Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Resumo

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Resumo

O uso de cardiomiócitos primários (CMS), em cultura tem proporcionado um complemento poderoso para modelos murinos de doenças do coração em avançar na compreensão de doenças do coração. Em particular, a possibilidade de estudar a homeostase de íons, função canal iônico, excitabilidade celular e acoplamento excitação-contração e suas alterações em condições de doentes e por mutações causadoras de doenças levaram a insights significativos sobre doenças cardíacas. Além disso, a falta de uma linha de células adequada imortalizado para imitar adulto CMs, e as limitações dos CMs neonatal (que não têm muitos da característica biomecânica estrutural e funcional do adulto CMs) na cultura têm dificultado a compreensão da complexa interação entre as vias de sinalização, canais iônicos e propriedades contráteis no coração adulto reforçando a importância do estudo adultos cardiomiócitos isolados. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento, a cultura, a manipulação da expressão gênica por adenovírus-expreproteínas sseD, e posterior análise funcional dos cardiomiócitos do rato adulto. O uso destas técnicas irá ajudar a desenvolver uma visão mecanicista em vias de sinalização que regulam a excitabilidade celular, Ca ^{2 +} dinâmica e contratilidade e fornecer uma caracterização muito mais fisiologicamente relevante de doença cardiovascular.

Introdução

Modelos murinos de doenças cardiovasculares têm servido como ferramentas eficazes para elucidar os mecanismos fundamentais de doença ^1,2, bem como para identificar potenciais alvos terapêuticos ^1,3. Em particular, o uso de ambos os modelos de murino de doença cardíaca adquirida (tais como sobrecarga de volume) ^4,5 e modelos de ratinhos transgénicos têm avanços na compreensão da doença cardíaca ^6-8. A utilização de técnicas de cultura celular para estudar cascatas de sinalização ^3,9,10 e alterações em proteínas individuais que estão subjacentes a excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção no coração ^11-13 ao nível de uma única célula foram complementados os modelos in vivo de ratinho. No entanto, a falta de linhas celulares adequadas que reflectem a estrutura e função de adulto CM tem sido uma limitação significativa. Os investigadores têm tentado ultrapassar esta estudando proteínas individuais, tais como a canais de iões, em sistemas de expressão heterólogos ^{14, e, embora estes estudos nos forneceu informações úteis em termos de biofísica canais iônicos ou tráfico de proteína, a representação inadequada do microambiente nativo de CMs é uma limitação significativa. Em segundo lugar, já que a maioria dessas células heterólogas não tem um aparelho contrátil maduro, não foi possível estudar a função contrátil e da complexa interação entre excitabilidade celular e contração. Por esse motivo, os investigadores voltaram-se para as culturas de células cardíacas primárias para muitos dos seus estudos funcionais in vitro. Finalmente, os estudos de cardiomiócitos isolados permitir a avaliação da função contrátil, sem os fatores de confusão de preparação multicelular, incluindo o efeito de cicatriz ou fibrose e orientação das fibras.}

Cardiomiócitos ventriculares de rato neonatal primárias (NRVMs) são relativamente fáceis de cultura, podem ser infectadas com adenovirus e lentivírus para manipular a expressão do gene ^15, umaª Assim, foram utilizadas com sucesso ^1, mas têm limitações próprias. Embora eles fornecem um microambiente fisiológico ¹ e tem sido o carro-chefe do campo de sinalização, diferenças substanciais entre a morfologia ea organização subcelular de NRVMs e cardiomyoctyes adultos torná-los um modelo inadequado para a investigação de fluxos iônicos e acoplamento excitação-contração no coração de adultos . Mais notavelmente NRVMs falta uma t-tubular subsistema definitiva ^4. Desde Ca ^{2 +} fluxo e dinâmica é criticamente dependente maduro t-tubular e retículo sarcoplasmático (RS) estrutura ^6, Ca ^{2 +} dinâmica e estudos funcionais da contratilidade cardíaca em NRVMs não são um reflexo preciso desses processos críticos em cardiomiócitos adultos. Além disso, alguns componentes de vias de sinalização diferente entre ratos neonatal e adulto ^9, proporcionando assim uma outra limitação para o estudo de processos de doença e sua icompactas na excitabilidade celular e contratilidade em NRVMs. Finalmente, a distribuição da máquina contrátil leva ao encurtamento célula multidireccional e não uniforme, limitando a precisão das medições contrácteis.

O uso de cardiomiócitos adultos isolados fornece, portanto, um sistema in vitro de modelagem mais precisa. O crescimento extraordinário do conhecimento tornada possível pela manipulação genética de ratinhos sublinha a importância da obtenção funcionais cardiomiócitos isolados a partir de murganhos. Na verdade, a caracterização dos CMs adultas isoladas de modelos de mouse lançou luz sobre muitos eventos biológicos e patológicos. CMs isoladas a partir de modelos de camundongos transgênicos têm permitido estudos sobre o ganho ou perda de função das proteínas nas propriedades contráteis de células individuais ^2,16, e viabilidade em modelos de doenças, como a isquemia / reperfusão ^17,18, complementando, assim, informações obtidas a partir de estudos in vivo sobre oratinhos SE. Uso de isolado adulto CMs de modelos murinos de doença cardíaca adquirida ^3,19,20 (como sobrecarga de pressão induzida pela constrição da aorta transversa, que a hipertensão imita ou estenose da válvula aórtica) ou exercício ^5,21 (para a modelagem de hipertrofia fisiológica) permite a análise da interacção de cascatas de sinalização envolvidos nestes processos com excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção ao nível de uma única célula. Além disso, a capacidade de manipular a expressão de genes usando a expressão do gene dirigido adenoviral no adulto CMs nos oferece a oportunidade para dissecar os componentes de vias de sinalização complexas.

Do ponto de vista eletrofisiológico, a tensão de célula inteira e experiências atuais sobre grampo isolado adulto CMs foram fundamentais para elucidar a natureza dos fluxos iônicos no início do estudo e em vários estados de doença. Devido à estrutura complexa da membrana celular e a prote diferencialem estruturas de andaimes adulto entre as linhas de células heterólogas CMs e NRVMs ou, a capacidade de corrigir células adultas dá um muito melhor representação dos efeitos de certas proteínas de membrana, proteínas estruturais, e os parceiros de canais iónicos que interagem nos componentes electrofisiológicas do coração de adulto.

Apesar de tais vantagens proeminentes no estudo adultos cardiomiócitos murinos, isolar e cultivar cardiomiócitos ratos adultos tem sido um desafio, pedindo que a necessidade de uma descrição sistemática e precisa da metodologia para isolar cardiomiócitos viáveis ​​do mouse e mantê-los na cultura para permitir ainda mais a manipulação genética usando viral vetores. Estudos anteriores já haviam usado tanto agudamente isolado do rato adulto CMs ou culta rato adulto CMs. Estes últimos são mais fáceis de cultura de rato adulto CMs, ea maioria dos experimentos manipulando expressão gênica in vitro têm usado rato adulto CMs. Poucos estudos têm alterado e investigados functi com sucessoa expressão do gene onal em rato adulto CMs, apresentando uma grande limitação no âmbito de experiências. Portanto, aqui apresentamos detalhadamente tais metodologias, modificado a partir de investigações anteriores, para o isolamento ^7,8,22, cultura ^3,10,15,23, infecção adenovírus ^11-13,15, e análise funcional de cardiomyoctyes ventriculares adulto do rato. Este protocolo resulta em isolamento Ca ^{2 +-tolerantes,} cardiomiócitos excitáveis ​​que temos com sucesso cultivadas por até 72 horas e transitoriamente transfectadas com adenovírus. A funcionalidade destas células isoladas pode ser avaliada utilizando o sistema de imagem MMSYS ^14,24 e patch-clamp, que também será discutida.

Protocolo

1. Cardiomyocyte Isolamento

Materiais (Figura 1)

Microdissecting fórceps
Uma pinça
Pinça hemostática delicados
Pinça hemostática
Microdissecting, serrilhados, fórceps curvos
Tesoura operacionais, em linha reta
Tesoura Operacionais, curvo
Tubos de 15 ml Falcon (5)
60 milímetros placa de Petri
Tampão fosfato (PBS)
Nylon Mesh - tamanho 400 mM poros
Pequeno funil
Cera revestido, trançado de seda 4-0, 19 mm, 7-10 cm de comprimento
Agulha não-hipodérmica, fim brusco, 24 G ou animal-alimentação agulha comercial (24 x 1 em, W/1-1/4)
A heparina de sódio
Mistura cetamina / xilazina
Pipetas Pasteur
OptiVision dissecação Goggles
Sistema Ionoptix MMSYS

Nota: Se a cultura de células, ver secção 2 em cultura de células, antes de iniciar esse protocolo.

Nota: Todos os ratos foram tratados emuma instalação de barreira e sacrificado de acordo com regulamento aprovado IACUC, práticas e procedimentos.

Nota: Antes de se iniciar o procedimento, todo o sistema deve ser pré-aquecido, para assegurar que todos os elementos do sistema de Langendorff (Figura 2A, Figura 3) são aquecidos a 37 ° C para permitir a actividade de colagenase adequada e completa.

1. Injetar camundongos adultos (~ 12 semanas) com 150 unidades USP de heparina sódica para o espaço abdominal.
2. Anestesiar com uma injecção de uma mistura de cetamina / xilazina na dose-dependente de peso (Tabela 1).
   1. 80:12 mg / kg de cetamina: xilazina receita: 2,6 ml de cetamina (100 mg / ml) + 0,4 ml de xilazina (100 mg / mL) + 37 ml de PBS. Final: cetamina = 6,5 mg / ml; xilazina = 1 mg / ml
3. Fixar o rato sedados para a almofada operacional, excisar o coração, e colocar em um prato de PBS temperatura ambiente ou 0,9% de solução salina (Figura 1J). Physalina siologic permite que o coração intacto para contrair para uma melhor extrusão de sangue na câmara e fácil identificação da aorta antes do passo 1.6. Camundongos foram verificados para garantir que eles estão profundamente anestesiados via perda de membro posterior toe pitada reflexo e desaceleração da freqüência respiratória antes do início da toracotomia.
4. Use óculos de proteção OptiVision dissecação (Figura 1A) para identificar e expor a aorta. A remoção do tecido em torno da aorta, embora não facilitar a visualização do vaso, não é necessário para a optimização do isolamento das células se a raiz aórtica é claramente visível.
5. Ferre a bomba com tampão de perfusão (Tabela 2). A temperatura deve ser mantida a 37 ° C durante a duração do processo usando um controlo, banho de água (Figura 2D) que circula.
6. Montar o coração para o aparelho de Langendorff (Figura 2A). Usando dois micro-dissecando fórceps (Figuras 1D-E), prime da aorta em torno da não-hipodérmica, romba ponta de agulha (24 L) com um tubo de silicone na ponta distal. Alternativamente, um animal-agulha de alimentação comercial (24 cm x 1 em, W/1-1/4) pode ser utilizado. O tubo de silicone sobre a agulha 24 G ou a agulha de alimentação dos animais vai permitir fixar o fio de sutura ao longo da ranhura. Coloque a aorta na agulha como uma meia. (Figura 2C).
   1. Nota: É importante ter a certeza de que a ponta da agulha repousa na aorta ascendente, de preferência na distal da raiz da aorta com o inominada direita, mas que não se estende através da válvula aórtica para o ventrículo esquerdo, pois isso irá severamente limitar a capacidade dos buffers para perfundir eficazmente através do coração através das artérias coronárias.
7. Fixar o coração para a agulha, amarrando um pequeno comprimento de sutura de seda (7-10 cm de comprimento) (Figura 1K), em torno da parte superior da aorta, assegurando que o laço é ao nível da aorta ascendente, abaixo da arter inominada direitay, mas está acima da extremidade da agulha.
8. Diminuir o coração para o interior do vaso cónico (Figura 2B) para ajudar a manter uma temperatura ambiente adequada.
9. Perfundir o coração com tampão de perfusão durante 5 min a uma velocidade de 1 ml / min e prender a câmara de saída do vidro para permitir que o perfusato de recolher no vidro cónico e envelope do coração. O esquema para digerir o coração é mostrado na Figura 3.
   1. Neste ponto, você deve ver o volume do aumento coração. Além disso, o sangue no tecido cardíaco serão substituídos por perfusato, palidez tecido.
10. Solte a braçadeira de saída para drenar o perfusato. Parar a bomba para mover o tubo a partir do recipiente de tampão de perfusão para o recipiente de tampão de enzima (Figura 2E). Reiniciar a bomba comece a perfundir o coração com tampão de enzima (Tabela 2) em 1 ml / min. Prender o escoamento de novo para permitir que o tampão de enzima para o envelopecoração.
    1. Aqui, tal como a enzima é perfusão do coração e digerir o tecido conjuntivo, o coração se torne mais pálida e a integridade estrutural irá diminuir.
    2. Para determinar quando cortar os ventrículos do coração digerida, levantar o coração para fora do copo cônico, esprema delicadamente o coração com uma pinça e recolher algumas gotas de perfusato em uma pequena placa de Petri e verificar para ver se ou não células individuais estão caindo .
    3. Para o novato, é útil para conectar a linha de perfusão com um manómetro. Quando o coração está sendo digerido a pressão vai cair rapidamente, como o tecido conjuntivo não se sustenta a resistência. O manómetro também é útil para o principiante para assegurar que a posição da agulha se encontra acima da válvula aórtica e não no ventrículo. De baixa pressão irá indicar que a agulha se encontra na câmara ventricular e sob alta pressão indicou que a agulha toca a válvula.
11. Cortar os ventrículos do coração num pratocheio de buffer de transferência (A) (Tabela 2), quando a pressão ventricular começa a cair drasticamente, ou quando você é capaz de ver as células individuais no perfusato. Isso normalmente leva ~ 7-10 min.
12. Novamente utilizando micro-fórceps de dissecação (Figura 1C), mediu os ventrículos em pequenos pedaços para dissociar. A digestão de sucesso vai deixar quase sem pedaços sólidos de tecido depois de trituração, com a maior parte do tecido se tornar amorfo mediante dissociação.
    1. Para dissociar ainda mais o tecido, pipetar a solução in / out utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico (Figura 4) a partir da qual a ponta tinha sido cortado com um ângulo 45 °. Esta modificação serve para aumentar o espaço diametral interna da ponta da pipeta, diminuindo assim a quantidade de tensão de cisalhamento sobre as células como o tecido é triturado.
    2. Antes de dissecação o tecido com uma pinça, é possível separar as câmaras individuais separadamente e dissociar fibrilação ventricular esquerda ou righcélulas ventriculares t.
13. Fixe a malha quadrado (Figura 1M) para um pequeno funil (Figura 1 L) usando grampos e coloque este aparelho de filtragem em um tubo Falcon 15 ml (Figura 1I).
14. Utilizar a pipeta de Pasteur modificada para remover a solução de células a partir da placa e filtrar a solução para o tubo Falcon.
15. Permitir que as células vivas para assentar no fundo do tubo (sedimentação de células vivas deve ter 2-4 min).
16. Aliquota de 2,5 ml de cada uma das quatro soluções de cálcio (Tabela 3) em quatro tubos de 15 ml Falcon separadas.
17. Mais uma vez, utilizando uma pipeta Pasteur padrão, remover cuidadosamente a pelete de células a partir do fundo do tubo e transferência das células para a primeira das soluções de cálcio.
18. Permitir que as células se depositam no fundo do tubo e repetir o passo 1.17 nas soluções subsequentes de cálcio até que as células estão na última solução.
19. Não deixe que as células se instalarem no fourth solução de cálcio. Tampe o tubo e transformá-lo de lado.

2. Cultura de Células

1. Antes do isolamento, placa de 1 ug / ml de laminina rato natural, em lamelas de vidro e incubar durante pelo menos 1 hora a 37 ° C e 2% de CO _2. Também permitirá que o seu revestimento e meios de cultura (Tabela 4) para aquecer na incubadora a 37 ° C e 2% de CO _2. Isso permite que o CO ₂ dissolvido na mídia para equilibrar.
   1. Não remova a parte superior da mídia. Basta soltar a parte superior para evitar a contaminação.
2. Permitir que as células isoladas a sedimentar no fundo do tubo de Falcon.
3. Retire o pellet usando uma pipeta Pasteur de plástico padrão e ressuspender em a quantidade adequada de chapeamento de mídia.
4. Placa as células sobre as lamelas revestidas com laminina no prato de tamanho apropriado e incubar a 37 ° C e 2% de CO _2, durante pelo menos 30-60 minutos para permitir que as células a aderir às lamelas.
5. ** Se transfecção com adenovírus, diluir o vírus em uma quantidade adequada de meios seletivos, e substituir a mídia chapeamento no prato com a mídia que contém o vírus. Deixe o vírus incubar as células durante 2 h em 37 ° C e 2% de CO _2. **
6. Remova a mídia chapeamento do prato e substituir com meios de cultura.
7. Alterar cuidadosamente o meio de cultura a cada dia, de modo a não perturbar as células nas lamelas.

Usando este procedimento, as células foram cultivadas com sucesso por até 72 horas. Imagens de células cultivadas e transfectadas GFP pode ser encontrada na Figura 5.

3. MMSYS Sistema

1. Ligue o sistema MMSYS garantindo que a lâmpada de arco é iniciado pela primeira vez.
2. Ligar os tubos da bomba para a admissão adequada e saídas da câmara MMSYS (Figura 6).
3. Primeiro o sistema de tampão com cálcio (B) (Tabela 2).
4. Coloque um aproxlamela de vidro de tamanho opriately na câmara e aperte (Figura 6E). A maioria das câmaras MMSYS usar 22 milímetros ou 25 milímetros lamínulas quadrados. Consulte o manual do usuário MMSYS para determinar a lamela apropriado para a sua câmara.
5. Transferir 500 ul da solução de células para um pequeno tubo de Eppendorf.
6. Adicionar 0,5 mL Fura2-AM (solução stock de 1 mg / mL) para o pequeno tubo de células e permitir-lhes a incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5-7 minutos. Isto permite que o Fura2-AM a "carga" para dentro das células através da rápida difusão passiva através da membrana celular.
   1. Deixe o Fura-2 células carregadas sedimentar para o fundo do tubo, e lavar o excesso de Fura com 500 ul de tampão de cálcio B.
7. Desligue as luzes da sala.
8. Usando uma pipeta Pasteur padrão, gota 1-2 gotas (dependendo da concentração de células) da solução de "carregado" de células para o centro da câmara (Figura 6C) e permitir que as células To resolver sobre a lamela por 5 min.
   1. A densidade de células na câmara deve ser tal que as células que não se sobrepõem individuais podem ser facilmente visualizadas na plataforma de aquisição de dados MMSYS.
9. Cuidadosamente começam a fluir tampão de cálcio (B) através da câmara.
10. Aumentar a temperatura da câmara para 37 ° C.
    1. IMPORTANTE: Não ligue o aparelho de aquecimento até que o fluxo foi iniciada. Isto pode danificar gravemente o thermocoupler realimentação (Figura 6A).
11. Certifique-se de que a câmara é ligada ao MyoPacer através dos fios de ligação (Figura 6B) e começam a andar as células 5 Hz a 1,5 x o limiar de estimulação para as células.
12. Escolha uma célula que está batendo na freqüência correta e movê-lo para a abertura de enquadramento.
13. Ajustar as dimensões da abertura da câmara de moldação e, para que toda a célula está no centro da janela, dirigida horizontalmente, com o ap sarcomerespai.
    1. Para comprimento celular ajustar o vermelho e verde (direita e esquerda) indicadores fotodiodo para a borda da célula. Ajustar o contraste para optimizar o contraste preto / branco nas extremidades da célula. Consulte o manual de Ionoptix para mais detalhes.
14. Colocar a caixa de uma área da célula contendo sarcomeres bem definidos e ajustar o foco para optimizar o pico do espectro de potência (vermelho). Também ajustar a luminosidade do microscópio para optimizar a janela de alisamento azul e informações contraste preto.
15. Ajuste as barras de limite verdes para capturar o máximo do espectro de potência vermelho (pico) e tão pouco fundo possível.
16. Iniciar a gravação.
17. Depois que os dados suficientes tenham sido gravadas, clique em "Pause" para parar temporariamente a gravação e, garantindo que nem o foco nem dimensões da janela de visualização são alterados, movimentar o palco do microscópio para uma área da lamela em que nenhuma célula ou material celular pode ser vi. LenGTH de gravação varia dependendo do protocolo experimental do investigador.
    1. Nota: Ao clicar em "Stop" irá encerrar a gravação e nenhum fundo será capaz de ser registrado para essa célula.
18. Clique em "Continuar" para gravar uma medida de fundo.
19. Depois de fundo o suficiente foi gravada clique em "Stop" para terminar a gravação.
20. Clique em "Arquivo >> Salvar" para salvar todos os traços para que a célula em um único arquivo zpt..
21. Repita os passos de 3,12-3,20 até células suficientes foram registrados.
22. Consulte o Ionoptix-MMSYS Manual do Usuário 12 para obter instruções sobre análise dos dados gravados. Dados registados de características de tipo selvagem são mostradas em cardiomiócitos na Figura 7.

4. Remendo Grampo

Fixação remendo de diferentes tipos de células têm sido bem descritos anteriormente nesta revista ^25-28. Nós, portanto, se concentrar em algum críticoparâmetros ai para o sucesso de fixação pedaço de cardiomiócitos adultos isolado usando nosso protocolo descrito.

1. Usando uma pipeta de puxador e vidro de borosilicato (com filamentos: OD 1,5 mm ID 0,86 milímetros - 10 cm de comprimento) puxar uma pipeta que exibe ~ 2,0-3,0 mohms quando preenchido com uma solução de pipeta (Tabela 5).
2. -Polonês fogo a ponta da pipeta suavemente usando um Narishige ou outro polidor de fogo vertical. A resistência da pipeta patch deve ser 2-4 MO após polimento fogo.
3. Ligue o computador, amplificador (Axopatch 200B), conversor AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) e Micromanipulator (MP-285). Para remendo célula aperto todo, começamos com parâmetros padrão, como descrito anteriormente.
4. Para o adulto culto CMs, removê-los da incubadora e lavar cuidadosamente a lamela em que os CMs são banhados com PBS à temperatura ambiente.
5. Remova cuidadosamente a lamela e colocá-lo na câmara de perfusão no microscópio invertido (Nikon TE 2000).
   1. Certifique-se de que a entrada para o sistema de perfusão e de saída (por sucção) é um pouco acima da superfície da lamela.
6. Iniciar irrigando com a solução extra-celular apropriado (Tabela 5).
7. Para o adulto recém dissociada CMs, coloque uma lamela revestidas por colágeno no sistema de perfusão, como acima.
   1. Uma vez que as células vão estar em solução, substituir suavemente a solução com tampão extracelular.
8. Usando a pipeta Pasteur modificado (Figura 4), ​​delicadamente ressuspender as células no buffer extracelular, tomar uma alíquota e coloque-o sobre a lamela.
9. Deixe as células aderir durante 10-15 minutos antes de iniciar a perfusão como em 4.4.
10. Back-preencher todo o patch célula pipeta com tampão intra-celular usando um Microfil (Instrumentos de Precisão World, 28 G) da agulha. Certifique-se de que não há bolhas de ar na ponta da pipeta; bata suavemente para permitir que as bolhas de ar para flutuar para o surface da solução.
11. Prenda a pipeta de patch cheio ao titular pipeta a, assegurando que não há contato entre o microeletrodos ea solução interna.
    1. Nós usamos eletrodos de cloreto de prata, mas cuidar de 'chloriding' os fios de prata, pelo menos uma vez por semana por imersão durante a noite em água sanitária.
12. Abaixe cuidadosamente a pipeta para o banho, garantindo que o eletrodo de banho está imerso em todos os momentos no / solução extra-celular banho. Compensar quaisquer potenciais de junção líquida neste momento. Grandes potenciais de junção pode ser um sinal de deterioração de cloreto de prata sobre os eletrodos.
13. Sã cilíndrica adulto CMs são identificados ao microscópio e centrado no campo de visão. Como descrito anteriormente, uma combinação de mover o micromanipulador e ajustar o foco permite a proximidade da @ patch pipette @ e a superfície do CM.
    1. Uma vez que eles estão no mesmo plano focal, usamos uma combinação de visuaisção da célula e pulso de teste (disponível no Axopatch 200B).
    2. Uma vez que a resistência da pipeta diminui para metade (sugerindo que a pipeta está em contacto com a superfície da célula), e as células continuam a procurar cilíndrica, estabelecemos selo gigaohm utilizando uma sucção suave.
    3. Para CMs, preferimos sucção boca para estabelecer a pressão negativa. Se um gigaseal é obtido com sucesso, mais uma vez usar suave sucção boca rítmica para 'break-in' para a célula para estabelecer o modo de correção de células inteiras.
14. Potenciais de descanso típicos de saudável CMs estão na ordem de -85 a -90 mV. Uma vez que um gigaseal é obtido, medir o potencial de repouso da membrana usando pinça de corrente com I = 0 pA.
    1. Se o potencial de repouso da membrana é despolarizada isso pode indicar uma célula danificada ou uma vedação deficiente.
15. Porque o CMs são células grandes com muita área de superfície, muita atenção deve ser dada para capacitância de compensação, especialmente wgalinha rapidamente ativando correntes como o canal de sódio precisa ser estudada. Se a compensação de capacitância adequada não pode ser obtida usando o construído em configurações de compensação sobre o gerador de impulsos, prepulses na tensão sub-limiar e polaridade oposta podem ter de ser aplicada ea corrente resultante subtraído do sinal gravado. Esse protocolo é facilmente programado em Axopatch.
16. Uma vez que o modo de remendo de célula inteira foi estabelecida, esperar 15 minutos para permitir o equilíbrio e para assegurar a estabilidade do selo antes de tensão início ou protocolos de fixação correntes. Usamos protocolos padrão que foram descritos anteriormente neste e outros jornais e não serão elaboradas.

Resultados

O isolamento dos adultos cardiomyoctyes resultados em células em forma de bastonete, estriados, e quiescentes (não bater espontaneamente) (Figura 5A). As células mortas vão olhar arredondado e sem estrias estarão presentes. As células quiescentes podem ser cultivadas e transfectadas com o adenovírus para manipular a expressão do gene (Figuras 5B e 5C). Após 24 horas de cultura, a morfologia das células vivas não muda, elas ainda são ^{Ca2 +-tolerante,}

Discussão

Neste relatório, nós descrevemos as técnicas necessárias para o isolamento do sucesso e da cultura do adulto CMs do coração mouse. A nossa técnica permite o estudo subsequente da função LV e excitabilidade utilizando os métodos descritos acima. O parâmetro fundamental para o estudo da funcionalidade do adulto CMs é a saúde ea qualidade do CMs isoladas. Como descrito acima, as nossas técnicas de permitir um elevado rendimento de células funcionais que são susceptíveis a manipulação da expressão de gen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907