Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Резюме

Вирусные векторы позволяют целевой манипуляции генов. Мы демонстрируем метод условное выражение гена или абляции в спинном мозге мышей, с использованием стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге, известный сайт синаптических контактов между первичной соматосенсорной афферентов и нейронов центральной нервной системы.

Аннотация

Интрапаренхимальные инъекции вирусного вектора позволяет условные манипуляции генов в различных популяциях нейронов или отдельных регионов центральной нервной системы. Мы демонстрируем стереотаксической техники инъекции, которые позволяют целевых экспрессии гена или глушителей в дорсальных рогов спинного мозга мыши. Хирургическая процедура является кратким. Это требует ламинэктомия одного позвонка, обеспечивая быстрое восстановление животного и беспрепятственный подвижность позвоночника. Контролируемое введение небольшого объема подвески вектора на низкой скорости и использованию микрошприца со скошенными канюли стекла свести к минимуму ткани поражения. Местный иммунный ответ на вектора зависит от внутренних свойств вируса занятых; по нашему опыту, это незначительный и недолговечным, когда рекомбинантный адено-связанный вирус используется. Ген-репортер, такие как усовершенствованные зеленого флуоресцентного белка облегчает контроль пространственное распределение вектора, а также эффективность и клеточных образцахficity трансфекции.

Введение

Передовые технологии условного манипуляции генов у мышей позволяют многогранного подхода к изучению синаптических путей и функциональных связей в центральной нервной системе. Трансгенов может регулироваться малые молекулы эффекторы, такие как доксициклин, действующих на тетрациклин-контролируемой трансактиватор, которые могут быть разработаны, чтобы функционировать как репрессор или активатор транскрипции генов, или тамоксифен признании мутировал лиганд-связывающий домен рецептора эстрогена ¹ . Необратимое изменение трансгенов обычно достигается путем дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) рекомбиназ. Cre (причины рекомбинации) и ФЛП (flippase рекомбинации фермент) катализирует вырезание, инверсии или транслокации фрагментов ДНК, которые в окружении loxP (локус пересечения х более, P1) или Frt (flippase распознавания целей) сайтов, соответственно ^1. Приложения включают активацию гена или глушителей и индуцируемой рибонуклеиновой кислоты (РНК) помех ^{2. Условное выражение флуоресцентной или ферментативных журналисты, такие как β-галактозидазы или щелочной фосфатазы может быть использован для обозначения нейронов и изучить их актуальность организации и подключение 3. Крупномасштабные проекты мутагенеза в Северной Америке ( http://www.norcomm.org/index.htm ) и Европы ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) производит библиотеки мышиных эмбриональных клонов стволовых клеток, с условные цели генов и ловушки, которые в конечном итоге охватить весь геном мыши. Мыши, полученные от этих клонов могут быть скрещены с расширением количества линий мышей, которые выражают ДНК рекомбиназ под промоутеров или локусы для конкретной популяции нейронов для селективной манипуляции генов ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP ).}

Тем не менее, ограничение генной манипуляции на отдельных популяций нейронов или отдельных регионов представляет интерес не может быть достигнуто путем генетического таргетинга в покое, если промоутер, специфичные для нейронов населения проценты не известны или не выражается всех нейронов в регионе интерес. В спинном мозге экспериментальных конструкций может потребоваться пространственное ограничение генной манипуляции с одним или двумя краниокаудальном сегментов. Стереотаксическая инъекции вирусного вектора, который выражает Cre или Flp позволяет ограничить рекомбинации генов в регионах в спинном мозге мышей, в которых фрагменты ДНК в окружении loxP или Frt сайтов, так называемые floxed или flrted аллелей. В отличие от учредительного перестройка ДНК, который бы в результате скрещивания животных с рекомбиназой выражения мышей, эта стратегия также предусматривает временную контроль за активацию гена или глушителей. Вирусные векторы, кодирующие floxed или флиртовал трансгенов предлагают обратный вариант гена манипуляций у мышей, экспрессирующих correspoрекомбиназой нахождении на выходе из специфичные для нейронов промотора. Несколько рекомбинантных векторов с близостью к нейроны имеются ^4. Высокая емкость (слабый), аденовирусы, адено-связанный вирус, вирус простого герпеса и лентивирус обычно используются нейротропных векторов. Выбор соответствующего вируса для исследования вопроса является важной частью эксперимента. Размер трансгена, маршрут доставки, специфика инфекции в нейронах, в отличие от глиальных клеток, инфекция эффективность, воспалительных и токсических побочных эффектов необходимо учитывать ^4.

Здесь мы описываем стереотаксической инъекции вирусного вектора в заднем роге спинного мозга, метод, который мы используем для условного регуляции генов в наших исследованиях по нейробиологии боли. Заднего рога получает афферентного входа от первичной соматосенсорной нейронов в том числе ноцицептивных нейронов. Местные интернейроны обрабатывать информацию, прежде чем проекция нейроны передают его иззаднем роге в мозг ^5. Мы демонстрируем инфекции нейронов заднего рога спинного сегментарных на уровне L4 с нейротропных рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAV), который выражает усиливается зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под постоянно активной цитомегаловирусной промоутер.

протокол

Хирургическая процедура, описанная был одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) из Колумбийского университета.

1. Подготовка оборудования и подвески Вирус частиц

1. Очистка и дезинфекция оборудования, стерилизации хирургических инструментов и выемку V шипы, которые будут использоваться, чтобы исправить позвонка L1.
2. Потяните и пипетки конических стекла. Мы используем пипетки, которые имеют наконечник диаметром 40 мкм, а скошены под углом 20 °. Стерилизовать стеклянных пипеток.
3. Установить стереотаксической рамы, закрепите микрошприца инжектор на манипуляторе и подключить инжектор контроллер.
4. Прикрепите одну из стеклянных пипеток в микрошприца с использованием набора компрессионный фитинг.
5. Снимите поршень с микрошприца и заполнить шприц с минеральным маслом. Oil Red O (1 - (2,5-диметил-4-(2,5-dimethylphenylazo) фенилазо)-2-нафтол) могут быть добавлены к минеральным маслом, чтобы увеличить свой объемisibility. Вставьте поршень и подтолкнуть ее к весь путь к вершине. Тщательно избегать создания пузырьков воздуха.
6. Подготовка подвески вирусной частицы в шкаф биологической безопасности. Разморозить замороженный вирус на льду и, непосредственно перед употреблением, разбавьте его стерильной фосфатно-солевой буфер в нужную концентрацию частиц.
7. Вставьте микрошприца в держатель на инжектор.
8. Внесите 5 мкл суспензии вируса на небольшой пластиковый лист, например, Parafilm. Опустите наконечник стеклянной пипетки в каплю и потяните поршень, чтобы заполнить микрошприца. Создать небольшой пузырек воздуха на кончике пипетки, чтобы предотвратить его от засорения.

2. Ламинэктомия

1. Подготовка операции область, протирая скамейку и грелку с дезинфицирующим средством.
2. Anesthetize мыши. Мы используем ингаляционной анестезии изофлураном (3% во время индукции, 2% -3% во время технического обслуживания).
3. Место смазки на каждый глаз для защиты глаз от высыхания в течениеоперации.
4. Бритье меха от нижней части спины к шее мыши и дезинфицируют кожу с переменным салфеток местного антисептика, такие как хлоргексидин или повидон-йода и 70% этанола. Изолировать асептически подготовленной площадке с хирургической драпировка и проникнуть в разрез с сайта бупивакаина (0,25%, разбавленный 1:10 с физиологическим раствором).
5. Надрезать кожу на хвостовом конце грудную клетку вдоль средней линии (2-3 см) и отделить фасция охватывает позвоночник.
6. Поскольку спинной мозг перестает расти раньше во время послеродового развития, чем позвоночника, спинного сегменте L4 лежит под первого поясничного позвонка (L1). Позвонка L1 находится в хвостовой позвонок, который содержит последнюю пару ребер. Выявления и разоблачения позвонка L1 путем удаления небольших мышц спины и связок придает его спинной поверхности.
7. Слегка приподнимите и удерживайте L1 позвонка с щипцами Адсон. Используйте специальный пинцет ламинэктомия для удаления спинного Portioп позвонков (позвоночник и пластинки) и подвергать спинного мозга. Избегайте повреждения спинного мозга.
8. Передача мыши на нагревательной пластины в стереотаксической рамы. Следите за температурой мыши во время последующей эксплуатации.

3. Впрыск

1. Исправить позвонка L1 с шипами V качеством. Шипы должны стабилизировать позвоночник так, что позвонки не двигаться во время дыхания.
2. Принесите микрошприца ближе так, чтобы кончик пипетки выше ламинэктомия сайта. Опустите поршень, пока не увидите суспензии вируса выходе из пипетки. Удалите капли стерильным наконечником хлопка.
3. Поместите пипетку в ростральной-самая часть подвергается спинного мозга. Центр пипетки над задним срединная борозда, затем переместите наконечник 500 мкм с боков. Опустите наконечник к поверхности мозга и пункция твердой мозговой оболочки, или, если вы работаете с unbeveled пипетки стекла, используют скошенный канюли стали для прокола гура. Опустите кончик стеклянной пипетки 300 мкм в спинной мозг.
4. Вводят 1 мкл суспензии вируса в размере 200 Нл / мин.
5. В конце инъекции, подождите не менее 2 минут прежде, чем медленно втягивания пипетки.
6. Повторите шаги с 3,3 до 3,5 на хвостовом-самая часть подвергается спинного мозга для достижения полного распределения вирусного вектора в спинном L4 сегмента. Двух участках инъекций расположены ростральной и каудальной в сегменте L4, чтобы избежать повреждения тканей в целевом регионе.

4. Ушивание раны

1. Выпуск позвонка L1 от зажимов V вырез и удалите мышь от стереотаксической рамы.
2. Шовный фасции с 5,0 Викрил. Закрытая фасции обеспечивает прикрытие для ламинэктомия сайта.
3. Закрыть кожи с нейлоновыми швами или хирургических скоб.

5. Ведение послеоперационного периода

1. Передача мыши восстановления клетку с мягким, nonparticular постельные принадлежности. Поставьте его на тОн стороне для комфортного дыхания. Мониторинг животного, пока оно полностью предупреждение, амбулаторное и начинает пить.
2. Мы предоставляем послеоперационного обезболивания в течение 72 часов с ежедневно подкожные инъекции карпрофена (5,0 мг / кг).
3. Мониторинг послеоперационного восстановления, ежедневный осмотр в течение первых 3 дней, затем через день или 3 дня в неделю, пока эксперимент завершен.
4. Снимите кожу швы или скобы от 7 до 10 дней после операции, когда заживление ран завершена.
5. Усыпить животное после завершения эксперимента.

Результаты

Успешный выход трансфекции надежные экспрессии генов в нейронах заднего рога впрыском (рис. 1), не щадя спинного рога противоположной стороны, вентральный рог и спинной ганглии.

Рисунок 1. Трансфекция нейронов задн...

Обсуждение

Стереотаксическая инъекции вектора ориентации позволяет нейронов спинного мозга для приложений, таких как нейронные отображения сети на основе транссинаптических распространения вирусов или ^6,7 optogenetic рассечение ^8, аксон руководства во время регенерации после травмы ^9,1...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название материала	Компания	Номер по каталогу
Спинной плиты	David Kopf Instruments	912
Малый прибор стереотаксической животных	David Kopf Instruments	900
Мышь газа анестезии голову владельцу	David Kopf Instruments	923-B
Регулируемые крепления базы	David Kopf Instruments	982
В выемку шипы	David Kopf Instruments	987
Малый животное система контроля температуры	David Kopf Instruments	TCAT-2LV
Адсон щипцы	Средства изобразительных наук	11006-12
Ламинэктомия щипцы	Средства изобразительных наук	11223-20
UltraMicroPump (один) с SYS-Micro4 Controller	Инструменты Всемирной Precision	UMP3-1
Микрошприца, 65RN	Гамильтон	7633-01
RN резьбовое, 1 мм	Гамильтон	55750-01
Боросиликатного стеклянные капилляры	Инструменты Всемирной Precision	1B100F-4
Микромельница	Narishige	EG-44