Un modèle d'infusion de nutriments chronique chez le rat

Résumé

Un protocole d'infusions chroniques de glucose et Intralipide chez le rat est décrite. Ce modèle peut être utilisé pour étudier l'impact de l'excès de nutriments sur la fonction des organes et des paramètres physiologiques.

Résumé

L'exposition chronique à des niveaux excessifs de nutriments est postulé pour affecter le fonctionnement de plusieurs organes et de tissus et de contribuer au développement des nombreuses complications liées à l'obésité et le syndrome métabolique, y compris le diabète de type 2. Pour étudier les mécanismes par lesquels des niveaux excessifs de glucose et d'acides gras affectent le pancréas des cellules bêta et la sécrétion d'insuline, nous avons établi un modèle de perfusion nutritive chronique chez le rat. La procédure consiste en la pose de cathéters la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche sous anesthésie générale, qui permet une période de récupération de 7 jours, reliant les cathéters de pompes utilisant un pivot et un système de contrepoids qui permet à l'animal de se déplacer librement dans la cage, et infusant glucose et / ou de l'Intralipid (une émulsion d'huile de soja qui génère un mélange d'environ 80% unsaturated/20% d'acides gras saturés quand infusé avec de l'héparine) pendant 72 heures. Ce modèle offre plusieurs avanges, y compris la possibilité de moduler finement les niveaux cibles de glucose et d'acides gras circulants, l'option de co-insuffler composés pharmacologiques, et le laps de temps relativement court, par opposition aux modèles alimentaires. Il peut être utilisé pour examiner les mécanismes du dysfonctionnement des nutriments induite par une variété d'organes et de tester l'efficacité des médicaments dans ce contexte.

Introduction

Niveaux chroniquement élevés de glucose et de lipides dans la circulation ont été proposées pour contribuer à la pathogenèse du diabète de type 2 en modifiant la fonction de plusieurs organes impliqués dans le maintien de l'homéostasie du glucose, y compris, mais sans s'y limiter, le pancréas des cellules bêta (revue en ^1). Les dépôts d'hypothèse de glucotoxicité que l'hyperglycémie chronique aggrave le défaut des cellules bêta qui a donné lieu à une hyperglycémie, en premier lieu, créant ainsi un cercle vicieux et de contribuer à la détérioration du contrôle de la glycémie chez 2 patients diabétiques de type. De même, l'hypothèse de glucolipotoxicité propose que des élévations concomitantes de la glycémie et des lipides, comme souvent observées dans le diabète de type 2, sont préjudiciables à la cellule beta.

Décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires des effets délétères de nutriments chroniquement élevés sur la fonction des cellules bêta du pancréas est la clé de la understanding de la pathogénie du diabète de type 2 ^1. À cette fin, un grand nombre d'études ont examiné les mécanismes d'excès de nutriments ex vivo chronique dans les îlots de Langerhans isolés ou in vitro dans des lignées de cellules sécrétrices d'insuline clonales. Cependant, la traduction des résultats obtenus dans ces systèmes modèles pour l'ensemble de l'organisme est complexe, notamment parce que les concentrations d'acides gras utilisés dans des cellules en culture ou îlots correspondent rarement les taux circulants dans le voisinage des cellules bêta in vivo ^2. D'autre part, les mécanismes de défaillance des cellules bêta en réponse à un excès de nutriments ont été examinés dans des modèles rongeurs de diabète, comme en témoigne le rat Zucker Diabetic Fatty ^3,4, la gerbille Psammomys obesus ⁵ et le régime riche en gras- Fed souris ^6. Ces modèles, cependant, sont caractérisées par des anomalies métaboliques intrinsèques et ne sont pas facilement prêter à des manipulations de glucose dans le sanget / ou les niveaux de lipides dans un cadre plus contrôlée et moins chronique. Pour être en mesure de modifier les taux circulants de nutriments dans un délai de jours chez les animaux normaux par ailleurs, nous avons développé un modèle de perfusion chronique chez les rats normaux qui nous permet d'examiner les effets des lipides et du glucose, seul ou en combinaison, sur les paramètres et les fonctions physiologiques ^7,8.

Protocole

Vue d'ensemble: La procédure consiste en la pose de cathéters la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche sous anesthésie générale, qui permet une période de récupération de 7 jours, reliant les cathéters de pompes utilisant un pivot et un système de contrepoids qui permet à l'animal de se déplacer librement dans la cage; et infuser le glucose et / ou de l'Intralipid (une émulsion d'huile de soja qui génère un mélange d'environ 80% unsaturated/20% d'acides gras saturés avec de l'héparine lorsque infusé ⁹⁾ pendant 72 heures.

1. Canulation de la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche

1. Stériliser les instruments chirurgicaux. tube de canulation doit également être stérilisé à froid en utilisant un agent de stérilisation liquide (2,6% de glutaraldéhyde) avant la procédure. Plonger le tube dans un contenant stérilisé à l'autoclave pour 16-24 heures. Rincez et rincer abondamment avec de l'eau distillée stérile pour éliminer toutes les traces de glutaraldéhyde avant utilisation.
2. Peser le rat pour calculerdosages de médicaments:
   Carprofen 5 mg / kg: dilution 1/10 = poids corporel (g) x 0,001 ml SC (analgésique)
   Glycopyrrolate 0,01 mg / kg: dilution 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (anticholinergique)
3. Anesthésier le rat en utilisant l'isoflurane et de l'oxygène.
4. Placez le rat sur son estomac. Raser la zone derrière les oreilles à la base des épaulements. Posez le rat sur son dos. Rasez la région sous le cou aux pattes avant.
5. Préparation du site chirurgical à la chlorhexidine, de l'alcool, et de l'iode. Administrer des médicaments.
6. Transférez le rat dans le domaine chirurgical.
7. En utilisant une technique aseptique, canulate la veine jugulaire droite et l'artère carotide gauche avec un PE-50 canule attachée à une seringue de 1 ml remplie avec 5 U de sérum physiologique hépariné. Rincer les canules avec 50 U de sérum physiologique hépariné pour éviter la coagulation au cours de la période de récupération. Utiliser des aiguilles 23G émoussés. Fermez chaque canule avec une épingle 23G.
8. Après la chirurgie, couper environ 2,5 mm de laincisives du bas et placez le rat dans une veste de perfusion pour éviter les canules d'être mangé.
9. Fournir de l'oxygène (1 L / min pendant 10 minutes) pour aider à évacuer l'isoflurane.
10. Placez le rat dans une cage chauffée jusqu'à ce qu'elle soit complètement réveillé.
11. Exploiter quatre rats pour utiliser un par état ​​de perfusion (tableau 1).

2. Soins post-opératoire (traitement post-chirurgical et de la connexion des cathéters)

1. Peser les rats le jour 1 et le jour 2 post-chirurgie.
2. Administrer glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC deux fois le 1er jour post-opératoire et une fois sur 2 jours après l'intervention chirurgicale.
3. Traitements de soutien supplémentaires peuvent être administrés si nécessaire: fluides, tapis de chauffage, l'alimentation humide, l'oxygénothérapie, les analgésiques, les anticholinergiques.
4. Au jour 7 post-chirurgie, peser les rats pour calculer les débits de perfusion.
5. Connectez chaque rat à un système de perfusion à l'aide d'une attache et pivotante montée sur un sommet de la grille de la cage (figure 1).
6. Rincer les canules avec 5 U de sérum physiologique hépariné pour enlever les caillots. Rincer les canules une fois de plus avec 50 U de sérum physiologique hépariné pour empêcher la coagulation.
7. Laisser les rats s'acclimater à la longe et pivotent pendant au moins 24 heures avant le début de la perfusion.

3. Infusion

1. Dessiner 0,15 ml de sang de la carotide de chaque glycémie chez le rat et la mesure. Rincer les canules jugulaires. Utilisez 50 U de sérum physiologique hépariné pour empêcher la coagulation dans les deux canules de chaque rat.
2. Transférer l'échantillon de sang pour un tube collecteur de 0,5 ml contenant 2% d'EDTA. Centrifuger à 10000 rpm pendant 2 min et congeler le plasma à -20 ° C.
3. Remplir deux seringues de 60 ml de chacune des conditions de perfusion répertoriées ci-dessous. Lieu seringue 1 sur la position avant de la pompe et des seringues 2 place sur la position arrière de la pompe.
4. Rejoignez chaque paire de solutions avec raccords en Y et les tubes de T22 CO-EX qui a été stérilisé. Placez les seringues sur une Harvard 33Pompe à deux seringues.
5. Changez le fond de la cage et enlevez tous les aliments de la grille du haut de la cage.
6. Pesez 150 g de norme chow et le placer sur la grille du haut de la cage.
7. Branchez les seringues à l'émerillon sur le gril de la cage. Rincer les seringues correctement pour éliminer l'air emprisonné dans les lignes.
8. Calculer les débits de perfusion en utilisant le poids du corps qui a été prise avant de connecter le rat dans le système de perfusion. Les taux sont calculés avec un fichier Microsoft Excel qui convertit le débit de perfusion de glucose (GIR) en ml / h.
9. Régler la pompe pour administrer des débits de 60 ml seringues selon les réglages du fabricant. Entrez le taux de seringue 1 (seringue avant) et le taux de seringue 2 (arrière seringue).
10. Démarrer la pompe.

4. Surveillance

1. Après le démarrage de la pompe, vérifier qu'il n'y a pas de fuite de la rotule ou des canules et que le tube de perfusion n'est pas tordu. Vérifiez également qu'il n'y a pas de bulles d'airla tubulure.
2. Après 3 heures de perfusion, prélever un échantillon de sang pour contrôler la glycémie. Répétez après 6, 24, 48, et 72 heures de perfusion. Par mesure de précaution, la glycémie est également surveillée après 30, 34, 54, et 60 h de la perfusion. La glycémie peut être mesurée à l'aide d'une goutte de sang total à l'aide d'un moniteur de glucose portable. Cela limite la quantité de sang prélevé pendant la perfusion et évite donc modifier sensiblement le volume sanguin et / ou de l'hématocrite.
3. Le taux de seringue 1 est modifiée en fonction des valeurs de glycémie à maintenir la glycémie à 220-250 mg / dl. Le taux de seringue 2 ne change pas au cours de la perfusion de 72 heures parce que les acides gras libres sont maintenus à 1 mmol / L.
4. conditions liées à la perfusion sont jumelés afin que le volume reçu pour les animaux témoins est équivalent au volume reçu pour les animaux de laboratoire (tableau 1).
5. Après 24 heures de perfusion, changer le fond de la cage et peser les aliments restant dans la grille de la cage. Retourner la partie non consommée to la grille de la cage. Répétez après 48 h.
6. seringues de recharge jour au besoin au cours de l'heure 72 de la perfusion.
7. Au cours de la perfusion, toujours observer le rat pour détecter tout signe d'inflammation ou d'inconfort. Administrer les soins appropriés si nécessaire.

5. Euthanasie post-perfusion

1. Après 72 heures de perfusion, les rats sont anesthésiés par voie intraveineuse avec 0,5 ml d'un cocktail kétamine / xylazine (182 mg / kg de kétamine et de 11,6 mg / kg de xylazine dilué 1:2 avec du NaCl à 0,9%).
2. Le réflexe toe-pincement est utilisé pour vérifier le niveau de l'anesthésie. Anesthésique est administré supplémentaires au besoin.
3. Lorsque le rat est anesthésié, la cavité abdominale est ouverte avec des ciseaux chirurgicaux. Le rat est saigné par tirage de 10 à 15 ml de sang dans une seringue à partir de l'aorte ou la veine cave.

Résultats

Sur une série de 42 rats qui ont subi une chirurgie, 5 rats ont été perdus au cours de la période post-opératoire et 1 rat ont été perdues pendant la perfusion, soit un taux de réussite global de 86%. Le poids corporel moyen des 37 rats qui ont finalement été infusés était de 608 ± 5 g avant la chirurgie et 588 ± 6 g au début de la perfusion (moyenne ± SE, n = 37, p <0,0001 par test t apparié). Les résultats représentatifs suivants ont été obtenus en 2 groupes de perfusion:. Saline (SAL) et de gl...

Discussion

Bien qu'un certain nombre d'études antérieures ont employé des perfusions de glucose chroniques (par exemple ^10-15) ou des lipides (par exemple ^16,17) chez les rongeurs, à notre connaissance la perfusion combinée de ces deux carburants n'a été signalée chez les souris ^18. Le modèle de perfusion chronique présentée ici offre plusieurs avantages à étudier les effets sur les excès de nutriments sur une variété de fonctions biologiques chez les r...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline 0.9%	BD	JB1324
Dextrose 70%	McKesson
Intralipid 20%	Fresenius Kabi	JB6023
Metricide (Glutaraldehyde 2.6%)	Metrex	11-1401
Heparin Sodium 10,000 USP u/ml	PPC
Carprofen	Metacam
Glycopyrrolate	Sandoz
Isoflurane	Abbott
Chlohexidine 2%
Alcohol 70%
Iodine
PE-50	BD	427411
CO-EX T22	Instech Solomon	BCOEX-T22
Connector 22G	Instech Solomon	SC22/15
Swivel 22G	Instech Solomon	375/22PS
Y-Connector 22G	Instech Solomon
Counterbalance and arm	Instech Solomon	CM375BP
23 G blunted needles	Instech Solomon	LS23
23 G canulation pins	Instech Solomon	SP23/12
Tethers (12 inch)	Lomir	RT12D
Infusion jackets	Lomir	RJ01, RJ02, RJ03, RJ04
(SM-XL)
Tether attachment piece	Lomir	RS T1
60 ml syringe	BD	309653
1 ml syringe	BD	309602