Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Resumen

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Resumen

El uso de los cardiomiocitos primarios (CM) en la cultura ha proporcionado un poderoso complemento de los modelos murinos de enfermedad cardíaca en el avance de nuestra comprensión de las enfermedades del corazón. En particular, la capacidad para estudiar la homeostasis de iones, la función del canal de iones, la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción y sus alteraciones en condiciones de enfermedad y por mutaciones causantes de enfermedades han conducido a una mejor aproximación a las enfermedades cardíacas. Por otra parte, la falta de una línea celular inmortalizada adecuada para imitar adultos CM, y las limitaciones de los CM neonatal (que carecen de muchas de las biomecánica característica estructural y funcional de los adultos CM) en la cultura han dificultado la comprensión de la compleja interacción entre las vías de señalización, canales iónicos y las propiedades contráctiles del corazón adulto fortalecer la importancia del estudio de cardiomiocitos adultos aislados. A continuación, presentamos los métodos para el aislamiento, cultivo, manipulación de la expresión génica mediante adenovirus-expreproteínas ssed, y posterior análisis funcional de los cardiomiocitos de ratón adulto. El uso de estas técnicas ayudará a desarrollar una visión mecanicista en las vías de señalización que regulan la excitabilidad celular, Ca ^{2 +} dinámica y la contractilidad y ofrecer una caracterización mucho más fisiológicamente relevantes de la enfermedad cardiovascular.

Introducción

Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular han servido como herramientas eficaces para la aclaración de los mecanismos fundamentales de la enfermedad ^1,2, así como para la identificación de dianas terapéuticas potenciales ^1,3. En particular, el uso de ambos modelos murinos de enfermedad cardíaca adquirida (tales como presión de la sobrecarga) ^4,5 y modelos de ratones transgénicos han avanzado nuestra comprensión de la enfermedad cardíaca ^6-8. El uso de técnicas de cultivo celular para estudiar las cascadas de señalización ^3,9,10 y alteraciones en las proteínas individuales que subyacen en la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el corazón ^11-13 en el nivel de la célula individual han complementado los in vivo en modelos de ratón. Sin embargo, la falta de líneas celulares adecuadas que reflejan la estructura y función CM adultos ha sido una limitación significativa. Los investigadores han intentado superar esta mediante el estudio de proteínas individuales, tales como canales de iones, en sistemas de expresión heterólogos ^{14, y si bien estos estudios nos han proporcionado información útil en términos de la biofísica de los canales iónicos o el tráfico de proteínas, la representación inadecuada del microambiente natural de los CM es una limitación importante. En segundo lugar, ya que la mayoría de estas células heterólogas no tienen un aparato contráctil madura, no ha sido posible estudiar la función contráctil y la compleja interacción entre la excitabilidad celular y la contracción. Por esta razón, los investigadores han recurrido a los cultivos de células cardíacas primarias para muchos de sus estudios funcionales in vitro. Por último, los estudios de cardiomiocitos aislados permiten la evaluación de la función contráctil sin los factores de confusión de preparación multicelular, incluyendo el efecto de la cicatriz o fibrosis y orientación de la fibra.}

Cardiomiocitos ventriculares de rata neonatales primarios (NRVMs) son relativamente fáciles de cultivar, pueden ser infectados con adenovirus y lentivirus de manipular la expresión génica ^15, unapor lo tanto, ND se han utilizado con éxito ^1, pero tienen limitaciones de su propia. A pesar de que proporcionan un microambiente fisiológico ¹ y han sido el caballo de batalla del campo de la señalización, las diferencias sustanciales entre la morfología y la organización subcelular de NRVMs y cardiomyoctyes adultos les hacen un modelo inadecuado para la investigación de los flujos iónicos y acoplamiento excitación-contracción en el corazón adulto . Más notablemente NRVMs carecen de un-t tubular subsistema definitiva ^4. Desde Ca ^{2 +} flujo y la dinámica son críticamente dependientes madura t-tubular y retículo sarcoplásmico (SR) Estructura ^6, Ca ^{2 +} y la dinámica de los estudios funcionales de la contractilidad cardíaca en NRVMs no son un reflejo exacto de estos procesos críticos en cardiomiocitos adultos. Además, algunos componentes de las vías de señalización diferentes entre ratones recién nacidos y adultos ^9, proporcionando así otra limitación para el estudio de los procesos de enfermedad y de su impact en la excitabilidad celular y la contractilidad en NRVMs. Finalmente, la distribución de la maquinaria contráctil conduce a multidireccional y no uniforme acortamiento celular limitar la exactitud de las mediciones contráctiles.

El uso de aislados cardiomiocitos adultos ofrece, por tanto, un sistema de modelado más preciso in vitro. El extraordinario crecimiento del conocimiento posible gracias a la manipulación genética de los ratones subraya la importancia de la obtención de cardiomiocitos aislados funcionales de los ratones. De hecho, la caracterización de los CM adultas aisladas de modelos de ratón ha arrojado luz sobre muchos eventos biológicos y patológicos. CM aisladas de modelos de ratones transgénicos han permitido estudios de la ganancia o pérdida de la función de las proteínas en las propiedades contráctiles de las células individuales ^2,16, y la viabilidad de modelos de enfermedades, como la isquemia / reperfusión ^17,18, complementando así la información obtenida a partir de Estudios in vivo sobre lalos ratones se. El uso de aislados adultos CM de modelos murinos de enfermedad cardiaca adquirida ^3,19,20 (como transversal sobrecarga de presión inducida por la constricción aórtica, que imita la hipertensión o estenosis de la válvula aórtica) o el ejercicio ^5,21 (para el modelado de la hipertrofia fisiológica) permite un examen de la interacción de las cascadas de señalización implicadas en estos procesos con la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el nivel de la célula individual. Además, la capacidad de manipular la expresión génica utilizando la expresión génica adenoviral impulsada en adultos CM nos proporciona la oportunidad de diseccionar los componentes de las vías de señalización complejos.

Desde una perspectiva electrofisiológico, voltaje de células enteras y los experimentos de fijación actuales en aislados adulto CM han sido fundamentales en el esclarecimiento de la naturaleza de los flujos iónicos al inicio del estudio y en varios estados de la enfermedad. Debido a la compleja estructura de la membrana celular y la protección de bi diferencialen las estructuras de andamiaje entre el adulto y los CM NRVMs o líneas celulares heterólogos, la capacidad para reparar las células adultas da una mejor representación de los efectos de ciertas proteínas de membrana, proteínas estructurales, y socios de canales iónicos que interactúan sobre los componentes electrofisiológicas del corazón adulto.

A pesar de estas ventajas importantes en el estudio de adultos cardiomiocitos murinos, aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ratones adultos ha sido un reto, instando a la necesidad de una descripción sistemática y precisa de la metodología para aislar cardiomiocitos viables de ratón y de mantenerlas en cultivo para permitir su posterior manipulación genética utilizando viral vectores. Estudios previos han utilizado ya sea de forma aguda aislada de ratón adulto CM o cultivados de rata adulta CM. Estos últimos son más fáciles de cultivar que los CM ratón adulto, y la mayoría de los experimentos de manipulación de la expresión génica in vitro han utilizado ratas adultas CM. Pocos estudios se han alterado con éxito e investigado functila expresión de genes onal en ratón adulto CM, presentando una gran limitación en el alcance de los experimentos. Por lo tanto, aquí presentamos en detalle tales metodologías, modificado a partir de investigaciones anteriores, para el aislamiento ^7,8,22, cultura ^3,10,15,23, infección adenoviral ^11-13,15, y el análisis funcional de cardiomyoctyes ventriculares de ratón adulto. Este protocolo de aislamiento resultados en Ca ^{2 +,} cardiomiocitos excitables tolerantes que tenemos cultivadas con éxito durante un máximo de 72 horas y transitoriamente transfectadas con adenovirus. La funcionalidad de estas células aisladas se puede evaluar utilizando el sistema de imágenes MMSYS ^14,24 y de patch clamp, que también será discutido.

Protocolo

1. El aislamiento de los cardiomiocitos

Materiales (figura 1)

Microdissecting fórceps
Fórceps del tejido
Pinzas hemostáticas Delicadas
Pinzas hemostáticas
Microdissecting, dentadas, pinzas curvas
Tijeras de funcionamiento, recto
Tijeras de funcionamiento, curvado
15 ml tubos Falcon (5)
60 mm placa de Petri
Tampón fosfato salino (PBS)
Nylon Mesh - tamaño de poro de 400 micras
Pequeño embudo
Cera recubierto, seda trenzada 4-0, 19 mm, 7-10 cm de largo
Aguja hipodérmica no, extremo romo, 24 G o aguja alimentación de los animales comerciales (24 x 1 in, W/1-1/4)
La heparina de sodio
Mezcla de ketamina / xilazina
Pipetas Pasteur
OptiVision Dissecting Goggles
Sistema IonOptix MMSYS

Nota: Si el cultivo de células, ver sección 2 en cultivo celular antes de iniciar este protocolo.

Nota: Todos los ratones fueron atendidos enuna instalación de barrera y sacrificado de acuerdo con los reglamentos aprobados IACUC, prácticas y procedimientos.

Nota: Antes de comenzar el procedimiento, todo el sistema debe ser precalentado para asegurar que todos los elementos del sistema de Langendorff (Figura 2A, Figura 3) se calientan a 37 ° C para permitir para la actividad adecuada y completa colagenasa.

1. Inyectar ratones adultos (~ 12 semanas) con 150 unidades USP de heparina sódica en el espacio abdominal.
2. Se anestesia con una inyección de una mezcla de ketamina / xilazina en una dosis dependiente de peso (Tabla 1).
   1. 80:12 mg / kg de ketamina: xilazina receta: 2,6 ml de ketamina (100 mg / ml) + 0,4 ml de xilazina (100 mg / ml) + 37 ml de PBS. Final: ketamina = 6,5 mg / ml; xilazina = 1 mg / ml
3. Asegure el ratón sedado a la plataforma de funcionamiento, cortar el corazón, y colocar en un plato de la temperatura ambiente PBS o solución salina 0,9% (Figura 1J). Physalina siologic permite que el corazón se contraiga intacta para una mejor extrusión de sangre en la cámara y la fácil identificación de la aorta antes de la etapa 1.6. Los ratones fueron evaluados para verificar que están profundamente anestesiados mediante la pérdida de la extremidad trasera toe reflejo del pellizco y disminución de la frecuencia respiratoria antes de la aparición de la toracotomía.
4. Utilice OptiVision gafas de disección (Figura 1A) para identificar y exponer la aorta. Extracción del tejido alrededor de la aorta, aunque sí facilitar la visualización del vaso, no es necesario para la optimización de la aislamiento de células si la raíz aórtica es claramente visible.
5. Cebado de la bomba con tampón de perfusión (Tabla 2). La temperatura debe mantenerse a 37 ° C para la duración del procedimiento mediante una controlada, baño de agua circulante (Figura 2D).
6. Monte el corazón sobre el aparato Langendorff (Figura 2A). El uso de dos pinzas de micro-disección (Figuras 1D-E), prIme la aorta alrededor del, aguja punta roma no hipodérmica (24 G) con tubo de silicona en la punta distal. Alternativamente, una aguja de alimentación de los animales comercial (24 x 1 en, W/1-1/4) se puede utilizar. El tubo de silicona en la aguja 24 G o la aguja de alimentación de los animales permitirá para fijar la sutura a través de la ranura. Coloque la aorta en la aguja como un calcetín. (Figura 2 C).
   1. Nota: Es importante asegurarse de que el extremo de la aguja se apoya en la aorta ascendente, idealmente en la raíz de la aorta distal al hueso coxal derecho, pero que no se extiende a través de la válvula aórtica en el ventrículo izquierdo, ya que esto será severamente limitar la capacidad de los tampones para perfundir de manera efectiva a través del corazón a través de las arterias coronarias.
7. Asegure el corazón a la aguja mediante la vinculación de una pequeña longitud de sutura de seda (7-10 cm de largo) (Figura 1K) alrededor de la parte superior de la aorta, asegurándose de que el lazo está en el nivel de la aorta ascendente, por debajo de la Arter innominada derechaY, pero está por encima del extremo de la aguja.
8. Bajar el corazón en el interior de la copa cónica (Figura 2B) para ayudar a mantener una temperatura ambiente adecuada.
9. Perfundir el corazón con tampón de perfusión durante 5 min a una velocidad de 1 ml / min y sujetar el flujo de salida cámara de vidrio para permitir que el líquido de perfusión para recoger en el vidrio cónico y el sobre el corazón. El esquema para digerir el corazón se muestra en la Figura 3.
   1. En este momento debería ver el volumen del aumento corazón. Además, la sangre en el tejido cardíaco se sustituye por perfusión, causando palidez tejido.
10. Suelte la abrazadera de salida para drenar el líquido de perfusión. Parar la bomba para mover el tubo desde el contenedor de tampón de perfusión para el contenedor de tampón de enzima (Figura 2E). Reiniciar la bomba para comenzar a perfundir el corazón con tampón de enzima (Tabla 2) a 1 ml / min. Fije la salida de nuevo para permitir que el tampón de la enzima en Sobre lacorazón.
    1. Aquí, como la enzima se perfunde el corazón y la digestión del tejido conectivo, el corazón se volverá más pálido y la integridad estructural disminuirá.
    2. Para determinar cuándo cortar los ventrículos del corazón digerido, levante el corazón de la copa cónica, apriete suavemente el corazón con unas pinzas y recoger unas cuantas gotas de líquido de perfusión en una pequeña placa de Petri y comprobar para ver si las células individuales están cayendo .
    3. Para el principiante, es útil para conectar la línea de perfusión con un manómetro. Cuando el corazón está siendo digerida la presión disminuirá rápidamente, ya que el tejido conectivo no se mantiene la resistencia. El manómetro es también útil para el principiante para garantizar que la posición de la aguja está por encima de la válvula aórtica y no en el ventrículo. Baja presión indicará que la aguja está en la cámara ventricular y alta presión indicó que la aguja toque la válvula.
11. Cortar los ventrículos del corazón en un platollena de tampón de transferencia (A) (tabla 2) cuando la presión ventricular empieza a disminuir drásticamente o cuando usted es capaz de ver las células individuales en el perfundido. Esto usualmente toma ~ 7-10 min.
12. Una vez más el uso de fórceps micro-disección (Figura 1C), pelos en los ventrículos en trozos pequeños para disociar. Una digestión exitosa dejará casi no hay trozos sólidos de tejido después del picado, con la mayor parte del tejido convertirse en amorfo después de la disociación.
    1. Para disociar aún más el tejido, una pipeta la solución de entrada / salida utilizando una pipeta Pasteur de plástico (Figura 4) de la que la punta había sido cortada en un ángulo de ~ 45 °. Esta modificación sirve para aumentar el espacio diametral interior de la punta de la pipeta disminuyendo así la cantidad de esfuerzo de cizallamiento en las células como el tejido se tritura.
    2. Antes de la disección del tejido con las pinzas es posible separar las cámaras individuales y por separado disociar auricular, ventricular izquierda o derecho de propocélulas ventriculares t.
13. Asegure la malla cuadrado (Figura 1M) para un pequeño embudo (Figura 1 l) con abrazaderas y coloque este aparato de filtración en un tubo Falcon de 15 ml (Figura 1I).
14. Utilice la pipeta Pasteur modificado para eliminar la solución de células de la placa y filtrar la solución en el tubo Falcon.
15. Permita que las células vivas se depositen en el fondo del tubo (sedimentación de células vivas debería tomar 2-4 min).
16. Alícuota de 2,5 ml de cada una de las cuatro soluciones de calcio (Tabla 3) en 4 tubos Falcon de 15 ml separados.
17. Una vez más utilizando una pipeta Pasteur estándar, quitar cuidadosamente el sedimento celular a partir de la parte inferior del tubo y transferir las células a la primera de las soluciones de calcio.
18. Permitir que las células se depositan en el fondo del tubo y repita el paso 1.17 en las soluciones de calcio posteriores hasta que las células están en la última solución.
19. No dejes que las células se asientan en el fourth solución de calcio. Tapar el tubo y convertirlo en su lado.

2. Cultivo Celular

1. Antes de que el aislamiento, la placa 1 ug / ml de laminina natural del ratón sobre cubreobjetos de vidrio y se incuba durante al menos 1 hora a 37 ° C y 2% de CO _2. También permiten que su cubierta metálica y medios de cultivo (Tabla 4) para calentar en la incubadora a 37 ° C y 2% de CO _2. Esto permite que el CO2 _disuelto en los medios de comunicación se equilibre.
   1. No quite la parte superior de los medios de comunicación. Simplemente afloje la parte superior para evitar la contaminación.
2. Permitir que las células aisladas para sedimentar en el fondo del tubo Falcon.
3. Retire el sedimento usando una pipeta Pasteur de plástico estándar y resuspender en la cantidad apropiada de chapado medios de comunicación.
4. Placa de las células sobre los cubreobjetos recubiertas con laminina en el plato de tamaño apropiado y se incuban en 37 ° C y 2% de CO ₂ durante al menos 30-60 minutos para permitir que las células se adhieran a los cubreobjetos.
5. ** Si la transfección con adenovirus, diluir el virus en una cantidad apropiada de medio de siembra y reemplazar el medio de siembra en el plato con los medios de comunicación que contiene el virus. Deje que el virus se incuba en las células durante 2 horas en 37 ° C y 2% de CO _2. **
6. Retire el papel de recubrimiento de la placa y reemplazar con medios de cultivo.
7. Cambie cuidadosamente los medios de cultivo de cada día con el fin de no molestar a las células sobre los cubreobjetos.

Usando este procedimiento, las células se han cultivado con éxito durante un máximo de 72 h. Imágenes de células cultivadas y transfectadas GFP se pueden encontrar en la Figura 5.

3. Sistema MMSYS

1. Encienda el sistema MMSYS asegurar que la lámpara de arco se inicia en primer lugar.
2. Conectar los tubos de la bomba a la entrada y salidas apropiadas de la cámara de MMSYS (Figura 6).
3. Primer el sistema con tampón de calcio (B) (Tabla 2).
4. Coloque un aprcubreobjetos opriately tamaño en la cámara y atar (Figura 6E). La mayoría de las cámaras de MMSYS utilizan ya sea 22 mm o 25 mm cubreobjetos cuadrados. Consulte el manual de usuario MMSYS para determinar el cubreobjetos apropiado para su cámara.
5. Transferir 500 l de la solución de células a un pequeño tubo de Eppendorf.
6. Añadir 0,5 l Fura2-AM (solución madre de 1 mg / l) para el tubo pequeño de las células y permitir que se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5-7 min. Esto permite que el Fura2-AM a "carga" en las células a través de una rápida difusión pasiva a través de la membrana celular.
   1. Deje que las células cargadas Fura-2 de pellets a la parte inferior del tubo, y se lava el exceso de Fura con 500 l de tampón de calcio B.
7. Apague las luces de la habitación.
8. Utilizando una pipeta Pasteur estándar, deje caer 1-2 gotas (dependiendo de la concentración celular) de la solución de células "cargado" en el centro de la cámara (Figura 6C) y permitir que las células To asentarse en el cubreobjetos durante 5 min.
   1. La densidad de las células en la cámara debe ser tal que las células individuales que no se solapan se pueden ver fácilmente en la plataforma de adquisición de datos MMSYS.
9. Con cuidado, comienzan a fluir tampón de calcio (B) a través de la cámara.
10. Aumente la temperatura de la cámara a 37 ° C.
    1. IMPORTANTE: No encienda el aparato de calentamiento hasta que se haya iniciado el flujo. Esto puede dañar seriamente el termistor de retroalimentación (Figura 6A).
11. Asegúrese de que la cámara está conectada a la MyoPacer a través de los cables de conexión (Figura 6B) y comenzar a caminar de las células 5 Hz a 1,5 veces el umbral de estimulación de las células.
12. Elija una célula que está latiendo en la frecuencia correcta y moverlo en la abertura enmarcar.
13. Ajustar la cámara y de encuadre dimensiones de abertura de modo que toda la célula se encuentra en el centro de la ventana, dirigido horizontalmente, con la sarcómeros APpadre.
    1. Para ajustar la longitud de la célula roja y verde (derecha e izquierda) indicadores de fotodiodos para el borde de la celda. Ajuste el contraste para optimizar el contraste negro / blanco en los bordes de la celda. Consulte el manual de Ionoptix para más detalles.
14. Colocar la caja en una superficie de la celda que contiene sarcómeros bien definidos y ajustar el enfoque para optimizar el pico del espectro de potencia (rojo). También ajuste el brillo del microscopio para optimizar la ventana de suavizado azul y contrastar información negro.
15. Ajuste las barras de umbral verdes para captar la mayor cantidad de la potencia del espectro rojo (pico) y la menor cantidad de fondo posible.
16. Comience a grabar.
17. Después de suficientes datos ha sido registrado, haga clic en "Pausa" para detener temporalmente la grabación y, asegurar que ni el enfoque ni las dimensiones de la ventana de visualización se alteran, mover etapa del microscopio a un área del cubreobjetos en la que no hay células o material celular pueden ser visto. Length de grabación varía dependiendo del protocolo experimental del investigador.
    1. Nota: Al hacer clic en "Stop" terminará la grabación y ningún fondo podrá ser grabado para esa celda.
18. Haga clic en "Continuar" para grabar una medición de fondo.
19. Después de suficientes antecedentes ha sido registrado haz clic en "Stop" para terminar la grabación.
20. Haga clic en "File >> Save" para guardar todos los rastros de esa celda en una sola. Zpt archivo.
21. Repita los pasos 03.12 a 03.20 hasta que se hayan registrado suficientes células.
22. Consulte el manual del usuario IonOptix-MMSYS 12 para obtener instrucciones sobre el análisis de los datos registrados. Datos grabados característicos de los cardiomiocitos de tipo salvaje se muestran en la en la Figura 7.

4. Patch Clamp

Sujeción Parche de diferentes tipos de células han sido bien descrito previamente en esta revista ^25-28. Por lo tanto, nos centramos en algún críticoparámetros de Al para éxito patch clamp de cardiomiocitos adultos aislados utilizando el protocolo descrito.

1. El uso de un extractor de pipeta y vidrio de borosilicato (con filamento: OD 1,5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm de longitud) tire de una pipeta que exhibe ~ 2,0-3,0 MΩ cuando se llena con solución de la pipeta (Tabla 5).
2. Fuego-pulir la punta de la pipeta suavemente con un Narishige u otro pulidor de fuego vertical. La resistencia de la pipeta parche debe ser de 2-4 meses después de pulido al fuego.
3. Encienda el ordenador, amplificador (Axopatch 200B), convertidor AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) y Micromanipulador (MP-285). Para el conjunto de patch clamp de células, comenzamos con los parámetros estándar como se describe anteriormente.
4. Para culta adulto CM, sacarlos de la incubadora y suavemente lavar el portaobjetos en el que los CM están chapados en PBS a temperatura ambiente.
5. Retire con cuidado el cubreobjetos y colocarlo en la cámara de perfusión en el microscopio invertido (Nikon TE 2000).
   1. Asegúrese de que la entrada para el sistema de perfusión y de salida (de succión) se encuentran justo encima de la superficie del cubreobjetos.
6. Iniciar la perfusión con la solución extra-celular apropiada (Tabla 5).
7. Para el adulto recién disociada CM, coloque un cubreobjetos recubierto de colágeno en el sistema de perfusión que el anterior.
   1. Dado que las células serán en solución, vuelva a colocar suavemente la solución con tampón extracelular.
8. Mediante la pipeta Pasteur modificado (Figura 4), ​​resuspender suavemente las células en el tampón extracelular, tomar una alícuota y colocarlo en el cubreobjetos.
9. Deje que las células se adhieren durante 10-15 minutos antes de iniciar la perfusión como en 4.4.
10. Back-llenar toda la pipeta parche de células con tampón intracelular utilizando un Microfil (World Precision Instruments, 28 G) de la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la punta de la pipeta; golpee suavemente para permitir que las burbujas de aire que flotan en la surfaCE de la solución.
11. Conecte el parche pipeta llena hasta la pipeta titular, asegurando que existe un contacto entre el microelectrodo y la solución interna.
    1. Utilizamos electrodos de cloruro de plata, pero nos encargamos de 'cloruración' los alambres de plata por lo menos una vez a la semana por inmersión durante la noche en lejía de uso doméstico.
12. Baje suavemente la pipeta en el baño, lo que garantiza que el electrodo de baño se encuentra inmersa en todo momento en la solución del baño / extra-celular. Offset cualquier potenciales de unión líquida en este momento. Las grandes potenciales de unión pueden ser un signo de deterioro de cloruro de plata en los electrodos.
13. Saludable adulto cilíndrica CM se identifican en el microscopio y se centra en el campo de visión. Como se ha descrito anteriormente, una combinación de mover el micromanipulador y ajustar el enfoque permite una estrecha proximidad de la pipeta de parche y la superficie de la CM.
    1. Una vez que están en el mismo plano focal, se utiliza una combinación de visualción de la célula y el pulso de prueba (disponible en el Axopatch 200B).
    2. Una vez que la resistencia de la pipeta disminuye en un medio (lo que sugiere que la pipeta está en contacto con la superficie de la célula), y la célula continúa buscando cilíndrica, establecemos sello gigaohmio usando una succión suave.
    3. Para MC, preferimos la boca de aspiración de establecer una presión negativa. Si se obtiene éxito un gigaseal, usamos de nuevo suave succión boca rítmica para 'break-in "a la celda para establecer el modo de parches de células enteras.
14. Potenciales de reposo típicos de los CM saludable están en el orden de -85 a -90 mV. Una vez que se obtiene una gigaseal, medir el potencial de membrana en reposo utilizando la pinza de corriente con I = 0 pA.
    1. Si el potencial de membrana en reposo se despolariza esto puede indicar una célula dañada o un sello pobre.
15. Debido a que los CM son células grandes con una gran cantidad de superficie, requiere una cuidadosa atención debe prestarse a la capacidad de compensación, especialmente wgallina activar rápidamente corrientes tales como el canal de sodio debe ser estudiado. Si la compensación de capacitancia adecuada no se puede obtener utilizando el construido en los ajustes de compensación en el generador de impulsos, prepulsos a la tensión de sub-umbral y polaridad opuesta puede tener que ser aplicado y la corriente resultante se resta de la señal grabada. Tal protocolo se programa fácilmente en Axopatch.
16. Una vez que se ha establecido el modo de parches de células enteras, esperar 15 minutos para permitir el equilibrio y garantizar la estabilidad de la junta antes de la tensión de principio o protocolos de corriente con la pinza. Utilizamos protocolos estándar que han sido descritos anteriormente en esta y otras revistas y no se elaborará sobre.

Resultados

El aislamiento de los adultos cardiomyoctyes resultados en las células en forma de barra, estriados y de reposo (no de forma espontánea de latir) (Figura 5A). Las células muertas se verá redondeado y sin estrías estarán presentes. Las células quiescentes pueden ser cultivadas y transfectadas con adenovirus para manipular la expresión génica (figuras 5B y 5C). Después de 24 horas de cultivo, la morfología de las células vivas no cambia, siguen siendo Ca ^...

Discusión

En este informe, hemos descrito las técnicas necesarias para el éxito en el aislamiento y la cultura de los adultos los CM del corazón de ratón. Nuestra técnica permite para el estudio posterior de la función de CM y la excitabilidad usando los métodos descritos anteriormente. El parámetro crítico para el estudio de la funcionalidad de adultos CM es la salud y la calidad de los CM aislado. Como se describió anteriormente, nuestras técnicas permiten un alto rendimiento de células funcionales que son susceptib...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907