Um Modelo de Infusão Crónica de nutrientes no Rato

Resumo

Um protocolo para as infusões crónicas de glicose e Intralipid no rato é descrito. Este modelo pode ser utilizado para estudar o impacto do excesso de nutrientes sobre a função do órgão de parâmetros fisiológicos.

Resumo

A exposição crónica a níveis excessivos de nutrientes é postulada para afectar a função de vários órgãos e tecidos, e para contribuir para o desenvolvimento de muitas complicações associadas à obesidade e à síndrome metabólica, incluindo diabetes tipo 2. Para estudar os mecanismos pelos quais os níveis excessivos de glucose e ácidos gordos afectam o das células beta do pâncreas e da secreção de insulina, criámos um modelo de infusão de nutrientes crónica no rato. O procedimento consiste em cateterização da veia jugular direita e da artéria carótida esquerda, sob anestesia geral, permitindo um período de recuperação de 7 dias, permitindo a conexão dos cateteres para as bombas através de um suporte giratório e do sistema de contrapeso que permite que o animal se mover livremente na gaiola, e infundindo glicose e / ou Intralipid (uma emulsão de óleo de soja, que gera uma mistura de aproximadamente 80% unsaturated/20% de ácidos gordos saturados quando infundida com heparina) durante 72 horas. Este modelo oferece vários advantages, incluindo a possibilidade de modular finamente os níveis alvo de glicose e os ácidos gordos de circulação, a opção de co-infundir compostos farmacológicos, e o período de tempo relativamente curto em oposição aos modelos dietéticos. Ele pode ser usado para examinar os mecanismos de disfunção de nutrientes induzida por uma variedade de órgãos e para testar a eficácia de drogas neste contexto.

Introdução

Os níveis cronicamente elevados de glucose e lípidos na circulação têm sido propostos para contribuir para a patogénese da diabetes tipo 2 alterando a função de vários órgãos implicados na manutenção da homeostase da glucose, incluindo, mas não limitado a, o das células beta do pâncreas (revisto em ^1). Os glicotoxicidade hipótese postula que a hiperglicemia crônica agrava o defeito das células beta que deu origem à hiperglicemia, em primeiro lugar, criando assim um ciclo vicioso e contribuindo para a deterioração do controle da glicose em pacientes diabéticos tipo 2. Da mesma forma, a hipótese propõe que as elevações glucolipotoxicity concomitantes dos níveis de glucose e lípidos, como frequentemente observadas em pacientes com diabetes tipo 2, são prejudiciais para a célula beta.

Decifrar os mecanismos celulares e moleculares dos efeitos deletérios de nutrientes cronicamente elevados sobre a função das células beta do pâncreas é fundamental para o understanding da patogénese da diabetes de tipo 2 ^1. Para esse efeito, um grande número de estudos examinaram os mecanismos de nutrientes em excesso ex vivo crónica nas ilhotas de Langerhans isoladas ou in vitro, em linhas de células secretoras de insulina clonais. Contudo, a tradução dos resultados obtidos nestes sistemas modelo para todo o organismo é complexo, em especial, porque as concentrações de ácidos gordos utilizados na cultura de células ou ilhotas raramente igualar os níveis de circulação in vivo ^{de 2} a vizinhança das células beta. Por outro lado, os mecanismos de falha das células beta em resposta ao excesso de nutrientes foram examinados em modelos de roedores da diabetes, tal como exemplificado pelo rato Zucker Diabetic Fatty ^3,4, o gerbilo Psammomys obesus ⁵ e o elevado teor de gordura da dieta fed rato ^6. Estes modelos, no entanto, são caracterizados por anormalidades metabólicas intrínsecas e não são facilmente adaptado às manipulações da glicose no sanguee / ou os níveis de lipídeos em um ambiente mais controlado e menos crônica. Para ser capaz de alterar os níveis circulantes de nutrientes num período de tempo de dias em animais normais em contrário, nós desenvolvemos um modelo de infusão crónica em ratos normais, o que nos permite examinar os efeitos de lípidos e de glucose, sozinho ou em combinação, sobre os parâmetros fisiológicos e função ^7,8.

Protocolo

Resumo: O procedimento consiste em cateterização da veia jugular direita e da artéria carótida esquerda, sob anestesia geral, permitindo um período de recuperação de 7 dias, permitindo a conexão dos cateteres para as bombas através de um suporte giratório e do sistema de contrapeso que permite que o animal se mover livremente na gaiola; e infusão de glicose e / ou Intralipid (uma emulsão de óleo de soja, que gera uma mistura de aproximadamente 80% unsaturated/20% de ácidos gordos saturados quando infundida com heparina ⁹⁾ durante 72 horas.

1. Canulação da veia jugular direita e da artéria carótida esquerda

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos. Tubagem de canulação também deve ser esterilizado a frio, utilizando um agente de esterilização líquido (2,6% de glutaraldeído) antes do procedimento. Mergulhe o tubo em um recipiente autoclavado por 16-24 horas. Enxágue e lave bem com água destilada estéril para remover todos os vestígios de glutaraldeído antes do uso.
2. Pesa-se o rato para calculardoses de droga:
   Carprofeno 5 mg / kg: diluição de 1/10 = Peso corporal (g) x 0,001 mL SC (analgésica)
   Glicopirroplato 0,01 mg / kg: diluição de 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml de SC (anticolinérgicos)
3. Anestesiar o rato com isoflurano e oxigênio.
4. Coloque o rato em seu estômago. Raspar a área atrás das orelhas até à base dos ombros. Coloque o rato em suas costas. Raspar a região sob o pescoço com as patas dianteiras.
5. Preparação do local cirúrgico com clorexidina, álcool e iodo. Administrar drogas.
6. Transferir o rato para o campo cirúrgico.
7. Utilizando uma técnica asséptica, canulate a veia jugular direita e da artéria carótida esquerda, uma cânula de PE-50 ligado a uma seringa de 1 ml, cheio com 5 L de solução salina heparinizada. Lave as cânulas com 50 L de solução salina heparinizada para evitar a coagulação durante o período de recuperação. Use agulhas 23G embotados. Feche cada cânula com um pino de 23G.
8. Após a cirurgia, cortar cerca de 2,5 mm daincisivos inferiores e coloque o rato em uma jaqueta de infusão para evitar que as cânulas de ser comido.
9. Fornecer oxigénio (1 L / min durante 10 min) para ajudar a evacuar isoflurano.
10. Coloque o rato em uma gaiola aquecida até que esteja completamente desperto.
11. Operar quatro ratos para usar um por condição infusão (Tabela 1).

2. Pós-operatório Care (tratamento pós-cirúrgico e conexão dos cateteres)

1. Pesar os animais no dia 1 e dia 2 pós-cirurgia.
2. Administrar glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC duas vezes no 1 º dia pós-operatório e uma vez no dia 2 pós-cirurgia.
3. Tratamentos de suporte adicionais podem ser administradas, se necessário: fluidos, almofada de aquecimento, dieta molhado, oxigenoterapia, analgésicos, anticolinérgicos.
4. No dia 7 pós-operatório, pesar os ratos para calcular as taxas de fluxo de infusão.
5. Ligação cada rato para um sistema de infusão utilizando uma corda e giratória montada no topo de uma grade de gaiola (Figura 1).
6. Lave as cânulas com 5 L de solução salina heparinizada para remover coágulos. Lave as cânulas mais uma vez com 50 L de solução salina heparinizada para prevenir a coagulação.
7. Permitir que os ratos a aclimatar ao tirante e rodar, pelo menos, 24 horas antes do início da infusão.

3. Infusão

1. Desenhar 0,15 ml de sangue a partir da carótida de cada rato e medir a glicemia. Lave as cânulas jugulares. Usar 50 L de solução salina heparinizada para evitar a coagulação em ambos os cânulas de cada rato.
2. Transferência da amostra de sangue para um tubo de 0,5 ml contendo 2% de recolha de EDTA. Centrifugar a 10.000 rpm durante 2 min e congelar o plasma a -20 ° C.
3. Encha duas seringas de 60 ml para cada uma das condições listadas abaixo de infusão. Seringa um lugar na posição da frente da bomba de seringa e local 2 na posição posterior da bomba.
4. Junte-se cada par de soluções em conjunto com y-conectores e tubos T22 CO-EX, que foi esterilizado. Coloque as seringas em uma Harvard 33Bomba de seringa dupla.
5. Altere o fundo da gaiola e retire todos os alimentos do topo da grade da gaiola.
6. Pesar 150 g de ração padrão e coloque sobre a grelha superior gaiola.
7. Ligue as seringas à peça giratória na grade da gaiola. Lave as seringas adequadamente para remover o ar retido a partir das linhas.
8. Calcular as taxas de fluxo de infusão que utilizam o peso corporal, que foi tomada antes de ligar o rato para o sistema de infusão. As tarifas são calculadas com um arquivo do Microsoft Excel que converte a taxa de infusão de glicose (GIR) em ml / h.
9. Defina a bomba para administrar as taxas de fluxo de 60 ml seringas de acordo com as definições do fabricante. Digite a taxa de Seringa 1 (seringa frente) ea taxa de Seringa 2 (back seringa).
10. Iniciar a bomba.

4. Monitoramento

1. Depois de iniciar a bomba, verificar que não existe vazamento da peça giratória ou das cânulas de tubagem de infusão e que não é torcida. Verifique também se não há bolhas de ar naa tubagem.
2. Após 3 horas de infusão, tomar uma amostra de sangue para monitorar a glicemia. Repita depois de 6, 24, 48 e 72 horas de infusão. Como medida de precaução, a glicemia também é monitorada após 30, 34, 54 e 60 horas da infusão. Glucose no sangue pode ser medida utilizando uma gota de sangue completo, utilizando um monitor de glucose portátil. Isso limita a quantidade de sangue colhido durante a infusão e, por conseguinte, evita que altera significativamente o volume de sangue e / ou hematócrito.
3. A taxa de seringa 1 está modificado com base nos valores de glicemia para manter a glicose no sangue em 220-250 mg / dl. A taxa para Seringa dois não se altera durante a hr 72 de infusão, pois os ácidos graxos livres são mantidos em 1 mmol / L.
4. Condições de infusão são emparelhados de modo a que o volume recebido para os animais de controlo é equivalente ao volume recebido para os animais de ensaio (Tabela 1).
5. Após 24 horas de infusão, mudar o fundo da gaiola e pesar a comida restante na grade da gaiola. Retornar a parte restos de toa grelha gaiola. Repita depois de 48 horas.
6. Seringas de recarga diária, conforme necessário durante o hr 72 de infusão.
7. Durante a infusão, sempre observar o rato por quaisquer sinais de inflamação ou desconforto. Administrar os cuidados adequados, se necessário.

5. Eutanásia pós-infusão

1. Após 72 horas de infusão, os ratos são anestesiados por via intravenosa, com 0,5 ml de um cocktail de cetamina / xilazina (182 mg / kg de cetamina e de 11,6 mg / kg de xilazina diluída 1:2 com 0,9% de NaCl).
2. O reflexo toe-pitada é utilizado para verificar o nível de anestesia. Adicional anestésico é administrado como necessário.
3. Quando o rato é anestesiado, a cavidade abdominal é aberta com uma tesoura cirúrgica. O rato é sangrados através da elaboração de 10-15 ml de sangue numa seringa a partir da aorta ou da veia cava.

Resultados

De uma série de 42 ratos, que foram submetidos à cirurgia, cinco ratos foram perdidos durante o período pós-operatório e um rato foi perdida durante a infusão, o que representa uma taxa de sucesso global de 86%. O peso corporal médio dos 37 ratos que eventualmente foram infundidos foi 608 ± 5 g, antes da cirurgia e 588 ± 6 g no início da perfusão (média ± EP, n = 37, P <0,0001 por teste t emparelhado). Os seguintes resultados representativos foram obtidos em dois grupos: de infusão. Saline (SAL) e glico...

Discussão

Embora um certo número de estudos anteriores têm utilizado infusões crónicas de glicose (por exemplo, ^10-15) ou lípidos (por exemplo, ^16,17) em roedores, para o nosso conhecimento da infusão conjunta de ambos os combustíveis apenas foi avaliado em ratos ^18. O modelo de infusão crónica aqui apresentado oferece diversas vantagens para o estudo dos efeitos sobre o excesso de nutrientes de uma variedade de funções biológicas em ratos. Primeiro, ele não envolve ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602