절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

요약

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

초록

문화의 기본 심근 (CMS)의 사용은 심장 질환에 대한 우리의 이해를 발전에 심장 질환의 생쥐 모델에 강력한 보완을 제공하고 있습니다. 특히, 질병 상태와 질병을 일으키는 돌연변이에 의해 이온 항상성, 이온 채널의 기능, 세포의 흥분과 자극 수축 커플 링과 그 변화를 연구 할 수있는 능력은 심장 질환에 중요한 통찰력을 이끌고있다. 또한, 문화에 성인 CMS에 모방 할 수있는 적절한 불후의 세포 라인의 부족, 그리고 신생아의 CM 제한 (성인 CM을의 구조와 기능 생체 역학 특성의 많은 부족하는) 신호 전달 경로 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 우리의 이해를 방해했다 이온 채널과 성인 고립 심근 공부의 중요성을 강화 성인 심장의 수축 특성. 여기, 우리는 아데노 바이러스-간편 체크인 의해 유전자 발현의 분리, 문화, 조작 방법을 제시ssed 단백질 및 성인 쥐에서 심근의 다음 기능 분석. 이러한 기술의 사용은 셀룰러 흥분성 조절 경로, 칼슘 ^{2 +} 역학과 수축성 시그널링에 기계론 통찰력을 개발 및 심혈관 질환의 많은 생리 학적으로 중요한 특성을 제공하는 것을 도울 것이다.

서문

심혈관 질환의 생쥐 모델은 잠재적 인 치료 대상에게 ^1,3를 식별하기위한 근본적인 질병 메커니즘 ^{1,2 해명뿐만} 아니라 효과적인 도구로 봉사했다. 특히, (예 : 압력 과부하 등) 취득 심장 질환의 두 쥐 모델 ^4,5 형질 전환 마우스 모델의 사용은 심장 질환 ^6-8에 대한 우리의 이해를 전진했다. 단일 세포 수준에서 심장 ^11-13 셀룰러 흥분성 및 여진 수축 결합을 기초 개별 단백질 시그널링 캐스케이드 ^3,9,10 및 변경을 연구 세포 배양 기술의 사용은 생체 내 마우스 모델을 갖추고있다. 그러나, 성인 CM 구조와 기능을 반영하는 적당한 세포주의 부족은 상당한 제한되었다. 조사자는 이종 발현 시스템에서, 같은 이온 채널 개별 단백질을 공부하여이를 극복하기 위해 노력했다 ^{(14)는,이 연구는 이온 채널 생물 물리학 또는 단백질 인신 매매, CM이의 기본 미시의 부적절한 표현의 측면에서 유용한 정보를 저희에게 제공하는 동안은 상당한 제한 사항입니다. 둘째, 이러한 이종 세포의 대부분이 성숙한 수축 장치를 가지고 있지 않기 때문에, 그것은 수축 기능 및 세포의 흥분과 수축 사이의 복잡한 상호 작용을 연구하는 것이 불가능했습니다. 이러한 이유로, 연구자들이 생체 기능 연구의 많은 주요 심장 세포 배양에 설정되어 있습니다. 마지막으로, 고립 된 심근 연구는 흉터 또는 섬유증과 섬유 방향의 영향을 포함한 다세포 준비의 혼란 변수없이 수축 기능의 평가를 할 수 있습니다.}

기본 신생아 쥐의 심실의 심근 (NRVMs)는 문화에 상대적으로 쉽게, 유전자 발현 ^(15)를 조작하는 아데노 바이러스와 lentiviruses에 감염 될 수있다차 때문에 성공적으로 ¹ 사용하지만, 자신의 한계가되었습니다. 그들은 생리적 미시 ^1을 제공하고 신호 필드의 주력되었지만, 형태와 NRVMs 성인 된 심근의 세포 내 조직 사이에 상당한 차이가 그들에게 어른의 마음에 이온 플럭스와 여기 수축 커플 링의 조사를 위해 부적당 한 모델을 . 특히 NRVMs는 결정적인 T-관 서브 ^4를 부족합니다. 칼슘 ^{2 +} 유출 및 역학 성숙한 T-관과 근질 세망 (SR) 구조 ^6, 칼슘 ^{2 +} 역학과 NRVMs에서 심장 수축의 기능 연구에 매우 의존하기 때문에 성인 심근에서 이러한 중요한 프로세스를 정확하게 반영하지 않습니다. 또한, 신호 전달 경로의 일부 구성하여 다른 질병 과정을 연구하기위한 제한과 그 난을 제공, 신생아와 성인 마우스 ⁽⁹⁾ 사이에 차이가NRVMs에있는 세포의 흥분과 수축에 MPACT. 마지막으로, 수축기구의 분포는 수축성 측정의 정확도를 제한하는 다 방향과 불균​​일 셀 단축에 이르게한다.

격리 성인 심장 근세포의 사용은 따라서 더욱 정확한 생체 모델링 시스템을 제공한다. 쥐의 유전자 조작에 의해 가능하게 기술의 특별한 성장은 생쥐에서 기능적 격리 심근를 얻는 중요성을 강조한다. 사실, 마우스 모델에서 격리 성인 CM을의 특성은 많은 생물 학적 및 병리학 적 이벤트에 빛을 발산하고있다. 형질 전환 마우스 모델에서 고립 CMS가되어에서 얻은 정보를 보완, 이러한 허혈 / 재관류 ^{(17, 18)} 등의 질병 모델에서 증가 또는 단백질의 기능의 손실 단일 세포 ^2,16의 수축 특성에, 그리고 생존의 연구를 허용 한 생체 내 연구SE 마우스. 또는 (생리 비대를 모델링) 운동 ^5,21 검사를 위해 수 있습니다 (모방 고혈압이나 대동맥 판막 협착증이되도록 가로 대동맥 수축에 의한 압력 과부하 등) 취득 심장 질환 ^3,19,20의 쥐 모델에서 고립 된 성인 CM을 사용 단일 세포 수준에서 세포의 흥분과 자극 수축의 커플 링이 과정에 연루 신호 폭포의 상호 작용. 또한, CM이 성인에 아데노 바이러스 기반 유전자 발현을 사용하여 유전자 발현을 조작하는 능력을 우리에게 복잡한 신호 전달 경로의 성분을 해부하는 기회를 제공한다.

전기 생리학 관점에서 전체 셀 전압 및 절연 성인 CMS의 현재 클램프 실험 기준에 이온 플럭스의 본질을 해명 및 다양한 질병 상태에 중요한되었습니다. 인해 세포막의 복잡한 구조 및 차동 PROTE의성인 CMS와 NRVMs 또는 이종 세포주 사이 폴딩 구조에서, 성숙한 세포를 패치 할 수있는 능력은 특정 막 단백질, 구조 단백질, 및 성인 심장의 전기 생리 성분에 이온 채널의 상호 작용 파트너의 영향을 더 잘 표현을 제공한다.

성인 쥐의 심근 공부를 분리하고 성인 쥐의 심근이 도전이 배양, 가능한 마우스 심근를 분리하고 바이러스를 사용하여 추가로 유전자 조작을 허용하는 문화를 유지하기 위해 방법론의 체계적이고 정확한 설명의 필요성을 촉구하고있는 등 눈에 띄는 장점에도 불구하고 벡터. 이전 연구는 급성 고립 된 마우스 성인 CMS 또는 배양 된 쥐 성인 CM이 중 하나를 사용하고 있습니다. 후자는 성인 마우스 CM을보다 문화에 쉽게, 그리고 체외에서 유전자 발현을 조작하는 대부분의 실험은 쥐 성인 CMS에 사용했다. 몇 가지 연구가 성공적으로 변경하고를 functi을 조사 하였다실험의 범위에 큰 제한을 제시하는 마우스에서 성인 CM을 ONAL 유전자 발현. 따라서, 우리가 구체적으로 격리 ^7,8,22, 문화 ^3,10,15,23, 아데노 바이러스 감염 ^11-13,15, 성인 마우스 심실 된 심근의 기능 분석에 대한 이전의 연구에서 수정 된 방법론을 제시한다. 이 격리 프로토콜 우리는 최대 72 시간 동안 성공적으로 배양 일시적으로 아데노 바이러스로 형질이 칼슘 ^{2 +} 허용, 흥분 심근 결과. 이러한 고립 된 세포의 기능 MMSYS 이미징 시스템 ^{14, 24} 및도 논의 될 패치 클램프를 사용하여 평가 될 수있다.

프로토콜

1. 심근 격리

자료 (그림 1)

집게를 Microdissecting
조직 겸자
섬세한 지혈 겸자
지혈 겸자
Microdissecting, 톱니 모양, 곡선 포셉
운영 가위, 직선
운영 가위, 곡선
15 ML 팔콘 튜브 (5)
60mm 페트리 접시
인산염 완충 생리 식염수 (PBS)
나일론 메쉬 - 400 μm의 기공 크기
작은 깔때기
왁스 코팅, 꼰 실크 4-0, 19mm, 길이 7-10cm
비 피하 주사 바늘, 무딘 끝, 24 G 또는 상업적 동물 먹이 바늘 (W/1-1/4, 24 x 1)
헤파린 나트륨
케타민 / 자일 라진 혼합물
파스퇴르 피펫
OptiVision 해부 고글
IonOptix MMSYS 시스템

참고 : 세포를 배양하면,이 프로토콜을 시작하기 전에 세포 배양에 2 절을 참조하십시오.

참고 : 모든 생쥐에 든다고했다승인 IACUC 규정, 관행 및 절차에 따라 차단 시설 희생.

주 : 이전 절차를 시작하기에, 전체 시스템은 랑겐 시스템 (그림 2A, 그림 3)의 모든 요소가 적절하고 완벽한 콜라게나 제 활성 수 있도록 37 ° C로 가열되는 것을 보장하기 위해 예열해야합니다.

1. 150 USP 단위 복부 공간으로 나트륨 헤파린과 성인 마우스 (12 ~ 주) 주사.
2. 중량 의존 양 (표 1)에 케타민 / 자일 라진 혼합물의 주입 마취.
   1. 80:12 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine) : 자일 라진 조리법 : 2.6 ML 케타민 (100 ㎎ / ㎖) + 0.4 ml의 자일 라진 (100 ㎎ / ㎖) + 37 ml의 PBS. 최종 : 케타민 = 6.5 ㎎ / ㎖, 자일 라진 = 1 ㎎ / ㎖
3. 운영 패드에 진정 마우스를 고정하는 마음을 절제하고, 실내 온도 PBS의 요리 또는 0.9 % 생리 식염수 (그림 1J)에 배치합니다. PHYsiologic 식염수는 그대로 심장 챔버에서 혈액의 더 나은 압출 및 1.6 단계 이전에 대동맥 쉽게 식별 계약을 체결 할 수 있습니다. 쥐들은 깊게 뒷다리 발가락 핀치 반사 전에 개흉술의 발병에 호흡 속도의 둔화의 손실을 통해 마취되는 것을 보장하기 위해 선택되었다.
4. 대동맥을 파악하고 노출 OptiVision 해부 고글 (그림 1A)를 사용합니다. 대동맥 루트가 명확하게 볼 수있는 경우는 용기의 시각화를 촉진하기는하지만, 대동맥 주위의 조직을 제거하면 세포 분리의 최적화를위한 필요가 없습니다.
5. 프라임 관류 버퍼 펌프 (표 2). 온도가 사용하는 절차의 기간 동안 37 ° C에서 개최한다 수욕 (그림 2D)을 순환 제어.
6. 랑겐 장치 (그림 2A)에 마음을 탑재합니다. 두 개의 마이크로 해부 집게 (그림 1D-E)를 사용하여 홍보말초 끝에 실리콘 튜브 비 피하, 무딘 엔드 바늘 (24 G)의 주위 대동맥을 IME. 또는 (W/1-1/4, 24 x 1) 상용 동물 먹이 바늘을 사용할 수 있습니다. 24 G 바늘이나 동물 먹이 바늘에 실리콘 튜브는 홈에 봉합을 확보하실 수 있습니다. 양말로 바늘에 대동맥을 놓습니다. (그림 2C).
   1. 참고 :이 심각한 것대로, 좌심실에 대동맥 밸브를 통해 연장하지 않는 바늘의 끝이 이상적으로 오른쪽 무명의 대동맥 루트 말단에서, 상행 대동맥에 달려 있는지 확인하는 것이 중요하지만, 효과적으로 관상 동맥을 통해 심장을 관통 perfuse하는 버퍼의 능력을 제한한다.
7. 넥타이 오른쪽 무명의 arter 아래, 상행 대동맥의 수준에 있음을 보장 대동맥의 상단 주위 (7-10 ㎝ 길이) 봉합 실크의 작은 길이 (그림 1K)를 묶어서 바늘에 마음을 고정Y 있지만 바늘의 단부 위에.
8. 적당한 주위 온도를 유지하는 데 도움이되는 원뿔 유리의 내부 (그림 2B)로 마음을 낮 춥니 다.
9. 1 ㎖ / 분의 속도로 5 분 동안 관류 완충액으로 심장 Perfuse 및 관류가 원추형 유리 수집하고 심장을 싸고 있도록 유리 챔버 유출 클램프. 심장을 소화 대한 회로도는도 3에 도시된다.
   1. 이 시점에서 당신은 심장 증가의 볼륨을 볼 수 있습니다. 또한, 심장 조직에 혈액이 조직 창백 원인, 관류 액으로 대체됩니다.
10. 관류 액을 배출 유출 클램프를 해제합니다. 효소 버퍼 용기 (그림 2E)로 관류 버퍼 컨테이너에서 튜브를 이동하는 펌프를 중지합니다. / 분 1 ㎖에 효소 버퍼 (표 2)와 함께 마음을 perfuse하기 시작 펌프를 다시 시작합니다. 효소 버퍼 봉투 수 있도록 다시 유출 클램프마음.
    1. 여기에, 효소가 심장을 관류하고 결합 조직을 소화 한, 마음이 창백하게되고 구조적 무결성은 감소 할 것이다.
    2. , 소화 마음에서 심실을 잘라 원뿔 유리로 마음을 들어 올려 부드럽게 집게로 마음을 짜 작은 페트리 접시에 관류 액 몇 방울을 수집하고 하나의 세포가 삭제되는지 여부를 확인하는시기를 결정하는 .
    3. 초보자의 경우는 압력계와 관류 라인을 연결하는 것이 도움이된다. 심장이 소화 점점되면 결합 조직의 저항을 보유하지 않는 압력이 급격히 감소합니다. 혈압계는 바늘의 위치가 대동맥판 위와하지 뇌실에 있는지 확인하는 것도 초보자에 유용하다. 낮은 압력은 바늘 심실 챔버에 위치하며 고압 니들 밸브 닿을 나타내는 것을 나타낼 것이다.
11. 접시에 심장의 심실을 잘라심실 압력이 당신이 관류에 하나의 셀을 참조 할 수있을 때 극적으로 떨어 뜨리거나하기 시작하면 전송 버퍼 (A) (표 2)의 전체. 이것은 일반적으로 ~ ~ 10 분입니다.
12. 다시 (그림 1C) 마이크로 해부 집게를 사용하여, 해리 작은 조각으로 심실를 말하다. 성공적으로 소화 조직의 대부분이 해리에 따라 비정질되고으로 닦지 후 조직의 거의 고체 덩어리를 떠나지 않을 것입니다.
    1. 또한, 조직을 떼어 놓다 끝 ~ 45 ° 각도로 절단했다있는 플라스틱 파스퇴르 피펫 (그림 4)를 사용하여 / 아웃 솔루션을 피펫합니다. 본 변형 예에서는 조직이 연화 될 때 피펫 팁, 따라서 세포에 전단 응력의 양을 감소하는 내경 공간을 증가시키는 역할을한다.
    2. 집게로 조직을 해부하기 전에 개별 실을 분리하고 별도로 심방, 심실 또는 맞 해리 할 수​​ 있습니다T 심실 세포.
13. 클램프를 사용하여 작은 깔때기 (그림 1 L)에 제곱 메쉬 (그림 1M)를 확보하고 15ML 팔콘 튜브 (그림 1I)에이 여과 장치를 배치합니다.
14. 접시에서 세포 용액을 제거하고, 팔콘 튜브에 솔루션을 필터링하기 위해 수정 된 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
15. (살아있는 세포의 침전이 2-4 분 소요) 라이브 세포가 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
16. 4 별도의 15ML 팔콘 튜브에 네 칼슘 솔루션 (표 3)의 각각의 나누어지는 2.5ml를.
17. 다시 표준 파스퇴르 피펫을 사용하여 조심스럽게 튜브의 바닥으로부터 세포 펠렛을 제거하고 칼슘의 용액 제에 세포를 옮긴다.
18. 세포는 마지막 때까지 용액에 세포가 튜브의 바닥에 침전하고 후속 칼슘 용액에 1.17 단계를 반복하는 것을 허용한다.
19. 세포가 사톤에 정착시키지 말라H 칼슘 솔루션을 제공합니다. 튜브 캡을 옆으로 돌립니다.

2. 세포 배양

1. 격리, 접시 1 UG / ㎖ 자연 마우스 유리 커버 슬립 위에 라미닌 및 37 ° C에서 최소 1 시간 동안 배양하고 2 %의 CO ₂ 전에. 또한 도금 및 배양 배지 (표 4) 37 ° C에서 인큐베이터에서 따뜻하게 2 % CO ₂ 할 수 있습니다. 이 매체에 용해 된 CO _2는 평형 수 있습니다.
   1. 미디어에서 정상을 제거하지 마십시오. 단순히 오염을 방지하기 위해 상단을 풉니 다.
2. 분리 된 세포가 팔콘 튜브의 하단에있는 펠렛 할 수 있습니다.
3. 미디어 도금의 적절한 양의 표준 플라스틱 파스퇴르 피펫과에 resuspend을 사용하여 펠렛을 제거합니다.
4. 적절한 크기의 접시에 라미닌 코팅 커버 슬립에 세포를 플레이트와 37 ° C에서 부화하고 2 % 이상 30 ~ 60 분에 대한 CO ₂ 세포가 커버 슬립을 준수 할 수 있도록.
5. ** 아데노 바이러스로 형질 경우 도금 매체의 적절한 양으로 바이러스를 희석 바이러스 - 함유 매체와 접시에 도금 미디어를 교체한다. 바이러스가 37 ° C에서 2 시간 2 %의 CO ₂ 세포에 품어 보자. **
6. 요리에서 도금 용지를 제거하고 배양 배지로 교체.
7. 커버 슬립에 세포를 방해하지 않도록 조심스럽게 매일 문화 미디어를 변경합니다.

이 절차를 사용하여, 세포가 성공적으로 최대 72 시간 동안 배양되었다. 형질 전환 배양 GFP 세포의 이미지는 그림 5에서 찾을 수 있습니다.

3. MMSYS 시스템

1. 아크 램프가 처음 시작되는 것을 보장 MMSYS 시스템의 전원을 켭니다.
2. 펌프에서 MMSYS 챔버의 적절한 입구와 출구 (그림 6)에 튜브를 연결합니다.
3. 프라임 칼슘 완충액 (B)를 가진 시스템 (표 2).
4. 하거든 Appr 배치챔버 및 건다 (그림 6E)에 opriately 크기의 유리 커버 슬립. 대부분의 MMSYS 챔버는 22mm 또는 25mm 사각형의 coverslips 하나를 사용하십시오. 당신의 챔버에 적합한 커버 슬립을 결정하기 위해 MMSYS 사용자 설명서를 참조하십시오.
5. 작은 에펜 도르프 튜브에 세포 용액 500 μl를 전송합니다.
6. 세포의 작은 튜브에 0.5 μL Fura2-AM (1 ㎍ / μL의 원액)를 추가하고 5-7 분 동안 실온에서 어둠 속에서 부화 할 수 있습니다. 이 Fura2-AM은 세포막을 통해 빠른 수동 확산을 통해 세포에 "로드"할 수 있습니다.
   1. 의 Fura-2로드 된 세포가 튜브의 바닥에 펠렛시켜, 칼슘 버퍼 B. 500 μL와 과량의 Fura 흘려
7. 실내 조명을 끄십시오.
8. 표준 파스퇴르 피펫을 사용하여 챔버 (그림 6C)의 중심에 "로드"셀 솔루션 (세포 농도의 따라) 1 ~ 2 방울을 떨어 뜨려 세포 t이 허용O 5 분의 coverslip에 정착.
   1. 챔버에서 세포의 밀도는 단일 비 중첩 셀 쉽게 MMSYS 데이터 수집 플랫폼에서 볼 수있는 것이어야한다.
9. 조심스럽게 챔버를 통해 칼슘 버퍼 (B)를 유동하기 시작합니다.
10. 37 ° C.에 챔버 온도를 증가
    1. 중요 : 흐름이 개시 될 때까지 가열 장치를 켜지 마십시오. 이것은 심각하게 피드백 thermocoupler (그림 6A)를 손상시킬 수 있습니다.
11. 연결 전선 (그림 6B)를 통해 챔버 MyoPacer에 연결되어 있는지 확인하고 1.5 배 세포에 대한 서성 거려 임계 값에서 세포에게 5 Hz에서 페이스를 시작합니다.
12. 정확한 주파수에서 뛰는 셀을 선택하고 프레임 조리개로 이동합니다.
13. 셀 전체가 수평 방향, 윈도우의 중심에 오도록 sarcomeres의 AP와, 카메라와 프레임 개구 치수를 조정부모.
    1. 셀 길이의 경우 셀의 가장자리 (좌우), 포토 다이오드 표시를 붉은 색과 녹색을 조정합니다. 셀의 가장자리에 흰색 / 검은 색 대비를 최적화하기 위해 대비를 조정합니다. 자세한 내용은 Ionoptix 설명서를 참조하십시오.
14. 잘 정의 된 sarcomeres를 포함하는 셀의 영역에 상자를 놓고 파워 스펙트럼 (적색)의 피크를 최적화하기 위해 초점을 조정합니다. 또한 청색 평활화 윈도우 및 검은 콘트라스트 정보를 최적화하는 현미경의 밝기를 조정한다.
15. 빨간색 전원 스펙트럼 (피크)과 가능한 한 작은 배경 많이 캡처 녹색 임계 값 막대를 조정합니다.
16. 녹음을 시작합니다.
17. 충분한 데이터가 기록 된 후, 녹음 일시 정지 "일시 중지"를 클릭하고,보기 윈도우의 초점도 크기도가 변경되는 것을 보장, 어떤 세포 또는 세포 물질이있을 수있는 커버 슬립의 영역으로 현미경의 무대를 이동 본. 렌기록 GTH는 조사의 실험 프로토콜에 따라 달라집니다.
    1. 참고 : "중지"를 클릭하면 녹음이 중단되며 더 배경은 셀에 기록 할 수 없습니다.
18. 배경 측정을 기록하는 "다시 시작"을 클릭합니다.
19. 충분한 배경​​은 녹음을 종료하려면 "중지"를 클릭 기록 된 후.
20. 하나. ZPT 파일에 해당 셀에 대한 모든 흔적을 저장하려면 "파일 >> 저장"을 클릭합니다.
21. 충분한 세포가 기록 될 때까지 3.20 - 반복 3.12 단계를 반복합니다.
22. 기록 된 데이터의 분석에 대한 지침은 IonOptix-MMSYS 사용자 매뉴얼 (12)를 참조하십시오. 야생 형 심근의 특징 기록 된 데이터는 그림 7에 나와 있습니다.

4. 패치 클램프

서로 다른 종류의 세포 패치 클램프는 잘 저널 ^{25 ~ 28} 이전에 기술되어있다. 따라서 우리는 일부 비판에 초점성인 심근의 성공적인 패치 클램핑 알 매개 변수는 우리의 프로토콜을 사용하여 설명입니다.

1. 피펫 풀러와 붕규산 유리 (필라멘트 : OD 1.5 mm, 0.86 mm ID - 10cm 길이)를 사용하여 피펫 용액 (표 5)로 가득 할 때 ~ 2.0-3.0 MΩ 전시 피펫을 당깁니다.
2. 불 닦으 부드럽게 Narishige 또는 다른 수직 화재 폴리 셔를 사용하여 피펫 팁. 패치 피펫의 저항은 불 연마 후 2 ~ 4 MO해야한다.
3. 컴퓨터, 앰프 (Axopatch 200B), AD 컨버터 (Digidata 1440A, 축삭 악기)과 미세 조작기 (MP-285)를 켭니다. 전체 세포 패치 클램프를 위해, 우리는 전술 한 바와 같이 표준 매개 변수와 함께 시작합니다.
4. 배양 성인 CMS에 대한, 인큐베이터에서 제거하고 부드럽게 CM을 실온에서 PBS로 도금되어있는 coverslip을 씻어.
5. 부드럽게 커버 슬립을 제거하고 거꾸로 현미경 (니콘 TE 2 재관류 챔버에 배치000).
   1. (흡입 용) 관류 시스템 및 콘센트 입구 그냥 커버 슬립의 표면 위에 있는지 확인합니다.
6. 적절한 세포 외 용액 (표 5)와 관류 시작합니다.
7. 갓 해리 성인 CMS에 대한 상기와 같이 관류 시스템에서 콜라겐 코팅 coverslip에 배치합니다.
   1. 세포가 솔루션에있을 것입니다 때문에, 부드럽게 세포 버퍼 솔루션을 교체합니다.
8. 수정 된 파스퇴르 피펫 (그림 4)를 사용하여 부드럽게 세포 버퍼에 세포를 재현 탁 나누어지는을하고 커버 슬립에 놓습니다.
9. 세포를 8.8에서와 같이 관류를 시작하기 전에 15 분 동안 부착하자.
10. 백 채우기이 Microfil (세계 정밀 계측기, 28 G) 바늘을 사용하여 세포 내 버퍼 전체 세포 패치 피펫. 공기 방울이 피펫 팁에 없는지 확인; 온화 기포 하던가에 떠 있도록 탭용액 CE.
11. 미세 전극 내부 솔루션 사이의 접촉이 있다는 것을 보장 피펫 홀더에 못 패치 피펫을 연결합니다.
    1. 우리는 염화은 전극을 사용하지만, 가정용 표백제에 하룻밤 담가 실버 와이어는 적어도 일주일에 한 번 'chloriding'알아서.
12. 조심스럽게 목욕 전극은 욕조 / 세포 외 용액에 항상 담겨지고 보장, 욕조에 피펫을 낮 춥니 다. 이 때 액체 접합 전위 오프셋. 큰 접합 전위는 전극에서 염화은 악화의 징후 일 수있다.
13. 건강한 성인 원통형 CMS는 현미경에서 식별 및 시야의 중심에있다. 전술 한 바와 같이, 미세 조작기를 이동 및 초점 조정의 조합 부근 패치 피펫의 근접성 및 CM의 표면을 허용한다.
    1. 그들이 동일 초점면에지면, 우리는 카메라의 조합을 사용셀 (Axopatch 200B에서 사용 가능) 테스트 펄스 화.
    2. 피펫의 저항 (피펫 세포의 표면과 접촉하는 것을 제안), 그리고 셀은 원통형 모양 계속 반으로 감소하면, 우리는 부드러운 흡입을 이용하여 도장 기가 옴을 확립한다.
    3. CMS에 대한, 우리는 부정적인 압력을 설정하는 입 흡입을 선호한다. 기가 시일이 성공적으로 취득하는 경우, 우리는 다시 전체 세포 패치 모드를 설정하기 위해 셀에 '브레이크의'로 부드러운 리듬 입 흡입을 사용합니다.
14. 건강의 CM 일반적인 휴식 전위는 -85 -90 값의 순서로되어 있습니다. 기가 시일 취득하면, I = 0 펜실바니아와 현재의 클램프를 사용하여 휴식 막 잠재력을 측정합니다.
    1. 휴식 막 잠재력이 화되면이 손상된 세포 또는 가난한 씰을 표시 할 수 있습니다.
15. CMS가 표면적의 많은 큰 세포 때문에 세심한주의가 특히 승, 보상 커패시턴스 지불 할 필요가이러한 나트륨 채널로 암탉 빠르게 활성화 전류는 공부해야합니다. 적절한 커패시턴스 보정하여 얻어 질 수없는 경우에 펄스 발생기에 보상 설정 내장, 서브 임계 전압에서 prepulses와 반대 극성을인가하고 기록 된 신호로부터 감산 결과 현재해야 할 수도있다. 이러한 프로토콜은 쉽게 Axopatch에 프로그램된다.
16. 전체 세포 패치 모드가 설정되면, 평형 수 있도록 15 분을 대기 전에 시작 전압 또는 전류 클램프 프로토콜 씰의 안정성을 보장합니다. 우리는 이전에 설명 된 표준 프로토콜 및 기타 저널을 사용에 자세히 설명하지 않습니다.

결과

막대 모양의 가로 무늬 및 (자발적으로 박동하지 않음) 대기 셀 (그림 5A) 성인 된 심근 실적의 분리. 죽은 세포는 둥근 볼 것없고 줄무늬가 존재하지 않습니다. 대기 세포 배양과 유전자 발현 (그림 5B 및 5C)를 조작하는 아데노 바이러스로 형질이 될 수 있습니다. 배양은 24 시간, 생균의 형태가 변화하지 않는 후에, 그들은 여전히 칼슘 ^{2 +} 내성이며, 그?...

토론

이 보고서에서, 우리는 마우스 마음에서 성공적으로 분리 및 성인의 CM 문화에 필요한 기술을 설명했다. 우리의 기술은 상술 한 방법을 이용하여 CM 기능 및 흥분성의 후속 연구를 허용한다. 성인의 CM 기능을 연구하는 중요한 매개 변수는 고립 된 CM이의 건강과 품질입니다. 전술 한 바와 같이, 우리의 기술은 아데노 바이러스 / 렌티 바이러스 배양의 감염 및 세포 흥분과 수축 기능의 분석을 사용하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907