Un modelo de infusión de nutrientes crónica en la rata

Resumen

Se describe un protocolo para infusiones de glucosa y crónicas Intralipid en ratas. Este modelo puede ser utilizado para estudiar el impacto del exceso de nutrientes en la función del órgano y los parámetros fisiológicos.

Resumen

Se postula la exposición crónica a niveles excesivos de nutrientes para afectar a la función de varios órganos y tejidos y para contribuir al desarrollo de las muchas complicaciones asociadas con la obesidad y el síndrome metabólico, incluyendo la diabetes de tipo 2. Para el estudio de los mecanismos por los que los niveles excesivos de glucosa y ácidos grasos afectan a la células beta pancreáticas y la secreción de la insulina, hemos establecido un modelo de infusión de nutrientes crónica en la rata. El procedimiento consiste en la cateterización de la vena yugular derecha y la arteria carótida izquierda bajo anestesia general; permitiendo un período de recuperación de 7 días, la conexión de los catéteres de las bombas utilizando un eslabón giratorio y el sistema de contrapeso que permite que el animal se mueva libremente en la jaula, y la infusión glucosa y / o Intralipid (una emulsión de aceite de soja que genera una mezcla de aproximadamente 80% unsaturated/20% de ácidos grasos saturados con infusión de heparina) durante 72 h. Este modelo ofrece varias AdvantaGES, incluyendo la posibilidad de modular finamente los niveles objetivo de glucosa y ácidos grasos circulantes; la opción de co-infundir compuestos farmacológicos, y el marco de tiempo relativamente corto en comparación con los modelos dietéticos. Puede ser utilizado para examinar los mecanismos de la disfunción de nutrientes inducida en una variedad de órganos y para probar la eficacia de los fármacos en este contexto.

Introducción

Se han propuesto los niveles crónicamente elevados de glucosa y lípidos en la circulación de contribuir a la patogénesis de la diabetes tipo 2 mediante la alteración de la función de varios órganos implicados en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa, incluyendo, pero no limitado a, la células beta pancreáticas (revisado en ^1). Las hipótesis postula que la hiperglucemia crónica glucotoxicidad agrava el defecto de las células beta, que dio lugar a la hiperglucemia, en primer lugar, creando así un círculo vicioso y contribuyendo al deterioro del control glucémico en pacientes con diabetes tipo 2. Del mismo modo, la hipótesis glucolipotoxicity propone que las elevaciones concomitantes de los niveles de glucosa y de los lípidos, como a menudo se observan en la diabetes tipo 2, son perjudiciales para la célula beta.

Descifrar los mecanismos celulares y moleculares de los efectos deletéreos de nutrientes crónicamente elevados sobre la función de las células beta pancreáticas es la clave para la understanding de la patogénesis de la diabetes tipo ¹ 2. Para ello, un gran número de estudios han examinado los mecanismos de exceso de nutrientes crónica ex vivo en islotes aislados de Langerhans o in vitro, en líneas celulares secretoras de insulina clonales. Sin embargo, la traducción de los resultados obtenidos en estos sistemas modelo para todo el organismo es compleja, en particular debido a que las concentraciones de ácidos grasos utilizados en células cultivadas o islotes raramente coinciden con los niveles circulantes en la vecindad de las células beta in vivo ^2. Por otro lado, los mecanismos de fallo de las células beta en respuesta al exceso de nutrientes se han examinado en modelos de roedores de la diabetes, como se ejemplifica en la rata Zucker Diabetic Fatty ^3,4, el jerbo Psammomys obesus ⁵ y la dieta alta en grasas- alimentados ratón ^6. Estos modelos, sin embargo, se caracterizan por anormalidades metabólicas intrínsecas y no son fácilmente susceptibles a las manipulaciones de la glucosa en sangrey / o los niveles de lípidos en un entorno más controlado y menos crónica. Para ser capaz de alterar los niveles circulantes de nutrientes en un plazo de días en los animales por lo demás normales, hemos desarrollado un modelo de infusión crónica en ratas normales que nos permite examinar los efectos de los lípidos y la glucosa, solo o en combinación, sobre los parámetros y la función fisiológica ^7,8.

Protocolo

Descripción general: El procedimiento consiste en la cateterización de la vena yugular derecha y la arteria carótida izquierda bajo anestesia general; permitiendo un período de recuperación de 7 días; conexión de los catéteres de las bombas utilizando un eslabón giratorio y el sistema de contrapeso que permite que el animal se mueva libremente en la jaula; y la infusión de la glucosa y / o Intralipid (una emulsión de aceite de soja que genera una mezcla de aproximadamente 80% unsaturated/20% de ácidos grasos saturados con infusión de heparina ⁹⁾ durante 72 horas.

1. Canulación de la vena yugular derecha y la arteria carótida izquierda

1. Esterilizar los instrumentos quirúrgicos. Tubo de canulación también debe ser esterilizada en frío utilizando un agente esterilizante líquido (2,6% de glutaraldehído) antes del procedimiento. Sumerja el tubo en un recipiente esterilizado en autoclave durante 16-24 horas. Aclarar y lavar con agua destilada estéril para eliminar todos los rastros de glutaraldehído antes de su uso.
2. Pesar la rata para calculardosis de los fármacos:
   El carprofeno 5 mg / kg: dilución 1/10 = Peso corporal (g) x 0.001 ml SC (analgésico)
   Glycopyrrolate 0,01 mg / kg: dilución 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml en SC (anticolinérgico)
3. Anestesiar la rata utilizando isoflurano y oxígeno.
4. Coloque la rata en su estómago. Afeitar el área detrás de las orejas a la base de los hombros. Coloque la rata en la espalda. Afeitarse la región bajo el cuello de las patas delanteras.
5. Preparación del sitio quirúrgico con clorhexidina, alcohol, y yodo. Administrar medicamentos.
6. Transferir la rata para el campo quirúrgico.
7. Utilizando una técnica aséptica, canulate la vena yugular derecha y la arteria carótida izquierda con un PE-50 cánula unida a una jeringa de 1 ml llena con 5 U de solución salina heparinizada. Lave las cánulas con 50 U de solución salina heparinizada para evitar la formación de coágulos durante el período de recuperación. Usar agujas 23G romos. Cierre cada cánula con un pasador de 23G.
8. Después de la cirugía, recorte de aproximadamente 2,5 mm de laincisivos inferiores y coloque la rata en una chaqueta de infusión para evitar que las cánulas de ser comido.
9. Proporcionar oxígeno (1 L / min durante 10 min) para ayudar a evacuar isoflurano.
10. Coloque la rata en una jaula caliente hasta que esté completamente despierto.
11. Utilice cuatro ratas de utilizar uno por condiciones infusión (tabla 1).

2. Cuidados después de la operación (Tratamiento post-quirúrgico y de conexión de los catéteres)

1. Pese a las ratas en el día 1 y el día 2 después de la cirugía.
2. Administrar glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC dos veces en el día 1 después de la cirugía y una vez en el día 2 después de la cirugía.
3. Tratamientos de apoyo adicionales se pueden administrar si es necesario: líquidos, el cojín de la calefacción, la dieta húmeda, oxigenoterapia, analgésicos, anticolinérgicos.
4. En el día 7 después de la cirugía, las ratas pesan para calcular las tasas de flujo de infusión.
5. Conectar cada rata para un sistema de infusión usando una correa de sujeción y giratorio montado en una tapa de parrilla de jaula (Figura 1).
6. Lave las cánulas con 5 U de solución salina heparinizada para eliminar los coágulos. Lave las cánulas una vez más con 50 U de solución salina heparinizada para evitar la coagulación.
7. Permitir que las ratas se aclimaten a la correa de sujeción y giro para por lo menos 24 horas antes de comenzar la infusión.

3. Infusión

1. Dibuje 0,15 ml de sangre de la carótida de cada rata y medida de la glucemia. Lave las cánulas yugulares. Usa 50 U de solución salina heparinizada para prevenir la coagulación en ambas cánulas de cada rata.
2. Transferir la muestra de sangre a un tubo de recogida de 0,5 ml que contiene 2% de EDTA. Centrifugar a 10.000 rpm durante 2 min y congelar el plasma a -20 ° C.
3. Llenar dos jeringas de 60 ml para cada una de las condiciones de infusión se enumeran a continuación. Jeringa 1 Place de la posición frente a la bomba de jeringa y 2 º lugar en la posición posterior de la bomba.
4. Une cada par de soluciones junto con Y-conectores y tubos T22 CO-EX que ha sido esterilizado. Coloque las jeringas en un 33 Harvardbomba de jeringa doble.
5. Cambiar el fondo de la jaula y retire todos los alimentos de la parrilla superior jaula.
6. Pesar 150 g de pienso estándar y colocar en la parrilla superior jaula.
7. Conecte la jeringa a la pieza giratoria en la parrilla jaula. Lave las jeringas adecuadamente para eliminar el aire atrapado en las líneas.
8. Calcular las tasas de flujo de infusión utilizando el peso corporal que se tomó antes de conectar la rata para el sistema de infusión. Las tarifas se calculan con un archivo de Microsoft Excel que convierte la tasa de infusión de glucosa (GIR) en ml / h.
9. Coloque la bomba para administrar los caudales de jeringas 60 ml de acuerdo a la configuración del fabricante. Introduzca el tipo de jeringa 1 (jeringa frontal) y la tasa de Jeringa 2 (back jeringa).
10. Encienda la bomba.

4. Monitoreo

1. Después de arrancar la bomba, compruebe que no hay fugas de la pieza giratoria o de las cánulas y el tubo de infusión que no está torcido. Compruebe también que no haya burbujas de aire enel tubo.
2. Después de 3 horas de la infusión, tomar una muestra de sangre para controlar la glucemia. Repita después de 6, 24, 48 y 72 h de infusión. Como medida de precaución, la glucemia también se controla después de 30, 34, 54 y 60 h de la infusión. La glucosa en sangre se puede medir usando una gota de sangre entera usando un monitor de glucosa portátil. Esto limita la cantidad de sangre extraída durante la infusión y por lo tanto evita alterar de manera significativa el volumen de sangre y / o el hematocrito.
3. La tasa para la jeringa 1 se modifica en función de los valores de glucemia para mantener la glucosa en la sangre 220-250 mg / dl. La tasa de jeringa 2 no cambia durante la hora 72 de infusión porque los ácidos grasos libres se mantienen a 1 mmol / L.
4. Condiciones de infusión están emparejados de manera que el volumen recibido por los animales de control es equivalente al volumen recibido por los animales de ensayo (Tabla 1).
5. Después de 24 horas de la infusión, cambiar el fondo de la jaula y se pesa la comida que queda en la parrilla de la jaula. Devuelve la parte no consumido to La parrilla de jaula. Repita después de 48 horas.
6. Jeringas Recarga día según sea necesario durante la hora 72 de la infusión.
7. Durante la infusión, respete siempre las ratas para detectar cualquier signo de inflamación o malestar. Administrar la atención adecuada si es necesario.

5. La eutanasia después de la infusión

1. Después de 72 horas de la infusión, las ratas se anestesiaron por vía intravenosa con 0,5 ml de un cóctel de ketamina / xilazina (182 mg / kg de ketamina y 11,6 mg / kg de xilazina diluyó 1:2 con 0,9% de NaCl).
2. El reflejo del dedo del pie-pellizco se utiliza para verificar el nivel de anestesia. Anestésico adicional se administra según sea necesario.
3. Cuando la rata es anestesiada, la cavidad abdominal se abrió con unas tijeras quirúrgicas. La rata se desangraron mediante la elaboración 10-15 ml de sangre en una jeringa de la aorta o la vena cava.

Resultados

De una serie de 42 ratas a las que se sometieron a cirugía, 5 ratas se perdieron durante el período post-operatorio y 1 rata se perdió durante la infusión, lo que representa una tasa de éxito del 86%. El peso promedio de las 37 ratas que fueron finalmente infunden fue 608 ± 5 g antes de la cirugía y 588 ± 6 g al inicio de la infusión (media ± SE, n = 37, p <0,0001 en la prueba t pareada). Se obtuvieron los siguientes resultados representativos en 2 grupos de infusión de solución salina.: (SAL), y la Gluco...

Discusión

Aunque un número de estudios previos han empleado infusiones crónicas de la glucosa (por ejemplo, ^10-15) o lípidos (por ejemplo, ^16,17) en roedores, a nuestro conocimiento la infusión combinada de ambos combustibles sólo se ha informado en ratones ^18. El modelo de infusión crónica presentado aquí ofrece varias ventajas para el estudio de los efectos sobre el exceso de nutrientes en una variedad de funciones biológicas en las ratas. En primer lugar, no se trata ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602