JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ناقلات فيروسية تسمح للتلاعب الجيني المستهدفة. ونحن يبرهن على وجود طريقة للتعبير الجين المشروط أو الاجتثاث في الحبل الشوكي الماوس، وذلك باستخدام حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري، وهو موقع بارز للاتصال متشابك بين الحسية الجسدية الأولية afferents والخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

Abstract

حقن Intraparenchymal من ناقلات فيروسية يمكن التلاعب الجيني في المشروطة السكان متميزة من الخلايا العصبية أو مناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي. ونحن يبرهن على وجود تقنية الحقن التجسيمي الذي يسمح استهدفت التعبير الجيني أو إسكات في القرن الظهري في النخاع الشوكي الماوس. الإجراء الجراحي هو وجيزة. أنه يتطلب استئصال الصفيحة الفقرية لفقرة واحدة، تنص على الانتعاش السريع للحيوان والحركة دون عوائق من العمود الفقري. حقن تسيطر عليها وحدة تخزين صغيرة ناقلات التعليق على سرعة منخفضة واستخدام محقنة مكروية مع قنية الزجاج مشطوف تقليل الآفة الأنسجة. الاستجابة المناعية المحلية لمكافحة ناقلات يعتمد على الخصائص الذاتية للفيروس المستخدمة؛ في تجربتنا، فمن قاصر وقصير الأجل عند استخدام المؤتلف الفيروس المرتبط بالفيروس الغدي. A الجين مراسل مثل البروتين المعززة الفلورية الخضراء يسهل توزيع الرصد المكاني للناقلات، وفعالية وSPECI الخلويةficity من ترنسفكأيشن.

Introduction

التكنولوجيات المتقدمة من التلاعب الجيني الشرطية في الماوس تمكين نهج متعدد الأوجه لاستكشاف مسارات وظيفية واتصالات متشابك في الجهاز العصبي المركزي. يمكن تنظيمها من قبل جينات منقولة الصغيرة جزيء المستجيبات مثل الدوكسيسيكلين بناء على transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها، والتي يمكن أن تكون مصممة لتكون بمثابة المنشط أو قامع من النسخ الجيني، أو عقار تاموكسيفين الاعتراف تحور يجند ملزم المجال من مستقبلات هرمون الاستروجين 1 . ويتحقق عادة لا رجعة فيه تعديل التحوير من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) recombinases. لجنة المساواة العرقية (أسباب إعادة التركيب) وFLP (flippase إنزيم إعادة التركيب) حفز الختان، أو انعكاس إزفاء من شظايا الحمض النووي التي يحيط بها loxP (بؤرة X معبر أكثر، P1) أو FRT (flippase هدف الاعتراف) مواقع على التوالي 1. وتشمل التطبيقات تفعيل الجينات أو إسكات وحمض النووي الريبي محرض (RNA) تدخل > 2. ويمكن استخدام تعبير شرطي من الصحفيين الفلورسنت أو الأنزيمية مثل غالاكتوزيداز β-الفوسفاتيز القلوية أو لتسمية الخلايا العصبية ودراسة منظمتهم الموضعية والاتصال 3. مشاريع الطفرات واسعة النطاق في أمريكا الشمالية ( http://www.norcomm.org/index.htm ) وأوروبا ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) على انتاج مكتبات الجنينية الماوس استنساخ الخلايا الجذعية مع أهداف الجينات المشروطة والفخاخ التي سوف تغطي في نهاية المطاف جينوم الفأر بأكمله. قد عبرت الفئران المولدة من هذه الحيوانات المستنسخة مع عدد من خطوط توسيع الماوس التي تعبر عن recombinases DNA تحت المروجين أو مواضع معينة للسكان خاصة من الخلايا العصبية للتلاعب الجيني انتقائية ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP ).

= "jove_content"> ومع ذلك، قد تقيد التلاعب الجيني للسكان متميزة من الخلايا العصبية أو مناطق معينة ذات أهمية لا يمكن أن يتحقق عن طريق الوراثية وحدها التي تستهدف إذا لم يعلم أحد المروجين محددة للسكان الخلايا العصبية في المصالح أو لا عبرت عنها جميع الخلايا العصبية في المنطقة من الفائدة. في الحبل الشوكي، قد تتطلب تقييد التصاميم التجريبية المكاني للتلاعب الجيني إلى واحد أو جزأين رأسي ذنبي. حقن التجسيمي من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية أو FLP يسمح الحد إعادة التركيب الجيني لمناطق في الحبل الشوكي للفئران التي يتم يحيط شظايا الحمض النووي عن طريق loxP أو مواقع FRT، ما يسمى الأليلات floxed أو flrted. على عكس إعادة ترتيب DNA التأسيسي، الذي من شأنه أن يؤدي من التهجين للحيوانات مع الفئران معربا عن recombinase، فإن هذه الاستراتيجية توفر أيضا السيطرة الزمنية على تفعيل الجينات أو إسكات. floxed ناقلات فيروسية أو ترميز الجينات المحورة تعاملت تقديم خيار عكس التلاعب الجيني في الفئران التعبير عن corresponding المصب recombinase من المروج الخلايا العصبية الخاصة. ناقلات المؤتلف مع تقارب عدة لالخلايا العصبية متاحة 4. ويشيع استخدام ذات قدرة عالية (جبان) اتش، فيروس الغدة المرتبطة بها، وفيروس الهربس البسيط الفيروسة البطيئة ناقلات الموجهات العصبية. اختيار الفيروس مناسبة لسؤال البحث هو جزء حاسم من التصميم التجريبي. حجم التحوير، طرق التوصيل، خصوصية العدوى إلى الخلايا العصبية بدلا من الخلايا الدبقية، فعالية العدوى، والآثار الجانبية السامة والتهابات تحتاج إلى النظر فيها 4.

نحن هنا وصف حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري في النخاع الشوكي، وهي تقنية التي نستخدمها لتنظيم الجينات الشرطية في أبحاثنا على بيولوجيا الأعصاب من الألم. القرن الظهري يتلقى مساهمات من الخلايا العصبية الحسية الجسدية وارد الأولية بما في ذلك الخلايا العصبية nociceptive. interneurons المحلية معالجة المعلومات قبل الخلايا العصبية الإسقاط من يجاريهاالقرن الظهري إلى الدماغ 5. علينا أن نبرهن إصابة الخلايا العصبية القرن الظهري في النخاع المستوى القطاعي L4 مع فيروس الغدة المرتبطة المؤتلف الموجهات العصبية (rAAV) التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء تعزيز (EGFP) تحت المروج الفيروس المضخم للخلايا النشطة جوهري.

Protocol

تمت الموافقة على إجراء العمليات الجراحية التي وصفها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) من جامعة كولومبيا.

1. إعداد المعدات والفيروسات تعليق الجسيمات

  1. تنظيف وتطهير المعدات وتعقيم الأدوات الجراحية وارتفاع درجة V التي سيتم استخدامها لإصلاح فقرة L1.
  2. سحب وماصات زجاجية شطبة. نستخدم ماصات التي يبلغ قطرها 40 ميكرون من طرف ومشطوف بزاوية 20 درجة. تعقيم ماصات زجاجية.
  3. إعداد الإطار التجسيمي، تحميل حاقن محقنة مكروية على أن تتلاعب وتوصيل حاقن إلى وحدة تحكم.
  4. إرفاق واحدة من ماصات زجاجية إلى محقنة مكروية استخدام عدة المناسب الضغط.
  5. إزالة المكبس من محقنة مكروية وملء المحاقن مع الزيوت المعدنية. ويمكن إضافة - ((2،5 ثنائي ميثيل-4-(2،5-dimethylphenylazo) phenylazo)-2-نفثول 1) إلى الزيوت المعدنية لزيادة الخامس من النفط O الأحمرisibility. معاودة الغطاس ودفعها إلى كل الطريق إلى الحافة. تجنب بعناية خلق فقاعة الهواء.
  6. إعداد التعليق جسيمات الفيروس في خزانة السلامة الأحيائية. ذوبان الجليد الفيروس المجمدة على الجليد، وفقط قبل الاستخدام، مع تخفيف العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة إلى تركيز الجسيمات المطلوب.
  7. إدراج محقنة مكروية في ماسك على حاقن.
  8. ماصة 5 ميكرولتر من التعليق الفيروس على ورقة بلاستيكية صغيرة، على سبيل المثال Parafilm. خفض غيض ماصة الزجاج في انخفاض وسحب الغواص لملء محقنة مكروية. خلق فقاعة الهواء الصغيرة في الطرف ماصة لمنعه من انسداد.

2. الثقب

  1. اعداد منطقة الجراحة من قبل القضاء وسادة التدفئة مقاعد البدلاء مع مطهر.
  2. تخدير الماوس. نستخدم التخدير استنشاق isoflurane مع (3٪ خلال الاستقراء، -3٪ 2٪ خلال الصيانة).
  3. وضع مواد التشحيم على كل عين لحماية العينين من الجفاف خلالالعملية.
  4. حلق الفراء من أسفل الظهر إلى الرقبة من الفأرة وتطهير الجلد بالتناوب مع مناديل من مطهر موضعي مثل الكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود والايثانول 70٪. عزل الموقع أعد جو معقم و مطهر مع ثنى الجراحية والتسلل الى موقع شق مع بوبيفاكايين (0.25٪، 1:10 المخفف مع المالحة الفسيولوجية).
  5. شق الجلد في نهاية الذيلية من القفص الصدري على طول خط الوسط (2-3 سم) وفصل اللفافة التي تغطي العمود الفقري.
  6. لأن الحبل الشوكي يتوقف عن النمو في وقت سابق خلال التنمية ما بعد الولادة من العمود الفقري، العمود الفقري الجزء L4 تقع تحت الفقرة القطنية الأولى (L1). يقع فقرة L1 الذيلية للفقرة التي تحمل الزوج الأخير من أضلاعه. تحديد وفضح L1 فقرة عن طريق إزالة العضلات والأربطة في العمود الفقري الصغيرة الملحقة سطحه الظهري.
  7. رفع قليلا وعقد L1 فقرة مع ملقط أدسون. استخدام ملقط الثقب مخصصة لإزالة العصب الظهرين من فقرة (العمود الفقري والصفيحة) وفضح الحبل الشوكي. تجنب إتلاف الحبل الشوكي.
  8. نقل الماوس على لوحة التسخين في إطار التجسيمي. رصد درجة حرارة الماوس أثناء العملية اللاحقة.

3. حقن

  1. إصلاح فقرة L1 مع ارتفاع درجة V. يجب على المسامير تثبيت العمود الفقري بحيث لا ينتقل فقرة أثناء التنفس.
  2. جعل محقنة مكروية أقرب بحيث غيض ماصة فوق موقع الثقب. خفض المكبس حتى ترى التعليق الخروج من فيروس ماصة. إزالة قطيرة مع طرف القطن المعقم.
  3. ضع رأس ماصة في جزء منقاري الأكثر من الحبل الشوكي المكشوفة. مركز ماصة أعلاه تلم الوسيط الخلفي، ثم نقل معلومات سرية 500 ميكرومتر أفقيا. تلميح لخفض السطح من الحبل وثقب الأم الجافية، أو إذا كنت تعمل مع ماصة الزجاج unbeveled، استخدم قنية الصلب مشطوف لثقب دأورا. خفض غيض من ماصة 300 ميكرومتر الزجاج في الحبل الشوكي.
  4. حقن 1 ميكرولتر من التعليق الفيروس بمعدل من 200 NL / دقيقة.
  5. في نهاية الحقنة، انتظر على الأقل 2 دقيقة قبل التراجع ببطء ماصة.
  6. كرر الخطوات 3،3 حتي 3،5 في الجزء الأكثر الذيلية من الحبل الشوكي يتعرض لتحقيق توزيع كامل للناقلات فيروسية في L4 الجزء الشوكي. توجد مواقع الحقن 2 منقاري والذيلية للجزء L4 لتجنب تلف الأنسجة في المنطقة المستهدفة.

4. اختتام الجرح

  1. الإفراج فقرة من L1 المشابك الدرجة V وإزالة الماوس من الإطار التجسيمي.
  2. خياطة لفافة مع vicryl 5.0. فآسيا مغلق يوفر غطاء لموقع الثقب.
  3. إغلاق الجلد مع خيوط النايلون أو الدبابيس الجراحية.

5. بعد العملية الجراحية العناية

  1. نقل الماوس لقفص الانتعاش مع الفراش، لينة nonparticular. وضعه على رانه الجانب للتنفس مريح. رصد الحيوان حتى يتم تنبيه بشكل كامل، ويبدأ حركيا الشرب.
  2. نحن نقدم تسكين بعد الجراحة لمدة 72 ساعة يوميا مع حقنة تحت الجلد من كاربروفين (5.0 ملغ / كلغ).
  3. رصد الانتعاش بعد الجراحة عن طريق التفتيش يوميا لمدة 3 أيام الأولى، ثم مرة كل يومين أو 3 أيام في الأسبوع حتى اكتمال التجربة.
  4. إزالة الخيوط الجراحية أو المواد الغذائية الجلد 7 إلى 10 أيام بعد العملية، عندما التئام الجروح كاملة.
  5. الموت ببطء الحيوان بعد الانتهاء من التجربة.

النتائج

غلة ترنسفكأيشن ناجحة قوية التعبير الجيني في الخلايا العصبية من القرن الظهري للحقن (الشكل 1)، يجنب القرن الظهري من الجانب المقابل، والقرن البطني والعقد الجذرية الظهرية.

figure-results-319
الشك?...

Discussion

التجسيمي حقن الخلايا العصبية التي تستهدف ناقلات يسمح الحبل الشوكي لتطبيقات مثل رسم خرائط شبكة الخلايا العصبية على أساس الفيروس عبر التشابك نشر أو 6،7 optogenetic تشريح 8، التوجيه محور عصبي خلال التجديد من الاصابة 9،10، أو العلاج الجيني لمنع أو علاج تنكس عص...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

Acknowledgements

نشكر باخوس طنوس A.، دكتوراه، مدير تطوير وإنتاج النواقل في مركز العلوم العصبية من مستشفى ماساتشوستس العام، تشالزتاون، ماساتشوستس، لتزويدنا ناقلات rAAV-EGFP، والعضو الذكري جون للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل منحة R01 NS050408 (لJS) من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم المادة شركة كتالوج رقم
قاعدة العمود الفقري لوحة ديفيد KOPF الصكوك 912
أداة صغيرة الحيوان التجسيمي ديفيد KOPF الصكوك 900
الماوس رئيس التخدير الغاز حامل ديفيد KOPF الصكوك 923-B
يتصاعد قاعدة قابل للتعديل ديفيد KOPF الصكوك 982
V ارتفاع درجة ديفيد KOPF الصكوك 987
صغيرة التحكم في درجة الحرارة الحيوانية النظام ديفيد KOPF الصكوك TCAT-2LV
أدسون ملقط أدوات العلوم الجميلة 11006-12
الثقب ملقط أدوات العلوم الجميلة 11223-20
UltraMicroPump (واحد) مع SYS-Micro4 المراقب أدوات الدقة العالم UMP3-1
محقنة مكروية، 65RN هاميلتون 7633-01
RN ضغط المناسب، 1 ملم هاميلتون 55750-01
البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية أدوات الدقة العالم 1B100F-4
Microgrinder Narishige EG-44

References

  1. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
  2. Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
  3. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
  4. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
  5. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
  6. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
  7. Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
  8. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
  9. Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
  10. Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
  11. Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
  12. Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
  13. Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
  14. South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
  15. Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
  16. Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
  17. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
  18. Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
  19. Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
  20. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73 GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved