Injection stéréotaxique d'un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Résumé

Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.

Résumé

Injection intra-parenchymateux d'un vecteur viral permet la manipulation génétique conditionnel populations distinctes de neurones ou des régions particulières du système nerveux central. Nous démontrons une technique d'injection stéréotaxique qui permet l'expression du gène ciblé ou le silence dans la corne dorsale de la moelle épinière de souris. L'intervention chirurgicale est de courte durée. Il nécessite laminectomie d'une vertèbre unique, offrant pour la récupération rapide de l'animal et de la motilité intacte de la colonne vertébrale. Injection contrôlée d'un volume de suspension petit vecteur à faible vitesse et à l'utilisation d'une micro-canule avec verre biseauté minimiser la lésion tissulaire. La réponse immunitaire locale au vecteur dépend des propriétés intrinsèques du virus utilisé, dans notre expérience, il est mineure et de courte durée quand une adéno-associé recombinant virus est utilisé. Un gène rapporteur tel que le renforcement de la protéine fluorescente verte facilite la distribution spatiale de surveillance du vecteur, et l'efficacité et cellulaire spécificité de la transfection.

Introduction

Les technologies de pointe de la manipulation génétique conditionnelle chez la souris permettent des approches multidimensionnelles à l'exploration des voies synaptiques et les connexions fonctionnelles dans le système nerveux central. Transgènes peut être régulée par petites molécules effectrices telles que la doxycycline agissant sur ​​un transactivateur de tétracycline contrôlée, qui peut être conçu pour fonctionner comme un répresseur ou un activateur de la transcription du gène, ou le tamoxifène reconnaître une mutation de domaine de liaison au ligand du récepteur oestrogène ¹ . Modification irréversible transgène est généralement obtenue par l'acide désoxyribonucléique (ADN) recombinases. Cre (recombinaison causes) et Flp (enzyme de recombinaison flippase) catalyser l'excision, inversion ou translocation de fragments d'ADN qui sont flanquées par loxP (lieu de passage sur x, P1) ou Frt (cible de reconnaissance flippase) sites, respectivement ^1. Les applications incluent l'activation de gènes ou le silence et l'acide inductible ribonucléique (ARN) des interférences ^{2. Expression conditionnelle de reporters fluorescents ou enzymatiques tels que β-galactosidase ou la phosphatase alcaline peut être utilisée pour étiqueter les neurones et d'examiner leur organisation locale et la connectivité 3. Projets de mutagenèse à grande échelle en Amérique du Nord ( http://www.norcomm.org/index.htm ) et en Europe ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produisent des bibliothèques de clones embryonnaires de souris de cellules souches avec gènes cibles conditionnelles et les pièges qui finira par couvrir l'ensemble du génome de la souris. Les souris issues de ces clones peuvent être croisés avec un nombre croissant de lignées de souris qui expriment recombinases ADN dans des promoteurs ou des loci spécifiques à une population particulière de neurones pour la manipulation génétique sélective ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).}

Cependant, restreindre la manipulation génétique de populations distinctes de neurones ou des régions particulières d'intérêt ne peut pas être atteint par ciblage génétique seul si un promoteur spécifique à la population de neurones d'intérêt n'est pas connu ou ne s'exprime pas par tous les neurones de la région d'intérêt. Dans la moelle épinière, des modèles expérimentaux peuvent nécessiter restriction spatiale de la manipulation génétique d'une ou deux segments craniocaudale. Injection stéréotaxique d'un vecteur viral exprimant Cre ou FLP permet de limiter la recombinaison de gènes de régions dans la moelle épinière de souris dans lequel les fragments d'ADN flanqués de sites FRT ou loxP, que l'on appelle allèles floxé ou flrted. Contrairement réarrangement de l'ADN constitutive, qui résulterait de croisements avec des animaux recombinase souris exprimant, cette stratégie permet également de contrôler temporelle sur l'activation de gènes ou le silence. Les vecteurs viraux codant pour floxé ou flirté transgènes offrir une option inverse de la manipulation génétique chez les souris exprimant le corresponding en aval d'un promoteur recombinase spécifique des neurones. Plusieurs vecteurs recombinants ayant une affinité pour les neurones sont disponibles ^4. Haute capacité (lâche) adénovirus, virus adéno-associé, l'herpès simplex virus et lentivirus sont couramment utilisés vecteurs neurotropes. Sélection du virus approprié pour une question de recherche est un élément essentiel de la conception expérimentale. Taille du transgène, l'itinéraire de livraison, la spécificité de l'infection des neurones par opposition aux cellules gliales, l'efficacité, l'infection effets secondaires inflammatoires et toxiques doivent être considérées ^4.

Nous décrivons ici l'injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale de la moelle épinière, une technique que nous employons pour la régulation des gènes avec sursis dans notre recherche sur la neurobiologie de la douleur. La corne dorsale reçoit influx afférents primaires de neurones somatosensoriels y compris les neurones nociceptifs. Interneurones locaux traiter l'information avant de la transmettre neurones de projection dela corne dorsale du cerveau ^5. On démontre l'infection des neurones de la corne dorsale de la colonne vertébrale segmentaire niveau L4 avec un neurotrope recombinant virus adéno-associé (rAAV) qui exprime la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous un promoteur du cytomégalovirus constitutivement actif.

Protocole

La procédure chirurgicale décrite a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) de l'Université de Columbia.

1. Préparation de l'équipement et de la suspension de particules de virus

1. Nettoyer et désinfecter le matériel, stériliser les instruments chirurgicaux et les pointes entaille en V qui seront utilisés pour fixer L1 vertèbre.
2. Tirez et pipettes en verre coniques. Nous utilisons des pipettes qui ont un diamètre de pointe de 40 um et sont biseautés à un angle de 20 °. Stériliser les pipettes en verre.
3. Mettre en place le cadre stéréotaxique, monter l'injecteur microseringue sur le manipulateur et de connecter l'injecteur au dispositif de commande.
4. Fixez l'un des pipettes en verre à l'aide de la microseringue kit raccord à compression.
5. Retirer le piston de la microseringue et remplissez la seringue avec de l'huile minérale. Oil Red O (1 - (2,5-diméthyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) phénylazo)-2-naphtol) peut être ajouté à l'huile minérale pour augmenter sa visibility. Réinsérez le piston et le pousser à tout le chemin à la pointe. Soigneusement éviter de créer une bulle d'air.
6. Préparer la suspension de particules de virus dans une enceinte de sécurité biologique. Décongeler le virus congelé dans la glace et, juste avant utilisation, le diluer avec de stérile saline tamponnée au phosphate à la concentration de particules souhaitée.
7. Insérez la microseringue dans le support de l'injecteur.
8. 5 ul de la suspension de virus sur une feuille de plastique faible, par exemple Parafilm. Abaissez la pointe de la pipette en verre dans la goutte et tirez sur le piston pour remplir la microseringue. Créer une petite bulle d'air à la pointe de la pipette pour l'empêcher de se boucher.

2. Laminectomie

1. Préparer le secteur de la chirurgie en essuyant banc et coussin chauffant avec un désinfectant.
2. Anesthésier la souris. Nous utilisons l'anesthésie par inhalation avec l'isoflurane (3% lors de l'induction, 2% -3% lors de l'entretien).
3. Placez lubrifiant sur chaque œil afin de protéger les yeux de séchage pendant lafonctionnement.
4. Raser les poils de la partie inférieure arrière de la nuque de la souris et désinfecter la peau avec une alternance de lingettes d'un antiseptique topique telles que la chlorhexidine ou la povidone-iode et de l'éthanol 70%. Isoler le site de manière aseptique avec champ opératoire et infiltrent le site de l'incision avec de la bupivacaïne (0,25%, 1:10 dilué avec du sérum physiologique).
5. Inciser la peau à l'extrémité caudale de la cage thoracique le long de la ligne médiane (2-3 cm) et séparer le fascia recouvrant la colonne vertébrale.
6. Parce que la moelle épinière arrête de pousser plus tôt au cours du développement postnatal de la colonne vertébrale, segment vertébral L4 se trouve sous la première vertèbre lombaire (L1). Vertèbre L1 est situé en aval de la vertèbre qui contient la dernière paire de nervures. Identifier et dénoncer L1 vertèbre en enlevant les petits muscles spinaux et les ligaments attachés à sa surface dorsale.
7. Soulevez légèrement et maintenez L1 vertèbre avec une pince Adson. Utilisez une pince à laminectomie dédiés pour enlever la dorsale portion de la vertèbre (colonne vertébrale et de la lame) et exposer la moelle épinière. Éviter d'endommager la moelle épinière.
8. Transfert de la souris sur la plaque chauffante dans le cadre stéréotaxique. Surveiller la température de la souris pendant l'opération ultérieure.

3. Injection

1. Fixer vertèbre L1 avec des pointes entaille en V. Les pointes doivent stabiliser la colonne vertébrale de sorte que la vertèbre ne se déplace pas pendant la respiration.
2. Apportez de la microseringue de plus près afin que la pointe de la pipette est au-dessus du site de laminectomie. Abaissez le piston jusqu'à ce que vous voyez la suspension de virus sortant de la pipette. Retirer la gouttelette avec un coton-tige stérile.
3. Positionner la pointe de la pipette à la partie rostrale plus de la moelle épinière exposée. Centre de la pipette au-dessus du sillon médian postérieur, puis déplacez la pointe 500 um latéralement. Abaissez la pointe à la surface de la corde et à la perforation de la dure-mère ou, si vous travaillez avec une pipette en verre unbeveled, utiliser une canule en acier biseauté pour perforer la dura. Abaissez la pointe de la pipette en verre les 300 um dans la moelle épinière.
4. Injecter 1 ul de la suspension virale à un taux de 200 nl / min.
5. À la fin de l'injection, attendez au moins 2 minutes avant de se rétracter lentement la pipette.
6. Répéter les étapes de 3,3 à 3,5 à la partie caudale plus de la moelle épinière exposée pour obtenir une distribution complète du vecteur viral dans L4 segment rachidien. Les deux points d'injection sont situés rostrale et caudale du segment L4 pour éviter d'endommager les tissus dans la région cible.

4. Fermeture des plaies

1. Communiqué vertèbre L1 des pinces entaille en V et retirez la souris à partir du cadre stéréotaxique.
2. Suturer l'aponévrose avec 5,0 vicryl. Le fascia fermé offre une couverture pour le site de laminectomie.
3. Fermer la peau avec des sutures de nylon ou d'agrafes chirurgicales.

5. Soins postopératoires

1. Transfert de la souris dans une cage de récupération de doux, de la literie nonparticular. Placez-le sur tIl côté pour respirer à l'aise. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il soit en état d'alerte, ambulatoire et commence à boire.
2. Nous fournissons une analgésie postopératoire pendant 72 heures par jour avec des injections sous-cutanées de carprofène (5,0 mg / kg).
3. Surveiller le rétablissement post-opératoire par une inspection quotidienne pour les 3 premiers jours, puis tous les deux jours ou 3 jours par semaine jusqu'à ce que l'expérience est terminée.
4. Enlever les sutures ou des agrafes de 7 à 10 jours après l'opération, lorsque la cicatrisation est complète.
5. Euthanasier l'animal après la fin de l'expérience.

Résultats

Rendements de transfection avec succès l'expression des gènes robuste neurones de la corne dorsale injecté (figure 1), épargnant la corne dorsale du côté controlatéral, la corne ventrale et les ganglions de la racine dorsale.

Figure 1. La transfection de neurones de la corne dorsale. (A) Expression de l'EGFP rapporteur fluorescent (vert) dans la corne gauche dorsale de la ...

Discussion

Injection stéréotaxique vecteur de ciblage permet neurones de la moelle épinière pour des applications telles que la cartographie du réseau neuronal sur la base de virus d'étalement transsynaptique ^6,7 ou ⁸ optogenetic dissection, guidage axonal pendant la régénération de lésions ^9,10, la thérapie génique ou pour la prévention ou le traitement de la neurodégénérescence ^{11, 12.} Les vecteurs viraux ont été utilisés pour la manipulation génétique dans la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du produit	Entreprise	Numéro de catalogue
Plaque de base épinière	David Kopf Instruments	912
Petit instrument stéréotaxique animaux	David Kopf Instruments	900
Gaz souris de tête anesthésie titulaire	David Kopf Instruments	923-B
Supports de base ajustables	David Kopf Instruments	982
V notch pointes	David Kopf Instruments	987
Petit système de contrôle de la température des animaux	David Kopf Instruments	TCAT-2LV
Adson pince	Outils Fine Science	11006-12
Pince laminectomie	Outils Fine Science	11223-20
UltraMicroPump (un) par SYS-MICRO4 contrôleur	World Precision Instruments	UMP3-1
Microseringue 65RN	Hamilton	7633-01
Raccord à compression RN, 1 mm	Hamilton	55750-01
Verre borosilicate capillaires	World Precision Instruments	1B100F-4
Microgrinder	Narishige	EG-44