, 48, e 72 ore di infusione. Per precauzione, glicemia viene monitorato anche dopo 30, 34, 54, e 60 ore di infusione. Glucosio nel sangue può essere misurata usando una goccia di sangue intero utilizzando un monitor portatile glucosio. Questo limita la quantità di sangue prelevato durante l'infusione e quindi evita alterare significativamente il volume del sangue e / o ematocrito.
3. Il tasso per siringa 1 è modificato sulla base di valori di glicemia a mantenere glicemia a 220-250 mg / dl. Il tasso di siringa 2 non cambia durante la 72 ore di infusione, perché gli acidi grassi liberi sono mantenuti a 1 mmol / L.
4. Condizioni di infusione sono accoppiati in modo che il volume ricevuto per gli animali di controllo è equivalente al volume ricevuto per gli animali di prova (Tabella 1).
5. Dopo 24 ore di infusione, cambiare il fondo gabbia e pesare il cibo che rimane nella griglia gabbia. Restituire la parte non mangiato tØ la griglia della gabbia. Ripetere dopo 48 ore.
6. Refill siringhe al giorno secondo necessità durante la 72 ore di infusione.
7. Durante l'infusione, osservare sempre il ratto per eventuali segni di infiammazione o di disagio. L'assistenza appropriata, se necessario.

5. Eutanasia post-infusione

1. Dopo 72 h di infusione, i ratti vengono anestetizzati per via endovenosa con 0,5 ml di un cocktail di ketamina / xilazina (182 mg / kg di ketamina e 11,6 mg / kg di xilazina diluito 1:2 con 0,9% NaCl).
2. Il riflesso toe-pinch viene utilizzato per verificare il livello di anestesia. Ulteriori anestetico viene somministrato come necessario.
3. Quando il ratto è anestetizzato, la cavità addominale viene aperto con forbici chirurgiche. Il ratto è dissanguato disegnando 10-15 ml di sangue in una siringa dalla aorta o la vena cava.

Risultati

Su una serie di 42 ratti che hanno subito un intervento chirurgico, 5 ratti sono stati persi durante il periodo post-operatorio e 1 ratto è stato perso durante l'infusione, con un tasso complessivo di successo del 86%. Il peso corporeo medio dei 37 ratti che sono stati poi infuse era 608 ± 5 g prima dell'intervento e 588 ± 6 g al di iniziare l'infusione (media ± SE, n = 37, p <0,0001 per paired t-test). I seguenti risultati rappresentativi sono stati ottenuti in due gruppi: infusione. Saline (SAL), e ...

Discussione

Sebbene un certo numero di studi precedenti hanno impiegato infusioni cronici di glucosio (ad esempio ^10-15) o lipidi (ad esempio ^16,17) nei roditori, a nostra conoscenza l'infusione combinata di entrambi i carburanti è stato riportato soltanto nei topi ^18. Il modello di infusione cronica qui presentato offre diversi vantaggi per studiare gli effetti sulla eccesso di nutrienti su una varietà di funzioni biologiche nei ratti. In primo luogo, esso non comporta rodit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602