Ein Modell der chronischen Nährstoff Infusion in der Ratte

Zusammenfassung

Ein Protokoll für chronische Infusion von Glukose und Intralipid in Ratten beschrieben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Auswirkungen der Nährstoff Überschuß auf Organfunktion und physiologischen Parametern zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die chronische Exposition gegenüber übermäßiger Mengen an Nährstoffen wird postuliert, dass die Funktion mehrerer Organe und Gewebe zu beeinträchtigen und den für die Entwicklung der vielen Komplikationen, die mit Adipositas und des metabolischen Syndroms, einschließlich Diabetes Typ 2 beitragen. Um die Mechanismen, durch die hohe Konzentrationen von Glukose und Fettsäuren auf die Pankreas-beta-Zellen und die Sekretion von Insulin zu untersuchen, haben wir eine chronische Infusion von Nährstoffen in der Ratte etabliert. Das Verfahren besteht aus Katheterisierung der rechten Jugularvene und die linke Halsschlagader unter Vollnarkose, so dass eine 7-tägige Erholungsphase; Verbinden der Katheter an die Pumpen mit einer Lenk-und Gegengewicht, das den Tieren erlaubt, sich frei in den Käfig und Infusion Glukose und / oder Intralipid (a Sojaöl-Emulsion, die eine Mischung von etwa 80% unsaturated/20% gesättigte Fettsäuren erzeugt, wenn mit Heparin infundiert) für 72 Stunden. Dieses Modell bietet mehrere advantages, einschließlich der Möglichkeit, fein modulieren die Zielwerte der zirkulierenden Glukose und Fettsäuren; die Möglichkeit, zusammen mit diesen infundiert pharmakologischen Verbindungen und der relativ kurzen Zeitrahmen, um diätetische Modelle gegenüber. Es kann verwendet werden, um die Mechanismen der Nährstoff Dysfunktion bei verschiedenen Organe zu untersuchen und um die Wirksamkeit von Wirkstoffen in diesem Zusammenhang zu testen.

Einleitung

, Chronisch erhöhte Spiegel von Glucose und Lipide im Kreislauf vorgeschlagen worden sind, um zu der Pathogenese von Typ 2 Diabetes durch Veränderung der Funktion verschiedener Organe bei der Aufrechterhaltung der Homöostase einschließlich Glucose gebracht beitragen, aber nicht beschränkt auf, bewertet die pankreatischen beta-Zellen ( in ^1). Die Glukotoxizität Hypothese postuliert, dass chronische Hyperglykämie die Beta-Zell-Defekt, die zu Hyperglykämie gab in den ersten Platz, wodurch ein Teufelskreis und einen Beitrag zu einer Verschlechterung der Blutzuckereinstellung bei Typ-2-Diabetes-Patienten verschlimmert. Ebenso schlägt die glucolipotoxicity Hypothese, dass die gleichzeitige Erhebungen von Glucose-und Lipid-Ebenen, wie es oft bei Typ-2-Diabetes beobachtet, nachteilig auf die Beta-Zellen sind.

Die Entschlüsselung der zellulären und molekularen Mechanismen der schädlichen Wirkungen von Nährstoffen auf chronisch erhöhten Pankreas-Beta-Zell-Funktion ist der Schlüssel zum understanding der Pathogenese von Typ 2 Diabetes ^1. Zu diesem Zweck wurde eine Vielzahl von Untersuchungen, die Mechanismen der chronischen Nährstoff überschüssige ex vivo in isolierten Langerhans-Inseln oder in vitro in klonalen, Insulin-sezernierenden Zelllinien untersucht. Allerdings ist die Übersetzung der Erkenntnisse in diesen Modellsystemen auf den gesamten Organismus erhalten komplex, insbesondere weil die Konzentrationen von Fettsäuren in kultivierten Zellen oder Inselzellen verwendet selten passen die zirkulierenden Spiegel in der Nähe der Beta-Zellen in vivo ^2. Auf der anderen Seite haben die Mechanismen der Beta-Zell-Versagen in Reaktion auf einen Nährstoffmangel Überschuss in Tiermodellen von Diabetes untersucht worden, wie der Zucker Diabetic Fatty Ratte ^3,4, die Wüstenrennmaus Psammomys obesus ⁵ und die fettreiche Ernährung beispielhaft fed Maus ^6. Diese Modelle lassen sich jedoch durch intrinsische Stoffwechselstörungen aus und sind nicht leicht zugänglich Manipulationen des Blutzuckersund / oder Lipid-Ebenen in einer kontrollierten und weniger chronische Einstellung. Um der Lage sein, zu ändern zirkulierenden Nährstoffgehalt in einem Zeitrahmen von Tagen in sonst normalen Tieren haben wir eine chronische Infusion Modell in normalen Ratten, die uns um die Auswirkungen von Lipiden und Glukose untersuchen, allein oder in Kombination ermöglicht entwickelt, auf die physiologischen Parameter und Funktion ^7,8.

Protokoll

Überblick: Das Verfahren besteht aus Katheterisiervorrichtung das Recht Halsschlagader und linken Halsschlagader unter Vollnarkose; ermöglicht eine 7-tägige Erholungsphase; Verbinden der Katheter an die Pumpen mit einem dreh-und Gegengewicht, das das Tier ermöglicht, sich frei zu bewegen in den Käfig; und Infusion Glucose und / oder Intralipid (a Sojaöl-Emulsion, die eine Mischung von etwa 80% erzeugt unsaturated/20% gesättigte Fettsäuren, wenn sie mit Heparin ⁹ infundiert) für 72 Stunden.

1. Kanülierung der rechten Vena jugularis und die linke Halsschlagader

1. Sterilisieren chirurgischen Instrumenten. Kanülierung Schläuche müssen auch kalt sterilisiert unter Verwendung eines flüssigen Sterilisierungsmittel (2,6% Glutaraldehyd) vor dem Eingriff. Tauchen Sie den Schlauch in einem Autoklaven Behälter für 16-24 Std. Spülen und gründlich mit sterilem destilliertem Wasser, um alle Spuren von Glutaraldehyd vor Gebrauch zu entfernen.
2. Wiegen die Ratte zu berechnenMedikamentendosierungen:
   Carprofen 5 mg / kg: Verdünnung 1/10 = Körpergewicht (g) x 0,001 ml SC (Analgetikum)
   Glycopyrrolat 0,01 mg / kg: Verdünnung 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (Anticholinergika)
3. Anesthetize die Ratte mit Isofluran und Sauerstoff.
4. Legen Sie die Ratte auf den Bauch. Shave den Bereich hinter den Ohren an der Basis der Schultern. Legen Sie die Ratte auf seinem Rücken. Rasur die Region unter dem Hals bis zu den Vorderpfoten.
5. Prep die chirurgische Website mit Chlorhexidin, Alkohol und Jod. Verwalten Drogen.
6. Übertragen Sie die Ratte auf dem OP-Feld.
7. Unter aseptischen Bedingungen canulate das Recht Halsschlagader und die linke Halsschlagader mit einem PE-50 Kanüle an einer 1 ml Spritze mit 5 U heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt. Spülen Sie die Kanülen mit 50 U Heparin-Kochsalzlösung zu vermeiden, während der Erholungsphase Blutgerinnung. Verwenden abgestumpft 23G Nadeln. Schließen Sie jede Kanüle mit einer 23G Nadel.
8. Nach der Operation, schneiden etwa 2,5 mm aus derunteren Schneidezähne und Ort der Ratte in einer Infusion Jacke um die Kanülen aus gefressen zu verhindern.
9. Geben Sauerstoff (1 L / min für 10 min) zu evakuieren Isofluran.
10. Legen Sie die Ratte in einem Käfig beheizt, bis es vollständig wach ist.
11. Operate vier Ratten auf einen pro Infusion Zustand verwenden (Tabelle 1).

2. Postoperative Pflege (Post-chirurgischen Behandlung und Anschluss der Katheter)

1. Wiegen Sie die Ratten an Tag 1 und Tag 2 nach der Operation.
2. Verwalten Glycopyrrolat (BW (g) x 0,00048 ml) SC zweimal am Tag 1 nach der Operation und einmal am Tag 2 nach der Operation.
3. Zusätzliche unterstützende Behandlungen verabreicht, wenn nötig: Flüssigkeiten, Heizkissen, nass Ernährung, Sauerstoff-Therapie, Analgetika, Anticholinergika.
4. Am 7. Tag nach der Operation, wiegen die Ratten, die Flussraten für Infusion berechnen.
5. Schließen Sie jede Ratte eine Infusion System mit einem Haltegurt und schwenkbar auf einem Käfig Grill oben (Abbildung 1) montiert.
6. Spülen Sie die Kanülen mit 5 U heparinisierter Kochsalzlösung, um Gerinnsel zu entfernen. Spülen Sie die Kanülen noch einmal mit 50 U Heparin-Kochsalzlösung zu verhindern Blutgerinnung.
7. Lassen Sie die Ratten an die Leine gewöhnen und schwenken für mindestens 24 Stunden vor Beginn der Infusion.

3. Aufguss

1. Unentschieden 0,15 ml Blut aus der Halsschlagader jeder Ratte und messen Blutzucker. Spülen Sie die Vena Kanülen. Mit 50 U Heparin-Kochsalzlösung Gerinnung in beiden Kanülen jeder Ratte zu verhindern.
2. Bringen der Blutprobe mit einem 0,5 ml Röhrchen mit 2% EDTA. Zentrifuge bei 10.000 rpm für 2 min und frieren das Plasma bei -20 ° C.
3. Füllen Sie zwei 60 ml Spritzen für jede der Infusion nachfolgend aufgeführten Bedingungen. Platz 1 Spritze auf der vorderen Position der Pumpe und Spritze Platz 2 auf der Rückseite Position der Pumpe.
4. Registriert jedes Paar von Lösungen zusammen mit y-Anschlüsse und CO-EX T22 Schläuche, die sterilisiert worden. Legen Sie die Spritzen auf einem Harvard 33Dual Spritzenpumpe.
5. Ändern Sie den Käfig unten und entfernen Sie alle Lebensmittel aus dem Käfig Grill oben.
6. Wiegen Sie 150 g Standard-Chow und auf den Käfig Grill oben.
7. Verbinden Sie die Spritzen an der Schwenk auf den Käfig Grill. Spülen Sie die Spritze richtig, um eingeschlossene Luft aus den Leitungen zu entfernen.
8. Berechnen Sie die Infusion Flussraten mit dem Körpergewicht, die Sie vor dem Anschließen die Ratte auf die Infusion System gemacht. Die Preise sind mit einer Microsoft Excel-Datei, die Glucoseinfusionsrate (GIR) in ml / h wandelt berechnet.
9. Stellen Sie die Pumpe auf Flussraten für 60 ml Spritzen verabreichen nach den Angaben des Herstellers Einstellungen. Geben Sie den Preis für 1 Spritze (vorne Spritze) und die Rate für Spritze 2 (zurück Spritze).
10. Starten Sie die Pumpe.

4. Überwachung

1. Nach dem Starten der Pumpe zu überprüfen, dass es keine undichten aus der Schwenk-oder aus den Kanülen und Infusion Schläuche nicht verdreht ist. Überprüfen Sie auch, dass es keine Luftblasen inder Schlauch.
2. Nach 3 Stunden nach der Infusion, eine Blutprobe nehmen, um den Blutzucker zu überwachen. Wiederholung nach 6, 24, 48 und 72 Stunden nach der Infusion. Als Vorsichtsmaßnahme wird glycemia auch nach 30, 34, 54 und 60 h der Infusion überwacht. Blutzucker messen mit einem Tropfen Vollblut unter Verwendung eines tragbaren Glukosemonitor werden. Dies begrenzt die Menge des Blutes während der Infusion entnommen und vermeidet daher wesentlich zu verändern Blutvolumen und / oder Hämatokrit.
3. Die Rate für Spritze 1 basiert auf Blutzucker-Werte geändert, um den Blutzucker bei 220-250 mg / dl zu halten. Die Rate für Spritze 2 nicht während der 72 Stunden nach der Infusion zu ändern, weil freie Fettsäuren bei 1 mmol / L. gehalten werden
4. Infusion Bedingungen gekoppelt sind, so dass das Volumen für die Kontrolltiere erhielten entspricht dem Volumen der Versuchstiere (Tabelle 1) empfangen wird.
5. Nach 24 Stunden nach der Infusion, ändern Sie den Käfig unten und wiegen das Essen noch im Käfig Grill. Bringen Sie das Teil uneaten to den Käfig Grill. Wiederholen Sie nach 48 Stunden.
6. Refill Spritzen täglich während der 72 Stunden nach der Infusion benötigt.
7. Während der Infusion, beachten Sie immer die Ratte auf Anzeichen von Entzündungen oder Beschwerden. Verwalten entsprechender Pflege, wenn nötig.

5. Post-Infusion Sterbehilfe

1. Nach 72 Stunden der Infusion sind narkotisierten Ratten intravenös mit 0,5 ml einer Ketamin / Xylazin-Cocktail (182 mg / kg Ketamin und 11,6 mg / kg Xylazin 1:2 verdünnt mit 0,9% NaCl).
2. Die Zehen-Pinch-Reflex verwendet, um das Niveau der Anästhesie zu überprüfen. Weitere Betäubungsmittel verabreicht wird, wie gebraucht.
3. Wenn die Ratten anästhesiert, wird die Bauchhöhle mit einer chirurgischen Schere geöffnet. Die Ratte wird durch Ziehen 10-15 ml Blut in einer Spritze aus der Aorta oder der Vena Cava ausgeblutet.

Ergebnisse

Aus einer Serie von 42 Ratten, die operiert wurden 5 Ratten während der postoperativen Phase verloren und 1 Ratte wurde während der Infusion verloren, was einer Erfolgsquote von 86%. Das durchschnittliche Körpergewicht der 37 Ratten, die schließlich infundiert wurden war 608 ± 5 g vor der Operation und 588 ± 6 g zu Beginn der Infusion (Mittelwert ± SE, n = 37, p <0,0001 durch gepaarte t-Test). . Folgende repräsentative Ergebnisse wurden in 2 Gruppen Infusion erhalten: Saline (SAL) und Glucose + Intralipid (GL...

Diskussion

Obwohl eine Reihe von früheren Studien chronische Infusion von Glukose (z. B. ^10-15) oder Lipide (zB ^16,17) bei Nagetieren, um unser Wissen beschäftigt haben die kombinierte Infusion von beiden Kraftstoffen nur bei Mäusen ¹⁸ gemeldet. Die chronische Infusion hier vorgestellte Modell bietet mehrere Vorteile, um die Auswirkungen auf die Nährstoff-Überschuss auf einer Vielzahl von biologischen Funktionen in Ratten untersucht werden. Erstens, es werden aber keine genet...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602