Изоляция, культура и функциональная характеристика взрослой мыши Cardiomyoctyes

Резюме

Здесь мы опишем изоляцию взрослых cardiomyoctyes мыши, используя систему перфузии Лангендорфа. Полученные в результате клетки Ca2 +-терпимым, электрически покоя и можно культивировать и трансфицировали адено-или лентивирусов манипулировать экспрессии генов. Их функциональность также могут быть проанализированы с помощью системы MMSYS и методы патч зажим.

Аннотация

Использование первичных кардиомиоцитов (CMS) в культуре дала мощный дополнением к мышиных моделях болезни сердца в продвижении нашего понимания болезни сердца. В частности, способность к обучению ионный гомеостаз, функции ионного канала, сотовой возбудимость и возбуждение-сжатия сцепление и их изменения в болезненных состояниях и болезнетворных мутаций привели к значительным проникновения в сердечных заболеваний. Кроме того, отсутствие адекватной иммортализированной клеточной линии имитировать взрослых CMS, а также ограничения новорожденных КМ (который лишены многих структурной и функциональной биомеханики характеристикой взрослого КМ) в культуре препятствовали наше понимание сложного взаимодействия между сигнальными путями, ионные каналы и сократительные свойства во взрослом сердце укрепление важность изучения взрослых изолированных кардиомиоцитов. Здесь мы представляем методы выделения, культивирования, манипуляции экспрессии генов с помощью аденовирусной-ExpreSSED белки и последующее функциональный анализ кардиомиоцитов из взрослой мыши. Использование этих методов будет способствовать развитию механистической понимание путей, которые регулируют клеточную возбудимость, Ca ^{2 +} динамику и сократимость сигнализации и обеспечивают гораздо более физиологически соответствующие характеристики сердечно-сосудистых заболеваний.

Введение

Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний послужили эффективных инструментов для выяснения механизмы, фундаментальной болезни ^1,2, а также для идентификации потенциальные терапевтические цели ^1,3. В частности, использование обеих мышиных моделей приобретенных пороков сердца (например, давления-перегрузки) ^4,5 и трансгенные модели мыши продвинулись наше понимание болезни сердца ^6-8. Использование методов культивирования клеток для изучения сигнальных каскадов ^3,9,10 и изменения в отдельных белков, которые лежат в основе клеточного возбудимость и возбуждение-сжатия муфту в центре ^11-13 на уровне одной клетки дополнили в естественных условиях модели мыши. Тем не менее, отсутствие адекватных клеточных линий, которые отражают структуру взрослых CM и функции значительное ограничение. Исследователи стремились преодолеть эту проблему путем изучения отдельных белков, таких как ионные каналы, в гетерологичных экспрессирующих системах 14, и, хотя эти исследования предоставили нам полезную информацию с точки зрения биофизики ионных каналов или перемещения белков, недостаточного представительства родного микросреды РВ является существенным ограничением. Во-вторых, так как большинство этих чужеродных клеток не имеют зрелые сократительной аппарата, это не удалось изучить сократительную функцию и сложное взаимодействие между клеточная возбудимость и сжатия. По этой причине, исследователи обратились к первичных культурах клеток сердца для многих из их в пробирке функциональных исследований. Наконец, отдельные исследования кардиомиоцитов позволит оценку сократительной функции без вмешивающихся факторов многоклеточного подготовке включая влияние рубец или фиброз и ориентации волокон.

Первичные новорожденных крыс желудочковая кардиомиоциты (NRVMs) сравнительно легко культуры, могут быть инфицированы аденовирусы и лентивирусы манипулировать экспрессии генов ^15,й поэтому были успешно ¹ используется, но имеют ограничения своих собственных. Хотя они обеспечивают физиологическую микросреду ¹ и были рабочей лошадкой области сигнализации, существенные различия между морфологии и внутриклеточной организации NRVMs и взрослых cardiomyoctyes сделать их неадекватной модели для исследования ионных потоков и возбуждение-сжатия связи в взрослом сердце . В частности NRVMs хватает окончательного т-трубчатые подсистему ^4. С Са ^{2 +} поток и динамика критически зависят от зрелой т-трубчатых и саркоплазматического ретикулума (СР) структуры ^6, Ca ^{2 +} динамики и функциональных исследований сократительной способности сердечной мышцы в NRVMs не являются точным отражением этих критических процессов у взрослых кардиомиоцитов. Кроме того, некоторые компоненты сигнальных путей различаются новорожденных и взрослых мышей ^9, тем самым обеспечивая еще одно ограничение для изучения болезненные процессы и их IMPACT на клеточная возбудимость и сократимость в NRVMs. Наконец, распределение сократительной техники приводит к разнонаправленного и неравномерного сокращения клеток, ограничивающего точность измерений сократительной.

Использование изолированных взрослых кардиомиоцитов предоставляет поэтому более точную систему моделирования в пробирке. Внеочередное рост знаний стало возможным благодаря генетической манипуляции мышей подчеркивает значимость получения функциональных изолированных кардиомиоцитов мышей. На самом деле, характеристика взрослых КМ, выделенных из мышиных моделях пролил свет на многих биологических и патологических событий. Изолированные КМ от трансгенных мышиных моделях позволили для изучения прибыли или потери функции белков на сократительных свойств отдельных клеток ^2,16, и жизнеспособности в моделях заболеваний, таких как ишемии / реперфузии ^17,18, тем самым дополняя информацию, полученную от в VIVO исследованиямышей SE. Использование изолированных взрослых МС из мышиных моделей приобретенных пороков сердца ^3,19,20 (например, поперечной сужением аорты, вызванной перегрузкой давлением, который имитирует гипертонией или аортальный стеноз клапана) или осуществления ^5,21 (для моделирования физиологической гипертрофии) позволяет на экспертизу взаимодействия сигнальных каскадов, участвующих в этих процессах с сотовой возбудимости и возбуждение-сжатия муфты на уровне одной клетки. Кроме того, способность манипулировать экспрессии генов с помощью генной экспрессии аденовируса приводом во взрослой КМ дает нам возможность анализировать компоненты сложных сигнальных путей.

С электрофизиологических точки зрения, напряжение цельноклеточная и текущие эксперименты зажим на изолированные взрослого КМ были критически в понимании природы ионных потоков в начале исследования и в различных болезненных состояний. Из-за сложной структуры клеточной мембраны и дифференциального защв строительных лесов структур между взрослой КМ и NRVMs или гетерологичными клеточных линий, способность патч взрослые клетки дает гораздо лучшее представление о последствиях определенных мембранных белков, структурных белков и ионных каналов, взаимодействующих партнеров по электрофизиологических компонентов взрослого сердца.

Несмотря на такие выдающиеся преимущества в изучении взрослых мышиных кардиомиоцитов, выделения и культивирования взрослых мышей кардиомиоциты была сложной, призывая необходимость систематического и точного описания методологии выделения жизнеспособных кардиомиоцитов мыши и поддержания их в культуре, чтобы позволить дальнейшее генетические манипуляции с помощью вирусной векторы. Предыдущие исследования использовали либо остро изолированы мышь взрослых см или культивируют крыса взрослых CMS. Последнее легче культуры, чем взрослых мышей КМ, и большинство экспериментов манипулирования экспрессию генов в пробирке использовали крыс взрослых CMS. В нескольких исследованиях успешно изменен и исследованы functiортогональной экспрессии генов в мышь взрослого МС, представляя большое ограничение в объем экспериментов. Таким образом, здесь мы представляем в деталях таких методологий, модифицированные из предыдущих исследований, для изоляции ^7,8,22, культуры ^3,10,15,23, аденовирусной инфекции ^11-13,15 и функционального анализа взрослых мышей желудочковой cardiomyoctyes. Этот протокол изоляция приводит к Ca ^{2 +-толерантных,} возбудимых кардиомиоцитов, что мы успешно культивировали в течение до 72 часов, а трансфицированы аденовирусом. Функциональность этих изолированных клеток можно оценить с помощью системы визуализации MMSYS ^14,24 и патч зажим, который также будет обсуждаться.

протокол

1. Кардиомиоцитов изоляции

Материалы (рис. 1)

Microdissecting щипцы
Хирургический пинцет
Нежные гемостаза щипцы
Кровоостанавливающие щипцы
Microdissecting, зубчатые, изогнутые щипцы
Операционные ножницы, прямые
Операционные ножницы, изогнутые
15 мл Сокол труб (5)
60 мм чашки Петри
Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS)
Сетки нейлона - размер пор 400 мкм
Малый воронки
Воск покрытием, плетеный шелк 4-0, 19 мм, 7-10 см длиной
Номера для подкожных инъекций, тупой конец, 24 G или коммерческой животное вскармливания иглы (24 х 1 в, W/1-1/4)
Гепарин натрия
Кетамин / ксилазина смесь
Пастера Пипетки
OptiVision Пройдя очки
Система IonOptix MMSYS

Примечание: Если культивирования клеток, см. раздел 2 на культуре клеток перед началом этого протокола.

Примечание: Все мыши уход вбарьером объект и жертву в соответствии с утвержденными правилами IACUC, практики и процедур.

Примечание: Перед началом процедуры, вся система должна быть предварительно нагрета для того, чтобы все элементы системы Лангендорфа (рис. 2А, рисунок 3) нагревают до 37 ° С для обеспечения надлежащего и полного активности коллагеназы.

1. Введите взрослых мышей (~ 12 недель) с 150 USP единицы гепарина натрия в брюшной полости.
2. Обезболить с инъекцией кетамина / ксилазина смеси при массовом зависит от дозы (Таблица 1).
   1. 80:12 мг / кг кетамина: ксилазина рецепт: 2,6 мл кетамина (100 мг / мл) + 0,4 мл ксилазина (100 мг / мл) + 37 мл PBS. Итоговый: кетамин = 6,5 мг / мл; ксилазина = 1 мг / мл
3. Закрепите отключке мышь для операционной площадку, вырезать сердце, и поместите в блюдо при комнатной температуре PBS или 0,9% раствором (рис. 1J). Physiologic солевой позволяет нетронутыми сердце сокращаться для лучшего экструзии крови в камере и легкой идентификации аорты перед стадией 1.6. Мыши были проверены, чтобы гарантировать, что они глубоко под наркозом с помощью потери задних конечностей ног пинч рефлекса и замедлением частоты дыхания до начала торакотомии.
4. Используйте OptiVision рассекает очки (рис. 1А) для выявления и разоблачения аорту. Удаление ткани вокруг аорты, хотя он облегчить визуализацию судна, не является необходимым для оптимизации выделения клеток, если корня аорты четко виден.
5. Prime насос с перфузии буфером (табл. 2). Температура должна оставаться при 37 ° С для продолжительности процедуры с использованием управляемой, циркулирующих на водяной бане (Рисунок 2D).
6. Установите сердце на аппарате Лангендорфа (рис. 2А). С помощью двух микро-диссекции (рис. 1D-E), прIME аорту вокруг не-подкожной, тупым концом иглы (24 G) с силиконовой трубки на дальнем чаевых. В качестве альтернативы коммерческим животных вскармливания иглы (24 х 1 в, W/1-1/4) могут быть использованы. Силиконовые трубки на иглу 24 G или кормов для животных иглы позволит обеспечить шва над канавкой. Поместите аорты на иглу, как носок. (Рис. 2в).
   1. Примечание: Важно быть уверенным, что конец иглы упирается в восходящей аорты, в идеале в корень аорты дистальнее правой безымянной, но оно не распространяется через аортальный клапан в левый желудочек, так как это повлечет за собой серьезное ограничить способность буферов эффективно заливать через сердце через коронарные артерии.
7. Безопасность сердца, чтобы иглы, связывая небольшой длины сшивающего шелка (7-10 см длиной) (рис. 1k) вокруг верхней части аорты, обеспечивая, что связь находится на уровне восходящей аорты, ниже правой подвздошной артерийу, но выше конца иглы.
8. Опустить сердце внутрь конического стекла (рис. 2В), чтобы помочь поддерживать подходящую температуру окружающей среды.
9. Заливать сердце перфузии буфера в течение 5 мин со скоростью 1 мл / мин и зажим отток стекло камеры, чтобы позволить Перфузат собрать в конической стекла и конверт сердце. Схема для переваривания сердце показано на рисунке 3.
   1. В этот момент вы должны увидеть объем увеличения сердца. Кроме того, кровь в ткани сердца будет заменен перфузата, в результате чего ткани бледность.
10. Отпустите отток зажим для слива перфузата. Выключить насос для перемещения труб из буферного контейнера перфузии в буферную емкость фермента (рис. 2Е). Вновь включить насос, чтобы начать заливать сердце с ферментом буфера (табл. 2) со скоростью 1 мл / мин. Зажмите отток снова, чтобы буфер фермент конвертсердце.
    1. Здесь, как и фермент перфузии сердце и переваривания соединительной ткани, сердце станет бледнее и структурная целостность будет уменьшаться.
    2. Чтобы определить, когда, чтобы сократить желудочки от переваренной сердце, поднимите сердце из конической стекла, слегка сжать сердце щипцами и собирать несколько капель перфузата в небольшом чашку Петри и проверить, действительно ли отдельные клетки падают .
    3. Для новичка это полезно для подключения перфузии линию с помощью манометра. Когда сердце становится переваривается давление будет быстро снижаться, так как соединительная ткань не имеет сопротивление. Манометр также полезно для начинающих, чтобы обеспечить, что положение иглы выше аортального клапана, а не в желудочке. Низкое давление будет указано, что игла находится в камеры желудочка и высокого давления показал, что игла коснется клапан.
11. Вырезать желудочки от сердца в блюдополный перевод буфера (А) (табл. 2), когда желудочка давление начинает резко падать или, когда вы находитесь в состоянии видеть отдельные клетки в перфузата. Это обычно занимает ~ 7-10 мин.
12. Опять с помощью микро-диссекции (рис. 1С), пропустить через мясорубку желудочки на мелкие кусочки, чтобы отделить. Успешный пищеварение не оставит почти никаких твердых кусков ткани после мясорубки, причем большинство из ткани становится аморфным при диссоциации.
    1. Для дальнейшего отделить ткани, пипетки раствор в / с использованием пластиковой пипетки Пастера (рис. 4), из которого кончик был сокращен под углом ~ 45 °. Эта модификация служит для увеличения внутреннего пространства диаметральное наконечник пипетки таким образом уменьшая количество напряжения сдвига на клетках как ткань растирают.
    2. Перед рассмотрением ткани пинцетом можно выделить отдельные камеры и отдельно отделить предсердий, левого желудочка или Рогт желудочковая клетки.
13. Закрепите квадрат сетки (рис. 1M) в небольшой воронке (рис. 1 л) с помощью зажимов и поместите эту фильтрации аппарат в 15 мл трубки Сокол (рис. 1и).
14. Используйте модифицированный пипетки Пастера Для удаления раствора клеток от блюда и фильтрации раствора в трубки Сокол.
15. Разрешить живые клетки оседают на дне пробирки (в живом оседания клеток следует принимать 2-4 мин).
16. Аликвоты 2,5 мл каждого из четырех растворов кальция (табл. 3) в 4 отдельных 15 мл пробирки Фалкон.
17. Опять же, используя стандартный пипетки Пастера, осторожно удалить осадок клеток из нижней части трубы и передачи клеткам первый из растворов кальция.
18. Разрешить клетки оседают на дне пробирки и повторить шаг 1,17 в последующих решений кальция, пока клетки не находятся в последнем растворе.
19. Не позволяйте клетки поселиться в FourtРешение ч кальция. Закройте пробирку крышкой и поверните его на бок.

2. Культура клеток

1. Перед изоляции, пластина 1 мкг / мл природный мышь ламинин на покровные стекла и инкубировать в течение по крайней мере 1 час при 37 ° С и 2% CO _2. Также позволит вашему покрытие и культура СМИ (табл. 4), чтобы нагреть в инкубаторе при температуре 37 ° С и 2% СО _2. Это позволяет растворенного CO ₂ в средствах массовой информации, чтобы уравновесить.
   1. Не снимайте верхнюю из средств массовой информации. Просто ослабьте верхнюю, чтобы избежать загрязнения.
2. Разрешить изолированные клетки для осаждения в нижней части трубки сокола.
3. Удаление осадка с использованием стандартного пластиковой пипетки Пастера и ресуспендируют в соответствующем количестве покрытие носитель.
4. Пластина клеток на ламинин покрытием покровные в соответствующем тарелка и инкубировать в 37 ° С и 2% СО ₂ в течение по крайней мере 30-60 мин, чтобы позволить клеткам прилипать к покровные.
5. ** Если трансфекции с аденовируса, разбавленной вирус в соответствующем количестве обшивки сред и заменить носитель металлизации в чашке с содержащей вирус массовой информации. Пусть вирус инкубировать на клетках в течение 2 часов в 37 ° С и 2% CO _2. **
6. Снимите обшивки носитель из тарелки и заменить питательных сред.
7. Тщательно изменить питательных сред каждый день, чтобы не беспокоить клеток на покровные.

С помощью этой процедуры клетки были успешно культивировали в течение до 72 часов. Изображения культивируемых и GFP трансфицированные клетки могут быть найдены на рисунке 5.

3. MMSYS система

1. Питание системы MMSYS обеспечение того, чтобы дуговая лампа инициируется в первую очередь.
2. Подключите трубки от насоса к соответствующему выходе и входе камеры MMSYS (рис. 6).
3. Prime система с буфером кальция (B) (табл. 2).
4. Поставьте проверopriately размера стекло покровное в камеру и закрепите (рис. 6е). Большинство MMSYS камеры использовать либо 22 мм или 25 мм квадратных покровные. Обратитесь к инструкции по эксплуатации MMSYS для определения соответствующего покровное для вашего камере.
5. Передача 500 мкл клеточной раствора до небольшого пробирку Эппендорфа.
6. Добавить 0,5 мкл fura2-AM (исходный раствор из 1 мкг / мкл) в трубочку клеток и дать им возможность инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Это позволяет fura2-AM к "нагрузке" в клетки за счет быстрого пассивной диффузии через клеточную мембрану.
   1. Пусть Fura-2 нагруженные клетки осаждения на дне пробирки, и мыть избыток Fura с 500 мкл буфера B. кальция
7. Выключите свет в комнате.
8. Используя стандартный пипетки Пастера, падение 1-2 капли (в зависимости от концентрации клеток) на "загруженного" клеток раствора в центре камеры (рис. 6C) и позволяют клеткам Tо оседают на покровное течение 5 мин.
   1. Плотность клеток в камере должна быть такой, что отдельные неперекрывающихся клетки можно легко просматривать на платформе сбора данных MMSYS.
9. Осторожно начинают течь буфер кальция (B) через камеру.
10. Увеличьте температуру в камере до 37 ° C.
    1. ВАЖНО: Не включайте нагревательного устройства, пока не была начата поток. Это может серьезно повредить обратной thermocoupler (Рисунок 6а).
11. Убедитесь, что камера подключена к MyoPacer через соединительных проводов (рис. 6, б) и начать ходить по клеткам 5 Гц в 1,5 раза шагание порогового для клеток.
12. Выберите ячейку, бьется с правильной частотой и переместить его в обрамление проема.
13. Регулировка размеры апертуры камеры и обрамление, так что весь ячейка находится в центре окна, направлены горизонтально, с точкой доступа саркомерыродитель.
    1. Для длины ячейки отрегулировать красный и зеленый (справа и слева) показатели фотодиод к краю клетки. Настройте контрастность оптимизировать черный / белый контраст на краях клетки. Обратитесь к руководству Ionoptix для уточнения деталей.
14. Поместите коробку в районе ячейке, содержащей четкие саркомеры и настроить фокус, чтобы оптимизировать пик спектра мощности (красный). Также отрегулировать яркость микроскопом оптимизировать синее окно сглаживания и черный информацию контрастности.
15. Отрегулируйте зеленые пороговые баров захватить как можно больше спектра красный Мощность (пиковая) и как мало фоне, как это возможно.
16. Начните запись.
17. После был записан достаточно данных, нажмите «Пауза», чтобы временно остановить запись и, убедившись, что ни в центре внимания, ни размеры окна просмотра меняются, двигаться этап микроскопа к области покровного стекла, в котором ни одна ячейка или клеточный материал не может быть видел. ЛенGTH записи варьируется в зависимости от экспериментального протокола следователя.
    1. Примечание: При нажатии "Стоп" будет прервать запись и фон не смогут быть записаны для этой ячейки.
18. Нажмите кнопку "Продолжить", чтобы записать измерение фона.
19. После достаточно фон был записан нажмите "Стоп", чтобы прервать запись.
20. Нажмите "File >> Save", чтобы сохранить все следы для этой ячейки в одном. Файл ЗПТ.
21. Повторите шаги 3,12 - 3,20 до достаточное количество клеток не зафиксировано.
22. Обратитесь к руководству пользователя IonOptix-MMSYS 12 Инструкции по анализу записанных данных. Характерные записанные данные кардиомиоцитов дикого типа показаны в на рисунке 7.

4. Патч зажим

Patch зажима из различных типов клеток были хорошо описаны ранее в этом журнале ^25-28. Поэтому мы сосредоточены на какой-то критикаль параметры для успешного фиксации потенциала взрослых кардиомиоцитов выделяют, используя описанный наш протокол.

1. С помощью пипетки съемник и боросиликатного стекла (с нити: OD 1,5 мм, ID 0,86 мм - 10 см длина) тянуть пипетки, которая демонстрирует ~ 2,0-3,0 МОм при заполнении пипетки раствора (табл. 5).
2. Противопожарные польский пипетки осторожно, используя Narishige или другое вертикальное пожарной полировщик. Сопротивление патч пипетки должно быть 2-4 MO после пожара полировки.
3. Включите компьютер, усилитель (Axopatch 200B), АЦП (Digidata 1440A, Axon Instruments) и Микроманипулятор (MP-285). Для целой клетки фиксации потенциала, мы начинаем со стандартными параметрами, как описано выше.
4. Для культивируют взрослого КМ, удалить их из инкубатора и аккуратно мыть покровное на которой КМ высевают с PBS при комнатной температуре.
5. Аккуратно снимите покровное и поместить его в перфузии камеры на инвертированный микроскоп (Nikon TE 2000).
   1. Убедитесь, что входное отверстие для системы перфузии и выходе (для всасывания) только над поверхностью покровного стекла.
6. Начните перфузии с соответствующим внеклеточного раствора (табл. 5).
7. Для недавно в отрыве взрослого КМ, разместить коллагена покрытием покровное в системе перфузии, как указано выше.
   1. Поскольку клетки будут находиться в растворе, аккуратно заменить раствор с внеклеточной буфера.
8. Используя модифицированный пипетки Пастера (рис. 4), мягко ресуспендирования клеток во внеклеточной буфера, принять аликвоты и поместить его на покровное.
9. Пусть клетки приложить на 10-15 мин перед началом перфузии как в 4.4.
10. Back-заполнить весь клеток патч пипетки с внутриклеточной буфера с помощью Microfil (инструменты Всемирного Precision, 28 G) иглы. Убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха в кончике пипетки; слегка постучите, чтобы пузырьки воздуха всплывать на SurfACE раствора.
11. Прикрепите заполненную патч пипетки пипетки держателя, гарантируя, что есть контакт между микроэлектродом и внутреннего решения.
    1. Мы используем хлорид серебра электродов, но заботиться о "хлорирующим" серебряные провода, по крайней мере один раз в неделю, погружая на ночь в бытовой отбеливатель.
12. Осторожно опустите пипетки в ванну, гарантируя, что ванна электрод погружен во все времена в ванной / внеклеточного раствора. Смещение любые электрохимических потенциалов в это время. Большие распределительные потенциалы могут быть признаком ухудшения хлорида серебра на электродах.
13. Здоровый цилиндрическая взрослых МС идентифицированы в микроскоп и в центре поля зрения. Как описано выше, сочетание перемещении микроманипулятор и регулировки фокуса позволяет непосредственной близости от патч-пипетки и поверхностью КМ.
    1. Как только они находятся в той же фокальной плоскости, мы используем комбинацию визуальныхзация клетки и тестового импульса (доступной в Axopatch 200B).
    2. После того, как сопротивление пипетки уменьшает в два раза (предполагая, что пипетка находится в контакте с поверхностью клетки), и клетка продолжает искать цилиндрические, мы устанавливаем гигаом печать с использованием нежное всасывание.
    3. Для МС, мы предпочитаем всасывания рот установить отрицательное давление. Если gigaseal успешно получены, мы снова нежный ритмическую всасывания рот, чтобы "Break-In" в клетку, чтобы установить весь режим клеток патч.
14. Типичные потенциалы отдыхая здорового КМ в порядке -85 до -90 мВ. После того, как gigaseal получается, измерить мембранный потенциал покоя с помощью токовых клещей с I = 0 Па.
    1. Если мембранный потенциал покоя деполяризуется это может указывать на поврежденный элемент или плохой печать.
15. Поскольку КМ являются крупные клетки с большим количеством площади поверхности, особое внимание должно быть уделено емкости компенсации, особенно сокурица быстро активации токи, такие как натриевый канал должен быть изучен. Если адекватная компенсация емкость не может быть получена с помощью встроенного в установками компенсации на генератор импульсов, предымпульсов на суб-пороговым напряжением и противоположной полярности могут должны применяться, и результирующий ток вычитается из записанного сигнала. Такой протокол легко программируется в Axopatch.
16. После того, как вся Режим клеток патч был создан, ждать 15 минут, чтобы обеспечить равновесия и обеспечение стабильности печатью до начала напряжения или тока протоколов зажима. Мы используем стандартные протоколы, которые были описаны ранее в этом и других журналах, а не будут подробно раскрыты.

Результаты

Изоляция взрослых cardiomyoctyes результатов в палочковидных, поперечно-полосатых и покоя (не спонтанно избиение) клеток (рис. 5А). Мертвые клетки будет выглядеть округлые и нет страты не будет присутствовать. Покоя клетки можно культивировать и трансфицировали аденовируса манипули?...

Обсуждение

В этом докладе, мы описали методов, необходимых для успешного выделения и культуры взрослого КМ от сердца мыши. Наша методика позволяет последующим изучением функции см и возбудимости использованием способов, описанных выше. Критическим параметром для изучения функциональности взро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907