Sıçan Kronik Besin İnfüzyon Bir Model

Özet

Farelerde glukoz ve Intralipid kronik infüzyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu model, organ fonksiyonu ve fizyolojik parametreler üzerindeki besin aşırı etkisini incelemek için kullanılabilir.

Özet

Besinlerin aşırı düzeyde kronik maruz kalma birçok organ ve dokuların fonksiyonlarını etkileyen ve obezite ile ilişkili birçok komplikasyon gelişimi ve tip 2 diyabet gibi metabolik sendrom, katkıda kabul edilmektedir. Glikoz ve yağ asitlerinin aşırı düzeyde pankreas beta hücre ve insülin salgılanmasını etkileyen hangi mekanizmaları incelemek için, sıçan kronik bir besin infüzyon modeli kurduk. 7 günlük iyileşme süresi sağlayan,, bir döner ve kafes içinde serbestçe hareket hayvan sağlayan karşı sistemini kullanarak pompaları için kateter bağlantı ve beslerken işlem genel anestezi altında sağ juguler ven ve sol karotis arter kateterizasyonu oluşur glikoz ve / ya da Intralipid (heparin infüzyonu çok yaklaşık% 80 oranında unsaturated/20% doymuş yağ asitlerinin bir karışımı üreten bir soya fasulyesi yağı emülsiyonu) 72 saat boyunca gerçekleştirilebilir. Bu model birçok avan sunuyorFarmakolojik bileşikler, co-aşılamak için seçenek; ve diyet modellere karşı nispeten kısa bir zaman dilimi ince glukoz ve yağ asitleri, dolaşımdaki hedef seviyelerini değiştirmek üzere olasılığı dahil olmak üzere Ges. Bu organlarda çeşitli besin indüklenen disfonksiyon mekanizmalarını incelemek ve bu bağlamda ilaçların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Giriş

Dolaşımdaki glukoz ve lipit kronik yüksek seviyeleri de dahil olmak üzere glukoz homeostazının muhafaza edilmesinde rol oynadığı çeşitli organların fonksiyonunu değiştirerek, tip 2 diyabet patogenezine katkıda için önerilen, ancak bunlarla sınırlı değildir edilmiş, pankreatik beta-hücresi (yorumlanan ^1). Kronik hiperglisemi böylece bir kısır döngü oluşturmak ve tip 2 diyabet hastalarında glikoz kontrolünün bozulmasına katkıda, ilk etapta hiperglisemi yol açan beta-hücre kusur azdırır bu Glukotoksisite hipotez öne süren. Aynı şekilde, glucolipotoxicity hipotez olarak genellikle tip 2 diyabet gözlenen glukoz ve lipid düzeylerinin eşlik eden cepheler,, beta hücre için zararlıdır önermektedir.

Pankreatik beta hücre fonksiyonu üzerinde kronik yüksek besinlerin zararlı etkileri hücresel ve moleküler mekanizmaları deşifre understandi anahtarıdırtip 2 diyabet ¹ patogenezi ng. Bu amaçla, çalışmaları, çok sayıda, Langerhans adacıklarında bir izole edilmiş ya da klonlar, insülin salgılayan hücre hatlarında in vitro kronik besin aşırı ex vivo mekanizmaları inceledik. Kültürlenmiş adacık hücreleri ya da içinde kullanılan yağ asitlerinin konsantrasyonu nadiren in vivo ² beta hücrelerinin yakın dolaşımdaki seviyeleri neticesinde Ancak, bütün bir organizma için bu model sistemlerinde de elde edilen bulguların yapıldı, özellikle karmaşıktır. Öte yandan, besin aşırı tepki olarak beta hücresi yetmezliği mekanizmaları olarak Zucker Diyabetik Şişman sıçan ^3,4, gerbil Psammomys obesus ⁵ ve yüksek yağlı diyet ile örneklenen, diyabet kemirgen modellerinde incelenmiştir beslenen fare ^6. Bu modeller, ancak, içsel metabolik anormallikler ile karakterizedir ve kan şekeri manipülasyonlar kolayca uygun değildir vardırve / veya bir daha kontrollü ve daha az kronik bir ortamda lipid düzeyleri. Aksi takdirde, normal hayvanlarda gün bir süre besin seviyelerini dolaşan değiştirmek edebilmek için, fizyolojik parametreleri ve fonksiyonu, bize tek başına veya birlikte, lipid ve glukoz etkilerini incelemek sağlar Normal sıçanlarda kronik bir infüzyon modeli geliştirdik ^7,8.

Protokol

Bakış:, bir 7 günlük iyileşme süresi sağlayan, bir döner ve kafeste serbestçe hareket hayvan sağlayan karşı sistemini kullanarak pompaları için kateterler bağlayan işlem genel anestezi altında sağ juguler ven ve sol karotis arter kateterizasyonu oluşur; ve 72 saat süre ile ^(9, heparin infüzyonu doymuş yağ asitleri, yaklaşık% 80 unsaturated/20% karışımı üreten bir soya fasulyesi yağ emülsiyonu), glukoz ve / veya Intralipid beslerken.

1. Sağ Juguler Ven ve Sol Karotis Arter kanülasyon

1. Cerrahi aletler sterilize edin. Kanülasyonu boruları, aynı zamanda işlem öncesinde bir sıvı sterilize edici madde (% 2.6 glutaraldehid) kullanılarak soğuk sterilize olması gerekir. 16-24 saat boyunca, bir otoklav kapta boru daldırın. Durulayın ve kullanmadan önce glutaraldehit tüm izlerini kaldırmak için steril distile su ile iyice yıkayın.
2. Hesaplamak için fare tartılırilaç dozları:
   Karprofen 5 mg / kg: seyreltme 1/10 = Vücut ağırlığı (g) x 0.001 mi SC (analjezik)
   0.01 mg / kg 'glikopirolat: seyreltme 1/10 = CA (g) X, 0.0012 mi SC (antikolinerjik)
3. Izofluran ve oksijen kullanarak sıçan anestezisi.
4. Kendi karnına sıçan yerleştirin. Omuz tabanına kulak arkasındaki alan tıraş. Sırtında sıçan yatıyordu. Ön pençeleri için boyun altında bölge tıraş.
5. Klorheksidin, alkol ve iyot ile Hazırlık cerrahi Alanı. Ilaçlar yönetmek.
6. Cerrahi alanına sıçan aktarın.
7. Aseptik teknik kullanılarak, sağ juguler ven ve heparinize tuzlu 5 U ile dolu bir 1 ml şırınga bağlanmış bir PE-50 kanül ile sol karotid arter canulate. Iyileşme döneminde pıhtılaşma önlemek için heparinli serum fizyolojik 50 U ile canulas yıkayın. Körelmiş 23G iğne kullanın. Bir 23G iğne ile her kanül kapatın.
8. Ameliyattan sonra, kapalı yaklaşık 2.5 mm Döşemealt kesici dişler ve yer yemiş olmaktan canulas önlemek için bir infüzyon ceket sıçan.
9. Izofluran tahliye yardımcı olmak için oksijen (1 L / 10 dk dk) sağlayın.
10. Tamamen uyanık kadar ısıtılmış bir kafeste sıçan yerleştirin.
11. Infüzyon durum başına bir kullanımı dört sıçan (Tablo 1) çalıştırın.

2. Ameliyat sonrası Bakım (kateterler Post-cerrahi Tedavi ve Bağlantı)

1. 1. gün ve gün 2 sonrası cerrahi fareler tartılır.
2. Gün 1 ameliyat sonrası ve günde bir kez 2 ameliyat sonrası iki kez glikopirolat (BW (g) x 0.00048 mi) SC yönetmek.
3. Gerekirse ek destekleyici tedaviler uygulanabilir: sıvılar, ısıtma yastığı, ıslak diyet, oksijen tedavisi, analjezikler, antikolinerjikler.
4. Gün 7 sonrası cerrahi, infüzyon için akış oranlarını hesaplamak için fareler tartın.
5. Bir kafes ızgara üst (Şekil 1) üzerine monte edilmiş bir halata ve döner kullanarak bir infüzyon sistemine her fare bağlayın.
6. Pıhtıları kaldırmak için heparinli serum fizyolojik 5 U ile canulas yıkayın. Pıhtılaşma önlemek için heparinli serum fizyolojik 50 U ile bir kez daha canulas yıkayın.
7. Sıçanlarda ip gelmesini ve infüzyon başlamadan önce en az 24 saat döner izin verin.

3. Demleme

1. Her bir fare ve ölçü glisemi karotis kan 0.15 mL çizin. Juguler canulas yıkayın. Her bir sıçanın her iki canulas pıhtılaşmayı önlemek için heparinize tuzlu 50 U kullanımı.
2. % 2 EDTA içeren 0.5 ml'lik bir toplama tüpü için kan örneği aktarın. 2 dakika 10.000 rpm'de santrifüj ve -20 ° C de plazma dondurmak
3. Aşağıda listelenen infüzyon koşulların her biri için iki adet 60 ml şırınga doldurun. Pompanın arka pozisyon pompa ve yer Şırınga 2 ön konumuna yer Şırınga 1.
4. Y-bağlantı ve sterilize edilmiştir CO-EX T22 boru ile birlikte çözümleri her çift katılın. Harvard 33. şırınga yerleştirinikili şırınga pompası.
5. Kafes alt değiştirin ve kafes ızgara üstten tüm gıda çıkarın.
6. Kafes ızgara üzerine 150 standart yem g ve yer tartılır.
7. Kafes ızgara döner için şırınga bağlayın. Hatları sıkışmış hava kaldırmak için doğru şırınga yıkayın.
8. Infüzyon sistemi için sıçan bağlamadan önce alındı ​​vücut ağırlığı kullanılarak infüzyon akış oranları hesaplayın. Oranlar ml / saat içine glikoz infüzyon hızı (Gir) dönüştüren bir Microsoft Excel dosyası ile hesaplanır.
9. Fabrika ayarlarına göre 60 ml şırınga için akış oranları yönetmek için pompa ayarlayın. Şırınga 1 (ön şırınga) için hızı ve Şırınga 2 (geri şırınga) için oranını girin.
10. Pompayı çalıştır.

4. İzleme

1. Pompayı çalıştırmadan sonra, herhangi bir döner veya canulas sızan ve infüzyon boru bükülmüş değil olduğunu doğrulayın. Ayrıca hiçbir hava kabarcığı olmadığını doğrulayınboru.
2. Infüzyon 3 saat sonra, glisemi izlemek için bir kan örneği almak. , 24, 6 sonra 48 tekrar ve infüzyon 72 saat. Bir önlem olarak, glisemi da infüzyon 30, 34, 54, ve 60 saat sonra izlenir. Kan şekeri taşınabilir bir glikoz monitörü kullanılarak, tam bir damla kan kullanılarak ölçülebilir. Bu infüzyon sırasında alınan kan miktarını sınırlar ve bu nedenle önemli ölçüde değiştiren kan hacmi ve / veya hematokrit önler.
3. Şırınga 1 için oran 220-250 mg / dl kan şekeri korumak için glisemi değerlerine göre değiştirilir. Serbest yağ asitleri 1 mmol / L tutulur çünkü Şırınga 2 oranı infüzyon 72 saat boyunca değişmez
4. İnfüzyon koşulları kontrol hayvanları için alınan ses test hayvanları (Tablo 1) için alınan hacmine eşit olduğunu, eşleştirilir.
5. Infüzyon 24 saat sonra kafesin altına değiştirmek ve kafes ızgara kalan gıda tartın. Yenmemiş kısmı t dönkafes ızgara o. 48 saat sonra tekrarlayın.
6. Yedek şırıngalar günlük olarak infüzyon 72 saat boyunca gerekli.
7. Infüzyon sırasında, her zaman iltihap veya rahatsızlık herhangi bir işaret için fare gözlemlemek. Gerekirse uygun bakım yönetmek.

5. Post-infüzyon Ötenazi

1. Infüzyon 72 saat sonra, sıçanlar, bir ketamin / ksilazin kokteyli (182 ketamin ve 11.6 mg / kg 'mg / kg ksilazin% 0.9 NaCI ile 1:02 seyreltilmiş), 0.5 ml ile intravenöz anestezi uygulanır.
2. Ayak-tutam refleks anestezi seviyesini doğrulamak için kullanılır. Ek anestezi gerektiği gibi yönetilmektedir.
3. Fare anestezi olduğunda, karın boşluğu ameliyat makasları ile açılır. Sıçan aort veya vena kava bir şırınga içinde kan 10-15 ml çizerek exsanguinated edilir.

Sonuçlar

Ameliyat 42 sıçan bir dizi dışında, 5 sıçan ameliyat sonrası dönemde kaybedildi ve 1 sıçan% 86 genel başarı oranı temsil eden, infüzyon sırasında kayboldu. Sonunda infüze edildi 37 sıçanların ortalama vücut ağırlığı 608 oldu ± 5 ameliyat öncesi g ve 588 ± infüzyon başlangıcında 6 g (ortalama ± SE, n = 37, p <0.0001 tarafından t-testi eşleştirilmiş). 72 saatlik enfüzyon süresince, tuzlu su (sal) ve + Intralipid (GLU + IL) Şekiller 2A ve 2B gö...

Tartışmalar

Önceki çalışmalarda bir dizi bilgilerimize kronik glikoz infüzyon (örneğin ^10-15) veya kemirgenlerde lipid (örneğin ^16,17), istihdam olmasına rağmen her iki yakıt kombine infüzyon sadece fareler ¹⁸ bildirilmiştir. Burada sunulan kronik infüzyon modeli sıçanlarda biyolojik fonksiyonları çeşitli besin aşırı üzerindeki etkilerini incelemek için çeşitli avantajlar sunuyor. İlk olarak, genetik olarak obez kemirgenler içermez ve insanlarda ortak o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602