العزلة والثقافة، وتوصيف وظيفي من الكبار ماوس Cardiomyoctyes

Summary

نحن هنا وصف عزلة cardiomyoctyes فأر بالغ باستخدام نظام نضح Langendorff. الخلايا الناتجة CA2 +-تسامحا، هادئة كهربائيا ويمكن أن يكون مثقف وtransfected مع-الغدة أو lentiviruses للتلاعب الجيني. ويمكن أيضا تحليل وظائفها باستخدام نظام MMSYS وتقنيات المشبك التصحيح.

Abstract

وقد وفرت استخدام العضلية الأولية (CMS) في الثقافة تكملة قوية لنماذج الفئران من أمراض القلب في دفع فهمنا لمرض القلب. على وجه الخصوص، وقد أدت القدرة على دراسة توازن الأيوني، وظيفة القناة الايونية، استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران والتعديلات في ظروف المريضة والطفرات المسببة للمرض إلى رؤى كبيرة في أمراض القلب. علاوة على ذلك، فإن عدم وجود خط الخلية كافية لتقليد الكبار خلد مضادة، والقيود المفروضة على الأطفال حديثي الولادة مضادة (التي تفتقر إلى العديد من الخصائص الميكانيكا الحيوية الهيكلية والوظيفية من الكبار CMS) في الثقافة أعاقت فهمنا للتفاعل معقد بين مسارات الإشارات، القنوات الأيونية وخصائص مقلص في قلب الكبار تعزيز أهمية دراسة الكبار العضلية معزولة. هنا، فإننا نقدم طرق لعزل والثقافة، والتلاعب في التعبير الجيني عن طريق الغدانية-expreالبروتينات ssed، وتحليل وظيفي لاحقة من العضلية من الماوس الكبار. فإن استخدام هذه التقنيات تساعد على تطوير البصيرة الآلي في مسارات الإشارات التي تنظم استثارة الخلوية، كا ^{2 +} ديناميات وانقباض وتوفير توصيف أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية الكثير من أمراض القلب والشرايين.

Introduction

خدموا نماذج الفئران من مرض القلب والأوعية الدموية كأدوات فعالة لتوضيح الآليات الأساسية المرض ^1،2 فضلا عن تحديد الأهداف العلاجية المحتملة ^1،3. على وجه الخصوص، واستخدام كلا النموذجين الفئران من أمراض القلب المكتسبة (مثل الضغط الزائد) ^4،5 ونماذج الماوس المعدلة وراثيا قد تقدم فهمنا لمرض القلب ^6-8. استخدام تقنيات زراعة الخلايا لدراسة الإشارات شلالات ^3،9،10 وتغييرات في البروتينات الفردية التي تكمن وراء استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران في قلب ^11-13 على مستوى خلية واحدة ويكمل في الجسم الحي نماذج الماوس. ومع ذلك، فإن عدم وجود خطوط الخلايا الكافية التي تعكس هيكل CM الكبار وظيفة جود قيود كبيرة. وقد سعى المحققون للتغلب على هذا من خلال دراسة البروتينات الفردية، مثل القنوات الأيونية، في أنظمة تعبير مغايرة ، وبينما قدمت هذه الدراسات لنا معلومات مفيدة من حيث الفيزياء الحيوية القناة الايونية أو الاتجار البروتين، والتمثيل غير الكافي للالمكروية مواليد مضادة وجود قيود كبيرة. وثانيا، لأن معظم هذه الخلايا مغاير لم يكن لديك جهاز مقلص ناضجة، لم يكن من الممكن لدراسة وظيفة مقلص والتفاعل المعقد بين استثارة الخلوية والانكماش. لهذا السبب، تحولت الباحثين لمزارع الخلايا القلبية الأساسية للعديد من الدراسات في المختبر وظيفية. أخيرا، والدراسات cardiomyocyte معزولة تسمح بتقييم وظيفة مقلص دون عوامل خارجية متعددة الخلايا من إعداد بما في ذلك أثر ندبة أو تليف واتجاه الألياف.

وسهلة نسبيا للثقافة، يمكن أن يصاب الأطفال حديثي الولادة العضلية البطين الفئران الابتدائي (NRVMs) مع الفيروسات الغدية وlentiviruses للتلاعب التعبير الجيني ^15، والثانية تم لذا استخدمت بنجاح ^1، ولكن لديها قيود خاصة بهم. على الرغم من أنها توفر المكروية الفسيولوجية ¹ وكانت العمود الفقري للحقل الإشارات، اختلافات جوهرية بين التشكل وتنظيم التحت خلوية من NRVMs وcardiomyoctyes الكبار جعلها نموذجا غير كافية للتحقيق في تدفقات الأيونية والإثارة، تقلص اقتران في قلب الكبار . أبرزها NRVMs تفتقر إلى نهائي تي أنبوبي الفرعي ^4. منذ كا ^{2 +} تدفق وديناميكية تعتمد بشكل حاسم على ناضجة تي أنبوبي وشبكية الهيولى العضلية (SR) هيكل ^6، كا ^{2 +} ديناميات والدراسات الفنية التابعة للانقباض القلب في NRVMs ليست انعكاسا دقيقا لهذه العمليات الحرجة في العضلية الكبار. علاوة على ذلك، بعض مكونات مسارات الإشارات تختلف بين الأطفال حديثي الولادة والكبار الفئران ^9، وبالتالي توفير الحد أخرى لدراسة عمليات المرض وأنا علىMPACT على استثارة الخلوية وانقباض في NRVMs. أخيرا، وتوزيع آلات مقلص يؤدي إلى متعدد الاتجاهات وغير موحدة تقصير الخلايا مما يحد من دقة القياسات مقلص.

وبالتالي فإن استخدام العضلية الكبار معزولة يوفر أكثر دقة في المختبر نظام النمذجة. نمو استثنائية من المعرفة الذي أصبح ممكنا بفضل التلاعب الجيني للفئران يؤكد أهمية الحصول العضلية المعزولة من الفئران وظيفية. في الواقع، فإن توصيف مضادة الكبار معزولة عن نماذج الماوس وتسليط الضوء على العديد من الأحداث البيولوجية والمرضية. وقد سمحت مضادة معزولة عن نماذج الماوس المعدلة وراثيا للدراسات من ربح أو خسارة وظيفة من البروتينات مقلص على خصائص الخلايا واحدة ^2،16، وقدرتها على البقاء في نماذج الأمراض مثل نقص التروية / ضخه ^17،18، وبالتالي استكمال المعلومات المكتسبة من في الدراسات المجراة علىالفئران حد ذاتها. استخدام الكبار معزولة مضادة من نماذج الفئران من أمراض القلب المكتسبة ^3،19،20 (مثل عرضية الأبهر الناجم عن انقباض الضغط الزائد، الذي يحاكي ارتفاع ضغط الدم أو تضيق الأبهر صمام) أو ممارسة ^5،21 (لنمذجة تضخم الفسيولوجية) يسمح للفحص تفاعل يشير شلالات المتورطين في هذه العمليات مع استثارة الخلوية والإثارة، تقلص اقتران على مستوى خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، والقدرة على التعامل مع التعبير الجيني باستخدام يحركها الغدانية التعبير الجيني في الكبار مضادة يتيح لنا الفرصة لتشريح مكونات مسارات الإشارات المعقدة.

من وجهة نظر الكهربية، وقد تم الجهد خلية كاملة والتجارب المشبك الحالي على الكبار معزولة مضادة حاسمة في توضيح طبيعة التدفقات الأيونية في الأساس وفي مختلف الحالات المرضية. بسبب بنية معقدة من الأغشية الخلوية والمتواجد التفاضليةفي هياكل السقالات بين الكبار مضادة وNRVMs أو خطوط الخلايا مغاير، والقدرة على التصحيح خلايا بالغة يعطي تمثيل أفضل بكثير من آثار بعض البروتينات الغشاء، والبروتينات الهيكلية، والقناة الايونية شركاء التفاعل على المكونات الكهربية للقلب الكبار.

على الرغم من هذه المزايا البارزة في دراسة الكبار العضلية الفئران وعزل وزراعة العضلية الفئران تم تحدي، وحث على ضرورة وصف منظم ودقيق للمنهجية عزل العضلية الماوس قابلة للحياة والمحافظة عليها في الثقافة للسماح مزيد من التلاعب الجيني باستخدام الفيروسية ناقلات. وقد استخدمت الدراسات السابقة إما معزولة تماما الكبار الماوس مضادة أو مستنبت الكبار الفئران مضادة. هذه الأخيرة هي أسهل للثقافة من الماوس الكبار سم، واستخدمت معظم التجارب التلاعب التعبير الجيني في المختبر الفئران الكبار مضادة. غيرت بنجاح قليل من الدراسات والتحقيق الوظائالتعبير الجيني اونال في الماوس الكبار مضادة، وتقديم الحد الكبيرة في نطاق التجارب. وبالتالي، فإننا نقدم هنا في التفاصيل هذه المنهجيات، معدلة من التحقيقات السابقة، لعزل ^{7،8،22 والثقافة 3،10،15،23،} عدوى الفيروسة الغدانية ^11-13،15، والتحليل الوظيفي من الماوس الكبار cardiomyoctyes البطين. هذه النتائج بروتوكول العزلة في كا ^{2 +-تسامحا،} منفعل العضلية التي لدينا مثقف بنجاح لمدة تصل إلى 72 ساعة وعابر مع اتش. وظيفة هذه الخلايا معزولة يمكن تقييمها باستخدام نظام التصوير MMSYS ^14،24 والمشبك التصحيح، والتي ستناقش أيضا.

Protocol

1. Cardiomyocyte عزل

المواد (الشكل 1)

Microdissecting ملقط
ملقط الأنسجة
ملقط مرقئ حساسة
ملقط مرقئ
Microdissecting، مسننة، ملقط منحنية
مقص العاملة، على التوالي
مقص العاملة، منحني
15 مل أنابيب فالكون (5)
60 مم طبق بتري
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)
شبكة النايلون - 400 ميكرون حجم المسام
قمع صغير
الشمع المغلفة، مضفر الحرير 4-0، 19 مم، 7-10 سم طويلة
إبرة تحت الجلد غير، نهاية حادة، 24 G أو إبرة تغذية الحيوان التجارية (24 × 1 في، W/1-1/4)
الهيبارين الصوديوم
خليط الكيتامين / زيلازين
الماصات باستور
اوبتي فيجن تشريح نظارات
نظام IonOptix MMSYS

ملاحظة: إذا زرع خلايا، انظر القسم 2 على زراعة الخلايا قبل البدء في هذا البروتوكول.

ملاحظة: تم يهتم جميع الفئران لفيمنشأة الحاجز والتضحية وفقا للوائح وافق IACUC والممارسات والإجراءات.

ملاحظة: قبل البدء في الإجراء، ينبغي مسخن النظام بأكمله للتأكد من أن جميع عناصر النظام Langendorff (الشكل 2A، الشكل 3) وتحسنت إلى 37 درجة مئوية للسماح للنشاط كولاجيناز السليم والكامل.

1. حقن الفئران الكبار (~ 12 أسبوعا) مع 150 وحدة USP الهيبارين الصوديوم في الفضاء في البطن.
2. تخدير مع حقنة من خليط الكيتامين / زيلازين في الوزن التي تعتمد على جرعة (الجدول 1).
   1. 80:12 ملغ / كغ الكيتامين: صفة زيلازين: 2.6 مل الكيتامين (100 ملغ / مل) + 0.4 مل زيلازين (100 ملغ / مل) + 37 مل PBS. النهائي: الكيتامين = 6.5 ملغ / مل؛ زيلازين = 1 ملغ / مل
3. تأمين الماوس مخدرا إلى لوحة التشغيل، استئصال القلب، ووضع في طبق من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني أو المياه المالحة 0.9٪ (الشكل 1J). فيزالمالحة siologic يسمح قلب سليمة للتعاقد على قذف أفضل من الدم في غرفة وسهولة تحديد الشريان الأورطي قبل إلى الخطوة 1.6. تم فحص الفئران للتأكد من أنها هي تخدير عميق عبر فقدان أطرافهم قرصة أخمص قدميه الخلفيتين العاكسة وتباطؤ معدل التنفس قبل بداية بضع الصدر.
4. استخدام اوبتي فيجن نظارات تشريح (الشكل 1A) لتحديد وفضح الشريان الأورطي. إزالة الأنسجة حول الأبهر، على الرغم من أنه لا تسهيل التصور للسفينة، وليس من الضروري لتعظيم الاستفادة من العزلة الخلية إذا جذر الأبهر واضحة للعيان.
5. رئيس المضخة مع العازلة نضح (الجدول 2). ينبغي أن تعقد في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة الإجراء باستخدام تسيطر عليها، وتعميم حمام الماء (الشكل 2D).
6. جبل القلب على جهاز Langendorff (الشكل 2A). باستخدام اثنين من ملقط تشريح الصغرى (أرقام 1D-E)، والعلاقات العامةIME الشريان الأورطي حول غير الحقن، إبرة حادة نهاية (24 G) مع أنبوب السيليكون في الطرف البعيد. بدلا من إبرة تغذية الحيوان التجارية (24 × 1 في، W/1-1/4) يمكن استخدامها. سوف أنبوب السيليكون على إبرة 24 G أو إبرة تغذية الحيوان تسمح لتأمين خياطة على الأخدود. وضع الشريان الأورطي على الإبرة كما جورب. (الشكل 2C).
   1. ملاحظة: من المهم أن تتأكد من أن نهاية الإبرة تقع في الأبهر الصاعد، من الناحية المثالية في جذر الأبهر القاصي إلى اللامسماة الحق، إلا أنه لا يمتد عبر الصمام الأبهري إلى البطين الأيسر، حيث سيؤدي ذلك بشدة تحد من قدرة المخازن المؤقتة ليروي على نحو فعال من خلال القلب عبر الشرايين التاجية.
7. تأمين القلب إلى إبرة عن طريق ربط بطول صغيرة من خياطة الحرير (7-10 سم) (الشكل 1K) حول الجزء العلوي من الشريان الأورطي، وضمان أن التعادل هو على مستوى الأبهر الصاعد، دون حق اللامسماة ARTERذ، ولكن فوق نهاية الإبرة.
8. خفض القلب في المناطق الداخلية من الزجاج المخروطية (الشكل 2B) للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة الغرفة مناسبة.
9. يروي القلب مع العازلة نضح لمدة 5 دقائق بمعدل 1 مل / دقيقة وكبح تدفق الغرفة الزجاجية للسماح للسائل الإرواء لجمع في الزجاج المخروطية والمغلف للقلب. ويرد التخطيطي للهضم القلب في الشكل 3.
   1. عند هذه النقطة يجب أن تشاهد حجم الزيادة القلب. بالإضافة إلى ذلك، سيتم استبدال الدم في أنسجة القلب عن طريق الإرواء، مما تسبب شحوب الأنسجة.
10. الافراج عن المشبك تدفق لاستنزاف سائل الإرواء. وقف ضخ لنقل الأنابيب من الحاوية عازلة نضح إلى الحاوية عازلة انزيم (الشكل 2E). إعادة تشغيل مضخة للبدء في يروي القلب مع العازلة انزيم (الجدول 2) في 1 مل / دقيقة. المشبك تدفق مرة أخرى للسماح لانزيم المخزن المؤقت المغلف للالقلب.
    1. هنا، كما هو انزيم perfusing القلب وهضم النسيج الضام، فإن القلب يصبح أكثر شحوبا وسوف يقلل السلامة الهيكلية.
    2. لتحديد متى يتم خفض البطينين من القلب هضمها، ورفع القلب من الزجاج المخروطية، الضغط بلطف القلب مع ملقط وجمع بضع قطرات من سائل الإرواء في طبق بتري الصغيرة وتحقق لمعرفة ما إذا كان أو لم تنخفض الخلايا واحد .
    3. للمبتدئ فإنه من المفيد لتوصيل خط نضح مع مقياس ضغط الدم. عندما يتم الحصول على هضمها قلب الضغط سوف ينخفض ​​بسرعة، والنسيج الضام لا يحمل المقاومة. مقياس ضغط الدم مفيد أيضا للمبتدئ لضمان أن موقف الإبرة فوق الصمام الأبهري، وليس في البطين. سوف الضغط المنخفض تشير إلى أن الإبرة في غرفة البطين وأشار أن ارتفاع ضغط إبرة تلامس صمام.
11. قطع البطينين من القلب في طبقالكامل من العازلة نقل (A) (الجدول 2) عندما يبدأ الضغط البطيني إلى تراجع بشكل كبير أو عندما تكون قادرا على رؤية الخلايا واحد في الإرواء. هذا عادة ما يستغرق 7-10 دقيقة ~.
12. مرة أخرى باستخدام ملقط تشريح الصغرى (الشكل 1C)، تخطر على البطينين الى قطع صغيرة لفصل. وهناك الهضم ناجحة يترك تقريبا أي أجزاء صلبة من الأنسجة بعد تنميق، مع معظم الأنسجة تصبح غير متبلور على التفكك.
    1. لمزيد من فصل الأنسجة، ماصة الحل في / خارج باستخدام البلاستيك ماصة باستير (الشكل 4) من الذي كان قد قطع رأس في ل~ 45 درجة زاوية. يخدم هذا التعديل لزيادة المساحة الداخلية للdiametric بالتالي غيض ماصة خفض كمية إجهاد القص على الخلايا كما هو المسحوقة الأنسجة.
    2. قبل تشريح الأنسجة مع ملقط فمن الممكن لفصل الغرف الفردية وحدة فصل الأذيني، البطين الأيسر أو righخلايا البطين ر.
13. تأمين شبكة المربعة الشكل (1M) إلى قمع صغير (الشكل 1L) باستخدام المشابك ووضع هذا الجهاز في تصفية 15ML فالكون أنبوب (الشكل 1I).
14. استخدام ماصة باستير تعديل لإزالة الحل خلية من الطبق وتحديد الحل في أنبوب فالكون.
15. تسمح للخلايا الحية لتستقر في قاع الأنبوب (الترسيب الخلية الحية ينبغي أن تأخذ 2-4 دقيقة).
16. قسامة 2.5ML من كل من الكالسيوم الحلول الأربعة (الجدول 3) في 4 أنابيب 15ML الصقر منفصلة.
17. مرة أخرى باستخدام ماصة باستير القياسية، وإزالة بعناية بيليه الخلية من أسفل الأنبوب ونقل الخلايا إلى الأول من حلول الكالسيوم.
18. تسمح للخلايا لتستقر في قاع الأنبوب وكرر الخطوة 1.17 في الحلول الكالسيوم اللاحقة حتى الخلايا في الحل الأخير.
19. لا تدع خلايا يستقر في fourtالحل ح الكالسيوم. غطاء الأنبوب وتحويلها على جانبها.

2. الثقافة الخلية

1. قبل العزلة، لوحة 1 ميكروغرام / مل laminin الماوس الطبيعية على coverslips الزجاج واحتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 2٪ CO _2. تسمح أيضا الطلاء الخاص بك وسائل الإعلام والثقافة (الجدول 4) لتدفئة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 2٪ CO _2. وهذا يسمح للCO ₂ الذائب في وسائل الإعلام لكي تتوازن.
   1. لا تقم بإزالة الجزء العلوي من وسائل الإعلام. ببساطة تخفيف الأعلى لتجنب التلوث.
2. تسمح للخلايا منعزلة لتكوير في الجزء السفلي من أنبوب فالكون.
3. إزالة بيليه باستخدام البلاستيك القياسية باستور ماصة وresuspend في كمية مناسبة من وسائل الاعلام الطلاء.
4. لوحة الخلايا على لل coverslips المغلفة laminin في طبق الحجم المناسب واحتضان في 37 درجة مئوية و 2٪ CO ₂ لمدة 30-60 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا التمسك لل coverslips.
5. ** إذا transfecting مع اتش، تمييع الفيروس في كمية مناسبة من وسائل الاعلام الطلاء والطلاء تحل محل وسائل الإعلام في الطبق مع وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. السماح للفيروس على خلايا احتضان لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية و 2٪ CO _2. **
6. إزالة وسائل الإعلام الطلاء من الطبق واستبدالها مع وسائل الإعلام والثقافة.
7. تغيير بعناية سائل الإعلام والثقافة في كل يوم حتى لا تعكر صفو الخلايا على لل coverslips.

باستخدام هذا الإجراء، تم تربيتها خلايا بنجاح لمدة تصل إلى 72 ساعة. يمكن الصور من الخلايا المستزرعة وGFP transfected وجدت في الشكل 5.

3. نظام MMSYS

1. السلطة نظام MMSYS ضمان أن مصباح قوس يبدأ أولا.
2. توصيل أنابيب من المضخة إلى مدخل ومخارج مناسبة للغرفة MMSYS (الشكل 6).
3. رئيس النظام مع العازلة الكالسيوم (B) (الجدول 2).
4. وضع APPRالحجم opriately ساترة الزجاج في غرفة وربط (الشكل 6E). معظم غرف MMSYS استخدام إما 22 ملم أو 25 ملم coverslips مربع. راجع دليل المستخدم الخاص بك MMSYS لتحديد ساترة مناسبة للغرفة الخاصة بك.
5. نقل 500 ميكرولتر من الحل الخلية إلى أنبوب إيبندورف الصغيرة.
6. إضافة 0.5 ميكرولتر Fura2-AM (محلول المخزون من 1 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى أنبوب صغير من الخلايا وتسمح لهم احتضان في الظلام في RT لمدة 5-7 دقيقة. وهذا يسمح للFura2-AM إلى "تحميل" في الخلايا من خلال نشر السلبي السريع من خلال غشاء الخلية.
   1. السماح للخلايا تحميل FURA-2 بيليه إلى أسفل الأنبوب، وغسل الزائد FURA مع 500 ميكرولتر من العازلة الكالسيوم B.
7. إطفاء الأنوار الغرفة.
8. باستخدام ماصة باستير القياسية، وانخفاض 1-2 قطرات (وفقا للتركيز الخلية) من "تحميل" حل الخلية في وسط الغرفة (الشكل 6C) وتسمح للخلايا تيس تترسب على ساترة لمدة 5 دقائق.
   1. يجب أن تكون كثافة الخلايا في غرفة واحدة من هذا القبيل أن الخلايا غير متداخلة ويمكن الاطلاع بسهولة في منصة MMSYS الحصول على البيانات.
9. تبدأ بعناية لتدفق العازلة الكالسيوم (B) من خلال الغرفة.
10. زيادة درجة حرارة الغرفة إلى 37 درجة مئوية.
    1. هام: لا تشغيل جهاز التدفئة حتى شرع التدفق. وهذا يمكن أن يلحق ضررا شديدا thermocoupler ردود الفعل (الشكل 6A).
11. تأكد من أن يتم توصيل الدائرة إلى MyoPacer عبر أسلاك الاتصال (الشكل 6B) وتبدأ وتيرة الخلايا 5 هرتز في 1.5X عتبة سرعة للخلايا.
12. اختيار الخلية التي يتم الضرب على التردد الصحيح ونقله إلى الفتحة تأطير.
13. ضبط الكاميرا وتأطير أبعاد الفتحة بحيث الخلية بأكملها في وسط النافذة، توجه أفقيا، مع أب sarcomeresالأصل.
    1. لطول ضبط خلية الحمراء والخضراء (اليمين واليسار) مؤشرات الثنائي الضوئي إلى حافة الخلية. ضبط التباين لتحسين التباين أسود / أبيض على حواف الخلية. الرجوع إلى دليل Ionoptix لمزيد من التفاصيل.
14. وضع مربع في منطقة من الخلية التي تحتوي sarcomeres واضحة المعالم وضبط التركيز لتحسين ذروة طيف الطاقة (الحمراء). أيضا ضبط سطوع المجهر لتحسين تجانس نافذة زرقاء وسوداء على النقيض من المعلومات.
15. ضبط أشرطة عتبة الأخضر لالتقاط أكبر قدر من طيف الطاقة الحمراء (الذروة) والخلفية أقل قدر ممكن.
16. بدء التسجيل.
17. بعد أن تم تسجيل البيانات بما فيه الكفاية، انقر على زر "إيقاف مؤقت" لإيقاف التسجيل مؤقتا، وضمان أن أيا من التركيز ولا أبعاد نافذة عرض يتم تغيير أو نقل مرحلة المجهر لمساحة ساترة التي لم الخلايا أو المواد الخلوية يمكن أن يكون رأيت. ليونGTH تسجيل يختلف اعتمادا على بروتوكول التجريبية المحقق.
    1. ملاحظة: النقر على "إيقاف" سيتم إنهاء تسجيل وسوف لا تكون قادرة على خلفية أن تسجل لتلك الخلية.
18. انقر على "السيرة الذاتية" لتسجيل القياس الخلفية.
19. بعد أن تم تسجيل ما يكفي الخلفية انقر على زر "إيقاف" لإنهاء التسجيل.
20. انقر فوق "ملف حفظ" لحفظ كل آثار لتلك الخلية في واحد. ملف ZPT.
21. كرر الخطوات 3،12-3،20 حتى تم تسجيل ما يكفي من الخلايا.
22. الرجوع إلى دليل المستخدم IonOptix-12 MMSYS حصول على تعليمات حول تحليل البيانات المسجلة. وتظهر البيانات المسجلة سمة من النوع البري العضلية في في الشكل 7.

4. المشبك التصحيح

التصحيح لقط من أنواع مختلفة من الخلايا وصفت جيدا من قبل في هذه المجلة ^25-28. لذا علينا أن نركز على بعض منتقديالمعلمات القاعدة في لقط التصحيح الناجح العضلية الكبار معزولة باستخدام بروتوكول لدينا وصفها.

1. باستخدام ماصة ساحبة والزجاج البورسليكات (مع خيوط: OD 1.5 ملم، 0.86 ملم معرف - 10 سم طول) سحب ماصة التي يسلك ~ 2.0-3.0 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة (الجدول 5).
2. النار تلميع غيض ماصة بلطف باستخدام Narishige أو غيرها من الملمع النار الرأسي. وينبغي أن تكون مقاومة ماصة التصحيح 2-4 MO بعد تلميع النار.
3. بدوره على جهاز الكمبيوتر، مكبر للصوت (Axopatch 200B)، وتحويل م (Digidata 1440A، أكسون صكوك) ومياداة مجهرية (MP-285). للقط التصحيح خلية كاملة، ونحن نبدأ مع معلمات القياسية كما هو موضح سابقا.
4. للبالغين مثقف مضادة، بإزالتها من الحاضنة وغسل بلطف ساترة التي ومطلي اتفاقية الأنواع المهاجرة مع برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
5. بلطف إزالة ساترة ووضعه في غرفة نضح على المجهر المقلوب (نيكون TE 2000).
   1. تأكد من أن مدخل لنظام نضح ومخرج (شفط) هي فقط فوق سطح ساترة.
6. بدء perfusing مع الحل خارج الخلوي المناسبة (الجدول 5).
7. للبالغين فصلها حديثا مضادة، ضع ساترة المغلفة الكولاجين في نظام نضح على النحو الوارد أعلاه.
   1. منذ الخلايا ستكون في الحل، استبدال بلطف حل مع العازلة خارج الخلية.
8. باستخدام ماصة باستير تعديل (الشكل 4)، resuspend بلطف الخلايا في المنطقة العازلة خارج الخلية، واتخاذ قسامة ووضعه على ساترة.
9. السماح للخلايا إرفاق لمدة 10-15 دقيقة قبل بدء نضح كما في 4.4.
10. الخلفية ملء ماصة التصحيح خلية كاملة مع العازلة داخل الخلوية باستخدام Microfil (الآلات الدقيقة العالمي، 28 G) الإبرة. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء في غيض من ماصة؛ اضغط بلطف إلى السماح للفقاعات الهواء لتطفو الى المعالم من الحل.
11. إرفاق ماصة التصحيح شغل إلى حامل ماصة، وضمان أن هناك اتصال بين مسرى مكروي والحل الداخلي.
    1. نستخدم الفضة أقطاب كلوريد، ولكن الاعتناء 'chloriding' أسلاك الفضة على الأقل مرة واحدة في الأسبوع بغمر بين عشية وضحاها في التبييض المنزلية.
12. خفض بلطف ماصة في الحمام، وضمان أن يتم مغمورة القطب حمام في كل الأوقات في الحمام / حل خارج الخلوي. تعويض أي إمكانات تقاطع السائلة في هذا الوقت. قد تكون إمكانات كبيرة تقاطع علامة على تدهور كلوريد الفضة على الأقطاب.
13. ويتم تحديد الكبار أسطواني صحية مضادة في المجهر، وتركزت في مجال الرؤية. كما هو موضح سابقا، وهو مزيج من تحريك مياداة مجهرية وضبط التركيز يسمح مقربة من ماصة التصحيح وسطح سم.
    1. مرة واحدة هم في نفس المستوى البؤري، ونحن نستخدم مزيج من البصريةسعودة الخلية واختبار النبض (متوفرة في Axopatch 200B).
    2. مرة واحدة مقاومة ماصة يقلل إلى النصف (مما يدل على أن ماصة على اتصال مع سطح الخلية)، ويستمر الخلية للبحث أسطواني، ونحن إنشاء ختم gigaohm باستخدام الشفط لطيف.
    3. لمضادة، ونحن نفضل الفم الشفط لإنشاء الضغط السلبي. إذا تم الحصول على gigaseal بنجاح، ونحن مرة أخرى استخدام طيف الإيقاعي شفط الفم ل"في كسر" إلى الخلية لإقامة كله وضع التصحيح الخلية.
14. إمكانات يستريح صحية نموذجية من مضادة هي بالترتيب من -85 إلى -90 بالسيارات. مرة واحدة يتم الحصول على gigaseal، وقياس إمكانات غشاء يستريح باستخدام المشبك الحالية مع I = 0 السلطة الفلسطينية.
    1. إذا تم استقطابها إمكانات غشاء يستريح هذا يمكن أن تشير إلى وجود خلية التالفة أو ختم الفقراء.
15. لأن مضادة هي خلايا كبيرة مع الكثير من مساحة السطح، وتحتاج إلى اهتمام دقيق لدفعها إلى السعة التعويض، خصوصا ثالدجاجة تفعيل بسرعة التيارات مثل قناة الصوديوم يحتاج إلى دراسة. إذا لم يمكن الحصول على تعويض السعة الكافية باستخدام المدمج في إعدادات تعويض على مولد النبض، prepulses في شبه عتبة الجهد، وربما يكون العكس قطبية ليتم تطبيقها والحالية الناتجة تطرح من الإشارات المسجلة. وتمت برمجة هذا البروتوكول بسهولة في Axopatch.
16. مرة واحدة وقد أنشئت كله وضع التصحيح الخلية، وانتظر 15 دقيقة للسماح للموازنة وضمان استقرار الختم قبل بداية الجهد أو بروتوكولات المشبك الحالي. نستخدم البروتوكولات القياسية التي تم وصفها سابقا في هذه المجلات وغيرها من ولن يتم بلورتها.

النتائج

عزلة النتائج cardiomyoctyes الكبار في الخلايا على شكل قضيب، مخططة، وهادئة (لا ضرب عفويا) (الشكل 5A). والخلايا الميتة تبدو مدورة وسوف لا تكون موجودة التصدعات. خلايا هادئة يمكن أن يكون مثقف وtransfected مع اتش للتلاعب التعبير الجيني (أرقام 5B و5C). بعد 24 ساعة من الثقاف?...

Discussion

في هذا التقرير، وصفناها التقنيات اللازمة لعزل ناجحة وثقافة الكبار مضادة من القلب الماوس. أسلوبنا يسمح لدراسة لاحقة من وظيفة CM واستثارة باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه. المعلمة الحرجة لدراسة وظيفة من الكبار مضادة هي الصحة ونوعية مضادة معزولة. كما هو موضح أعلاه، لدي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907