İzolasyon, Kültür ve Yetişkin Fare Cardiomyoctyes Fonksiyonel Karakterizasyonu

Özet

Burada bir perfüzyon Langendorff sistemi kullanılarak erişkin fare cardiomyoctyes izolasyonunu tarif eder. Elde edilen hücreler, + toleranslı elektriksel olarak hareketsiz Ca2 ve kültürlenmiş ve adeno-veya gen ekspresyonunu değiştirmek için lentivirüsler ile transfekte edilmiş olabilir. Bunların işlevi de MMSYS sistemi ve yama kelepçe teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Özet

Kültür birincil kardiyomiyositlerindeki (CMS) kullanımı, kalp hastalığı anlayışımızı ilerleyen kalp hastalığı olan kemirgen modellerinde güçlü bir tamamlayıcı sağladı. Özellikle, hasta koşulları ve hastalığa neden olan mutasyonlar ile iyon homeostazı, iyon kanalı fonksiyonu, hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kuplajı ve değişiklikler çalışma yeteneği kalp hastalıkları hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Ayrıca, kültür yetişkin CMS taklit etmek yeterli ölümsüzleştirdi hücre hattı eksikliği ve yenidoğan CMS sınırlamaları (erişkin CMS yapısal ve işlevsel biyomekanik özelliği nedeniyle birçok eksikliği olan), sinyal yolları arasındaki karmaşık etkileşimin anlayışımızı engel var iyon kanalları ve erişkin izole kardiyomiyositlerin okuyan önemini güçlendirilmesi erişkin kalp kasılma özellikleri. Burada, adenoviral-Expre ile gen ekspresyonunun izolasyon, kültür, manipülasyon için yöntemler sunmakssed proteinleri ve erişkin fare kardiyomiyositlerin sonraki fonksiyonel analiz. Bu tekniklerin kullanımı hücresel eksitabilitesi düzenleyen yolları, Ca ^{2 +} dinamiklerini ve kasılma sinyalizasyon içine mekanik anlayış geliştirmek ve kardiyovasküler hastalık çok daha önemli fizyolojik karakterizasyonu sağlamak için yardımcı olacaktır.

Giriş

Kalp-damar hastalığı olan kemirgen modellerinde potansiyel terapötik hedefler ^1,3 belirlenmesi için temel bir hastalık mekanizmalarının ^1,2 açıklık yanı sıra için etkili araçlar olarak hizmet etmişlerdir. Özellikle, (örneğin basınç aşırı olarak) edinilmiş kalp hastalıklarının hem kemirgen modellerinde ^4,5 ve transgenik fare modellerinin kullanımının kalp hastalığı ^6-8 anlayışımızı gelişmiş var. Tek hücre düzeyinde kalp ^11-13 hücre uyarılabilirliğini ve uyanlma-kasılma kaplin altında yatan tek tek proteinler de sinyal iletim ^3,9,10 ve değişiklikler çalışma hücre kültürü tekniklerinin kullanımı in vivo fare modelleri tamamlayıcı var. Bununla birlikte, yetişkin CM yapısı ve fonksiyonu yansıtır yeterli hücre çizgilerinin olmaması önemli bir sınırlama olmuştur. Araştırmacılar, heterolog sentezleme sistemlerinde, örneğin iyon kanalları gibi tek tek proteinler, inceleyerek bu üstesinden gelmek çalışmışlardır ^{14, ve bu çalışmalar iyon kanal biyofizik veya protein kaçakçılığı, CMS yerli mikro yetersiz temsili açısından yararlı bilgiler bize vermiş ise önemli bir kısıtlamadır. İkinci olarak, bu heterolog hücrelerin çoğu olgun bir kasılma aparatı yok çünkü, bu kasılma fonksiyonunu ve hücresel uyarılmayı ve daralma arasındaki karmaşık etkileşimi incelemek mümkün olmamıştır. Bu nedenle araştırmacılar, in vitro fonksiyonel çalışmaların çoğu için temel kardiyak hücre kültürlerine döndü. Son olarak, izole kardiyomyosit çalışmalar skar veya fibrozis ve fiber yönlendirme etkisi dahil çok hücreli hazırlık faktörlerin olmayan kasılma fonksiyonu değerlendirmesini sağlar.}

İlköğretim yenidoğan sıçan ventrikül kardiyomiyositler (NRVMs) kültür nispeten kolay, gen ifadesini ¹⁵ işlemek için adenovirüslerden ve lentivirüsler ile enfekte olabilir olduğu birnd nedenle başarıyla ¹ kullanılır, ancak kendi sınırlamaları var olmuştur. Bir fizyolojik mikroortam ¹ ​​sağlamak ve sinyal alanın beygir olmasına rağmen, morfoloji ve NRVMs ve yetişkin cardiomyoctyes subselüler örgüt arasındaki önemli farklar onları erişkin kalp iyonik eritici ve uyarılma-kasılma kenet soruşturma için yetersiz bir model yapmak . En önemlisi NRVMs kesin bir t-tüp şeklindeki alt sistem ⁴ yoksundur. Ca ^{2 +} akı ve dinamikleri olgun t-boru ve sarkoplazmik retikulum (SR) yapısı ^6, Ca ^{2 +} dinamikleri ve NRVMs yılında kalp kasılmasında fonksiyonel çalışmalarda kritik bağımlı olduğundan erişkin kardiomyositlerindeki bu kritik süreçlerin doğru bir yansıması değildir. Ayrıca, sinyal yollarının bazı bileşenler, böylece başka bir hastalık süreçlerini incelemek için sınırlama ve i sağlayarak, yenidoğan ve yetişkin farelerin ⁹ arasında farklılıkNRVMs hücresel uyarılmayı ve kasılma Mpact. Son olarak, kasılma makine dağıtım kontraktil ölçümlerin doğruluğunu sınırlayan çok yönlü ve düzgün olmayan hücre kısalmasına yol açar.

Izole edilmiş yetişkin kardiyomiyositlerde kullanılması bu nedenle, daha doğru bir in vitro model sistemi sağlar. Farelerin genetik manipülasyonu ile mümkün bilginin olağanüstü büyüme farelerden izole edilmiş fonksiyonel kardiyomiyositlerde elde önemini vurgulamaktadır. Aslında, fare modellerinde izole yetişkin CMS karakterizasyonu birçok biyolojik ve patolojik olaylara ışık tutmuştur. Transgenik fare modellerinde izole CMs ve böylece de elde edilen bilgiler tamamlayıcı, iskemi / reperfüzyon ^17,18 gibi hastalık modellerinde kazanç ya da proteinlerin fonksiyon kaybı tek hücre ^2,16 kasılma özelliklerini ve canlılığı çalışmaları için izin in vivo çalışmalardase fareler. Ya da (fizyolojik hipertrofisi modelleme için) egzersiz ^5,21 incelenmesi için izin verir (mimikler hipertansiyon veya aort kapak darlığı böyle enine aort daralma kaynaklı basınç yüklenmesi gibi) edinilmiş kalp hastalığı ^3,19,20 sıçan modellerinde izole erişkin CMS Kullanımı tek hücre düzeyinde hücresel uyarılımın ve uyanlma-kasılma kaplin ile bu işlemlerde rol sinyal iletim etkileşimi. Ayrıca, yetişkin CMS adenoviral odaklı gen ifadesi kullanılarak gen ifadesini işlemek için yeteneği bize karmaşık sinyal yollarının bileşenlerini incelemek için fırsat tanıyor.

Elektrofizyolojik bir perspektiften bakıldığında, tüm hücre voltaj ve izole yetişkin CMS güncel kelepçe deneyler Başlangıçta iyonik akılarının doğasını durulaştırmada ve çeşitli hastalık durumlarında kritik olmuştur. Nedeniyle hücre zarının karmaşık yapısı ve diferansiyel proteYetişkin Cms ve NRVMs ya da heterolog hücre hatları arasında iskele yapılarda, yetişkin hücrelerin yama yeteneği belirli zar proteinleri, yapısal proteinler, ve yetişkin kalp elektrofizyolojik parçaları üzerinde iyon kanalı etkileşim ortaklarının etkileri çok daha iyi bir temsilini verir.

, Yetişkin kemirgen kardiyomiyositlerin okuyan tecrit ve yetişkin fareler kardiyomiyositler zorlu olmuştur kültüre, canlı fare kardiyomiyositlerin izole etmek ve viral kullanarak daha fazla genetik manipülasyon izin kültür onları korumak için metodoloji sistematik ve doğru açıklama için ihtiyaç çağıran böyle önemli avantajlara rağmen vektörleri. Önceki çalışmalar akut izole fare yetişkin CMS veya kültür sıçan yetişkin CMS ya kullandık. İkincisi yetişkin fare cm daha kültüre kolaydır ve in vitro olarak gen ifadesini manipüle en deneyleri sıçan yetişkin cm kullandık. Birkaç çalışmaları başarıyla değişmiş ve functi araştırdıkdeneyler kapsamında büyük bir sınırlama sunulması yetişkin fare CMS onal gen ifadesi. Bu nedenle, burada detaylı olarak izolasyon ^7,8,22, kültür ^3,10,15,23, adenoviral enfeksiyon ^11-13,15 ve yetişkin fare ventriküler cardiomyoctyes fonksiyonel analizi için önceki soruşturmalarda modifiye gibi metodolojileri, mevcut. Bu izolasyon protokolünün kadar 72 saat boyunca başarılı bir şekilde kültürlendi ve geçici olarak adenovirüs ile transfekte sahip ^{Ca2 +-dayanıklı,} uyarılabilen kardiyomiyositlerde sonuçlanır. Bu izole edilmiş hücrelere ait işlevleri MMSYS ^14,24 ve görüntüleme sistemi ayrıca tartışılacaktır yama kelepçe kullanılarak değerlendirilebilir.

Protokol

1.. Kardiyomyosit İzolasyon

Malzeme (Şekil 1)

Forseps Microdissecting
Doku forseps
Narin hemostatik forseps
Hemostatik forseps
Microdissecting, tırtıklı, kavisli forseps
Çalışma makas, düz
Çalışma makas, kavisli
15 ml Falcon tüpleri (5)
60 mm Petri
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)
Naylon Mesh - 400 mikron gözenek boyutu
Küçük huni
Balmumu kaplı, örgülü ipek 4-0, 19 mm uzun, 7-10 cm
Non-derialtı iğne, küt uç, 24 G veya ticari hayvan besleme iğne (W/1-1/4, 24 x 1)
Heparin sodyum
Ketamin / ksilazin karışımı
Pasteur Pipetler
OptiVision Diseksiyon Goggles
IonOptix MMSYS sistemi

Not: hücreleri kültür ise, bu protokolü başlamadan önce hücre kültüründe 2. kısmına bakınız.

Not: Tüm fareleri için bakımonaylanmış IACUC düzenlemeleri, uygulamaları ve prosedürlerine göre bir bariyer tesisi ve kurban.

Not: Ön işleme başlamadan için, tüm sistemin Langendorff sistemine (Şekil 2A, Şekil 3) tüm öğeleri uygun ve eksiksiz kolajenaz aktivitesi sağlamak için 37 ° C'ye ısıtıldı sağlamak için önceden ısıtılmış olmalıdır.

1. 150 USP birimleri karın boşluğu içine heparin sodyum erişkin fareler (~ 12 hafta) enjekte edilir.
2. Bir kilo bağımlı doz (Tablo 1), bir ketamin / ksilazin karışımı bir enjeksiyon ile anestezi.
   1. 80:12 mg / kg ketamin: ksilazin tarifi: 2.6 ml ketamin (100 mg / ml) + 0.4 ml ksilazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Nihai: ketamin = 6.5 mg / ml; xylazine = 1 mg / ml
3. , Işletme ped sedasyon fareyi Güvenli kalp kesip, ve bir oda sıcaklığı PBS tabak veya% 0,9 tuz (Şekil 1J) içine yerleştirin. Physiologic tuzlu dokunulmamış kalp odası içinde kan daha iyi ekstrüzyon ve 1,6 aşamasından önce aort kolay tanımlama için sözleşme sağlar. Fareler onlar derinden arka bacak ayak tutam refleksi ve önceki torakotomi başlangıcından solunum hızının yavaşlaması kaybı ile anestezi sağlamak için kontrol edildi.
4. Aorta belirlemek ve maruz OptiVision diseksiyon gözlük (Şekil 1A) kullanın. Aort kökü açıkça görülebilir olup olmadığını kabın vizüalizasyon yapar, ancak, aort etrafındaki doku çıkarma hücre izolasyonu optimizasyonu için gerekli değildir.
5. Prime perfüzyon tamponu ile pompa (Tablo 2). Sıcaklık kullanılarak prosedür uzunluğu boyunca 37 ° C ısıda tutulur gereken bir su banyosu (Şekil 2B) dolaşan, kontrol edilir.
6. Langendorff cihazına (Şekil 2A) üzerine kalp monte edin. İki mikro diseksiyon forseps (Şekil 1D-E) kullanılarak, pruzak ucunda silikon tüp ile non-derialtı, künt uç iğne (24 G) etrafında aort ime. Alternatif olarak (W/1-1/4, 24 x 1), ticari hayvan besleme iğne kullanılabilir. 24 G iğne ya da hayvan besleme iğnesi üzerindeki silikon tüp oluk üzerinde dikiş güvenliğini sağlayacaktır. Bir çorap gibi iğne aorta yerleştirin. (Şekil 2C).
   1. Not: Bu ciddi olacak gibi, sol ventrikül içine aort kapağı boyunca uzanan olmadığı iğnenin ucu ideal doğru innominat için aort kökü distalinde, aortta aittir emin olmak önemlidir, ancak etkin bir şekilde koroner arter üzerinden kalbinden serpmek için tampon yeteneğini sınırlar.
7. Kravat doğru innominat arter altında, çıkan aorta düzeyinde olduğunu sağlanması, aortun üst etrafında (7-10 cm uzunluğunda) sütür ipek küçük bir uzunluğu (Şekil 1K) bağlayarak iğneye kalp Securey, ancak iğnenin ucu üzerindedir.
8. Uygun bir ortam sıcaklığını korumak için konik camın iç (Şekil 2B) içine kalp indirin.
9. 1 ml / dk 'lık bir hızda 5 dakika boyunca perfüzyon tamponu ile kalp serpmek ve perfüzyon konik cam toplamak ve kalp zarf izin vermek için cam odacık çıkış kelepçe. Kalp sindirim için, Şekil 3'te şematik olarak gösterilmiştir.
   1. Bu noktada kalp artışın hacmi görmelisiniz. Buna ek olarak, kalp dokusundaki kan doku solgunluk neden perfüzat ile değiştirilecektir.
10. Perfüzat drenaj çıkış kelepçeyi çözün. Enzim tampon kabın (Şekil 2E) perfüzyon tampon haznesinden boru taşımak için bir pompa durdurun. 1 ml / dk da enzim tamponu (Tablo 2) ile kalp serpmek başlamak için pompayı yeniden başlatın. Enzim tampon zarf izin vermek için tekrar çıkış kelepçekalp.
    1. Burada, enzim, perfüze kalp ve bağ dokusu sindirerek olduğu gibi, kalp soluk olur ve yapısal bütünlük azalacaktır.
    2. , Sindirilmiş kalpten ventrikülleri kesilmiş konik camdan kalbi kaldırın, forseps ile yavaşça kalp sıkmak ve küçük bir Petri kabındaki Perfüzatın birkaç damla toplamak ve tek bir hücre bırakarak olup olmadığını görmek için kontrol etmek için zaman belirlemek için .
    3. Acemi için bir manometre ile perfüzyon hattı bağlamak için yararlı olduğunu. Kalp sindirilir oluyor zaman bağ dokusu direncini tutmaz gibi basınç hızla azalacak. Manometre iğnenin konumunu aort kapağının olup ventrikülde olduğundan emin olmak için, aynı zamanda acemi için yararlıdır. Düşük basınç iğne ventriküler odası olan ve yüksek basınç iğne valfı temas olduğunu göstermiştir olduğunu gösterir.
11. Bir çanak içine kalpten ventriküller Cutventrikül basınç size perfüzeye tek hücreleri görmek mümkün olduğunda önemli ölçüde düşmesi veya başladığında transfer tampon (A) (Tablo 2) dolu. Bu genellikle ~ 7-10 dakika sürer.
12. Yine (Şekil 1C) mikro diseksiyon forseps kullanarak, ayırmak için küçük parçalar halinde ventrikülleri kıyma. Başarılı bir sindirim dokusunun en ayrışma üzerine amorf olmasıyla birlikte, kıyma sonra doku neredeyse hiç katı topakları bırakacaktır.
    1. Ayrıca, doku ayırmak ucu bir ~ 45 ° açıyla kesilmiş olmuştu hangi bir plastik Pasteur pipet (Şekil 4) kullanılarak in / out çözüm pipetle için. Bu modifikasyon, doku ezilir olarak pipet böylece hücrelerde kesme stresi miktarını azaltarak iç çap alanı artırmak için hizmet eder.
    2. Forseps ile doku diseksiyon önce bireysel odaları ayırmak ve ayrı ayrı atriyal, sol ventrikül veya righ ayırmak mümkündürt ventriküler hücreler.
13. Kelepçeler kullanarak küçük bir huni (Şekil 1L) için kareli örgü (Şekil 1M) Güvenli ve bir 15ml Falcon tüp (Şekil 1i) içine bu filtreleme cihazı yerleştirin.
14. Çanak hücre çözümü kaldırmak ve Falcon tüpüne çözelti filtre değiştirilmiş Pasteur pipet kullanın.
15. (Canlı hücre sedimantasyon 2-4 dakika sürer) canlı hücrelerin tüp dibe çökmesine izin verin.
16. 4 ayrı 15 ml Falcon tüpleri içine dört kalsiyum çözeltiler (Tablo 3) her birinin kısım 2.5 ml.
17. Yine, standart bir Pasteur pipeti kullanılarak, dikkatli bir şekilde borunun altından hücre pelletini kaldırmak ve kalsiyum çözeltiler ilk hücreleri aktarın.
18. Hücreler son çözelti haline gelene kadar hücreler tüp dibe ve sonraki kalsiyum Çözeltilerin adımı 1.17 tekrar izin verin.
19. Hücreler FOURT yerleşmek izin vermeyinh kalsiyum çözeltisi. Tüp kap ve yan çevirin.

2. Hücre Kültürü

1. Izolasyon, levha 1 ug / ml fare doğal cam kapak slipleri üzerine laminin ve 37 ° C'de en az 1 saat boyunca inkübe edilir ve% 2 _CO2 önce. Ayrıca, kaplama ve kültür ortamı (Tablo 4), 37 ° C'de inkübatör içinde sıcak ve% 2 _CO2 izin verir. Bu ortam içerisinde çözünmüş _CO2 dengelenmeye olanak vermektedir.
   1. Medyadan üst çıkarmayın. Basitçe kontaminasyonu önlemek için üst gevşetin.
2. Izole edilmiş hücreler Falcon tüpün altındaki pelet izin verin.
3. Ortam kaplama en uygun miktarda bir standart plastik Pasteur pipet kullanılarak ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
4. Uygun boyutlu bir yemek laminin kaplanmış lamelleri hücreleri Plate ve 37 ° C de inkübe edilir ve% 2, en az 30-60 dakika boyunca _CO2 hücreler lamelleri uymak için izin vermek.
5. ** Adenovirüs ile transfekte ise, kaplama ortamın uygun bir miktarda virüs sulandırmak ve virüs ihtiva eden ortam ile tabak içinde kaplama ortamı değiştirin. Virüs, 37 ° C 2 saat ve% 2 _CO2 için hücreler üzerinde inkübe olsun. **
6. Çanak kaplama ortamı çıkarın ve kültür ortamı ile değiştirin.
7. Lamelleri hücrelerin rahatsız etmeyecek şekilde dikkatlice her gün kültür ortamı değiştirin.

Bu prosedür kullanılarak, hücreler, başarılı bir şekilde 72 saat boyunca kültürlenmiştir. Transfekte edilmiş kültürlenmiş hücreler ve GFP görüntüleri, Şekil 5'te bulunabilir.

3. MMSYS Sistemi

1. Ark lambası ilk başlatıldığı sağlamak MMSYS sistemini güçlendirin.
2. Pompadan MMSYS odasının uygun giriş ve çıkışları (Şekil 6) için tüpler bağlayın.
3. Prime kalsiyum tampon maddesi (B) ile, sistem (Tablo 2).
4. Bir yak yerleştirinodasına ve vidalarını sıkın (Şekil 6E) içine opriately ölçekli cam lamel. En MMSYS odaları 22 mm veya 25 mm kare lamelleri kullanabilirsiniz. Lütfen odası için uygun lamel belirlemek için MMSYS kullanım kılavuzuna başvurun.
5. Küçük bir Eppendorf tüpüne, hücre çözeltisinin 500 ul aktarın.
6. Hücrelerin küçük tüpe 0.5 ul Fura2-AM (1 ug / ul stok çözeltisi) ekleyin ve bunları 5-7 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verir. Bu Fura2-AM hücre zarı boyunca hızlı pasif difüzyon yoluyla hücre içine "yük" olanak sağlar.
   1. Fura-2 yüklü hücreler, tüpün dibine pelet olsun ve kalsiyum tamponu B, 500 ul ile aşırı yıkama Fura
7. Oda ışıkları kapatın.
8. Standart bir Pasteur pipeti kullanılarak, bölmenin (Şekil 6C) merkezine "yüklü" hücre çözeltisinin (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak) 1-2 damla damla ve hücreler, t izino 5 dakika boyunca lamel üzerine yerleşmek.
   1. Oda içindeki hücre yoğunluğu, bir örtüşmeyen hücreler kolayca MMSYS veri toplama platformunda izlenebilir şekilde olmalıdır.
9. Dikkatlice bölmesi boyunca kalsiyum tamponu (B) akmaya başlar.
10. 37 ° C oda sıcaklığı artırmak
    1. ÖNEMLİ: akış başlatılmıştır kadar ısıtma cihazları açmayın. Bu ciddi geribildirim thermocoupler (Şekil 6A) zarar verebilir.
11. Bağlantı telleri (Şekil 6B) üzerinden odası MyoPacer bağlı olduğundan emin olun ve 1.5x hücreler için pacing eşiği de hücreleri 5 Hz hızlanmaya başlar.
12. Doğru frekansta yenerek bir hücreyi seçin ve çerçeveleme boşluğuna taşıyın.
13. Tüm hücre yatay olarak yönlendirilmiş, pencerenin merkezinde böylece sarkomerlerin ap ile, kamera ve çerçeveleme açıklık ölçüleri ayarlayınebeveyn.
    1. Hücre uzunluğu için hücrenin kenarına (sağ ve sol) fotodiyot göstergeleri kırmızı ve yeşil ayarlayın. Hücrenin kenarlarında beyaz / siyah kontrast optimize etmek için kontrastı ayarlayın. Daha fazla ayrıntı için Ionoptix kılavuzuna başvurun.
14. Iyi tanımlanmış sarkomerlerin ihtiva eden hücrenin bir alanda Kutuyu ve güç spektrumu (kırmızı) ve tepe optimize etmek için odak ayarlayın. Ayrıca mavi yumuşatma pencere ve siyah kontrast bilgilerini optimize etmek için mikroskop parlaklığını ayarlayın.
15. Kırmızı güç spektrumu (tepe noktası) ve mümkün olan en az arka planın kadar yakalamak için yeşil eşik çubukları ayarlayın.
16. Kayda başlamak.
17. Yeterli veri kaydedildikten sonra, geçici kaydı durdurmak için "Pause" a tıklayın ve izleme penceresinin odak ne boyutları ne değişmiş olmasını sağlamak, hiçbir hücre veya hücresel materyal olabilir hangi lamel bir alana mikroskop sahne taşımak görüldü. Lenkayıt gth araştırmacının deney protokolüne bağlı olarak değişir.
    1. Not: "Dur" tıklandığında Kaydı sonlandırmak ve hiçbir arka plan o hücre için kayıtlı olmak mümkün olacak.
18. Bir arka plan ölçüm kaydetmek için "Devam" düğmesine tıklayın.
19. Yeterli arka plan Kaydı sonlandırmak için "Durdur" butonuna tıklayınız kaydedildikten sonra.
20. Tek bir. ZPT dosyasında bu hücre için tüm izlerini kaydetmek için "Dosya >> Kaydet" i tıklayın.
21. Yeterli hücre kaydedildi kadar 3.20 - 3.12 tekrarlayın adımları.
22. Kaydedilen verilerin analizi ile ilgili talimatlar için IonOptix-MMSYS Kullanım Kılavuzu 12 danışın. Vahşi tip kardiyomiyositlerin karakteristik kaydedilen veriler, Şekil 7'de gösterilmiştir.

4. Patch Kelepçe

Farklı hücre tipleri Patch sıkıştırma de bu dergide ^25-28 daha önce tarif edilmiştir. Bu nedenle bazı eleştirmen odaklanmakyetişkin kardiyomiyositlerin başarılı yama sıkma için al parametreler bizim protokol tarif kullanılarak izole edilmiştir.

1. Bir pipet çektirmenin ve borosilikat cam (filamanla: OD 1,5 mm, ID 0.86 mm - 10 cm uzunluğunda) kullanarak pipet çözüm (Tablo 5) ile doldurulduğunda ~ 2.0-3.0 MQ sergileyen bir pipet çekin.
2. Yangın lehçe hafifçe Narishige veya diğer düşey yangın parlatıcı kullanarak pipet ucu. Yama pipet direnci alev parlatma sonra 2-4 MO olmalıdır.
3. Bilgisayara, amplifikatör (Axopatch 200B), AD çevirici (Digidata 1440A, Axon Instruments) ve Mikromanipülatör (MP-285) açın. Tam hücre yama kenetleme için, daha önce tarif edildiği gibi standart parametreler ile başlar.
4. Kültürlü yetişkin CMS için, inkübatör bunları kaldırmak ve yavaşça CMs oda sıcaklığında PBS ile kaplanmıştır hangi lamel yıkayın.
5. Yavaşça lamel kaldırmak ve ters mikroskop (Nikon TE 2 perfüzyon odasında yerleştirin000).
   1. (Emme) perfüzyon sistemine ve çıkış için giriş sadece lamel yüzeyi üzerinde olduğundan emin olun.
6. Uygun hücre dışı çözeltisi (Tablo 5) ile perfüze başlayın.
7. Taze ayrışmış yetişkin CMS için, yukarıdaki gibi perfüzyon sisteminde bir kollajen kaplı lamel yerleştirin.
   1. Hücreleri, sıvı içerisinde olacağından, yavaşça hücre tamponu ile çözüm değiştirin.
8. Modifiye Pasteur pipet (Şekil 4) kullanılarak, yavaşça, hücre dışı tampon hücreleri tekrar süspansiyon bir kısım almak ve lamel üzerine yerleştirin.
9. Hücrelerin 4.4 olarak perfüzyon başlamadan önce 10-15 dakika boyunca birleşmeye izin verin.
10. Geri dolgu bir Microfil (Dünya Hassas Aletler, 28 G) iğne kullanılarak hücre içi tampon ile tüm hücre yama pipet. Hava kabarcığı pipet ucu vardır emin olun, hafifçe hava kabarcıkları $ tirilmi $ yüzey için yüzmesine izin dokununÇözeltinin ce.
11. Mikroelektrot ve iç çözümü arasında temas sağlamak, pipet-tutucuya dolu yama pipet takın.
    1. Biz gümüş klorür elektrotları kullanır, ancak çamaşır suyu gecede daldırarak gümüş teller en az haftada bir kez 'klorid edilmesine' ilgileneceğim.
12. Yavaşça banyo elektrot banyo / hücre dışı çözelti içinde her zaman batırılır sağlamak, banyo içine pipet indirin. Şu anda herhangi bir sıvı değme potansiyelleri ofset. Büyük kavşak potansiyeller elektrotlar üzerinde gümüş klorür bozulan bir belirtisi olabilir.
13. Sağlıklı silindirik yetişkin CMs mikroskop tespit ve görüş alanında ortalanır. Daha önce tarif edildiği gibi, mikromanipülatör hareket eden ve odak ayarlama bir arada yakın bir yama pipet yakınlık ve CM yüzeyi sağlar.
    1. Onlar aynı odak düzlemi kere, biz görsel bir arada kullanınhücre ve (Axopatch 200B mevcut) test darbesinin zasyon.
    2. Pipet direnci (pipet hücrenin yüzeyi ile temas halinde olduğunu düşündüren) ve hücre silindirik bakmaya devam yarısında azalır sonra, hafif bir emme kullanılarak gigaohm sızdırmazlık tesis.
    3. CMS için, negatif baskı kurmak için ağız emme tercih. Bir gigaseal başarıyla elde edilirse, biz yine bütün hücre yama modunu kurmak için hücreye 'break-in' nazik ritmik ağız emme kullanmak.
14. Sağlıklı CMS Tipik istirahat potansiyelleri -85 -90 mV sıralanmıştır. Bir gigaseal elde edildikten sonra, I = 0 Pa şimdiki kelepçe kullanarak istirahat membran potansiyelini ölçmek.
    1. Dinlenme membran potansiyeli depolarize olması durumunda bu, bozuk bir hücre ya da bir zayıf mühür gösterebilir.
15. CMs yüzey alanının çok büyük hücreler olduğundan, dikkatli dikkat özellikle w, tazminat kapasitans için ödenmesi gerekiyorörneğin, sodyum kanalı olarak tavuk hızlı bir şekilde aktif hale akımları üzerinde çalışılacak gerekmektedir. Yeterli kapasite tazminat kullanılarak elde edilemezse çarkı üzerindeki tazminat ayarları yerleşik, alt eşik geriliminde prepulses ve zıt kutuplu uygulanmış ve kaydedilen sinyal çıkarılır çıkan cari gerekebilir. Böyle bir protokol kolayca Axopatch programlanmıştır.
16. Tam hücre yama modu bir kez kurulduktan sonra, dengeyi sağlamak için 15 dakika beklemek ve önceki başlangıç ​​voltaj ya da akım kelepçe protokolleri için, contanın istikrarı sağlamak için. Bu daha önce tarif edilmiştir, standart protokoller ve diğer dergi kullanımı ve bir değerlendirmeye olmayacaktır.

Sonuçlar

Çubuk şeklinde, çizgili ve (kendiliğinden dayak değil) hareketsiz hücrelerde (Şekil 5A) yetişkin cardiomyoctyes sonuçlarının izolasyonu. Ölü hücreleri yuvarlak bakmak ve hiçbir çizikleri mevcut olacaktır. Hareketsiz hücreler kültürlendi ve gen ekspresyonu (Şekil 5B ve 5C) işlemek için adenovirüs ile transfekte edilmiş olabilir. Kültür 24 saat, canlı hücrelerin morfolojisi değişmez sonra hala ^{Ca2 +-toleranslı} ve bunlar saha uyar...

Tartışmalar

Bu yazıda, fare kalp başarılı izolasyonu ve yetişkin CMS kültürü için gerekli teknikleri tarif var. Bizim teknik, yukarıda tarif edilen metotlar kullanılarak CM fonksiyon uyarılma ve daha sonra çalışma için izin verir. Yetişkin CMS işlevselliğini eğitim için kritik parametre izole CMS sağlık ve kalitesidir. Yukarıda tarif edildiği gibi, teknik adenoviral / lentiviral kültüründe enfeksiyonları ve hücresel uyarılımın ve kontraktil fonksiyon analizi kullanılarak gen ekspresyonunun manipül...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5", 1x2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps - 4.5" (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5" Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5" Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907