הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Summary

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

Abstract

הזרקת Intraparenchymal של וקטור ויראלי מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית באוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית. אנחנו מדגימים את טכניקת הזרקת stereotaxic המאפשרת ביטוי ממוקד גן או השתקה בקרן האחורית של חוט שדרת העכבר. הליך הכירורגים קצר. זה דורש laminectomy של חוליה אחת, לספק להתאוששות מהירה של בעל החיים שאינם פגומה ותנועתיות של עמוד השדרה. הזרקה מבוקרת של נפח השעית וקטור קטן במהירות ושימוש נמוך של microsyringe עם צינורית זכוכית משופעת למזער את הפגיעה ברקמות. התגובה החיסונית המקומית לווקטור תלוי במאפיינים הפנימיים של הווירוס מועסק; בניסיון שלנו, זה קל וקצר ימים, כאשר וירוס אדנו הקשורים בשימוש. גן כתב כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מאפשר פיזור המרחבי ניטור של הווקטור, ואת היעילות והסלולרי specificity של transfection.

Introduction

טכנולוגיות מתקדמות של מניפולציה גנטית מותנית בעכבר מאפשרות גישות רבות פנים לחקר מסלולים וקשרים סינפטיים תפקודיים במערכת העצבים המרכזית. Transgenes עשוי להיות מוסדר על ידי effectors מולקולה קטנה כגון דוקסיציקלין פועלת על transactivator טטרציקלין מבוקר, אשר יכול להיות מתוכנן לתפקד כמדכא או activator של שעתוק גנים, או טמוקסיפן הכרת תחום מוטצית יגנד מחייב של קולטן אסטרוגן ¹ . שינוי בלתי הפיך transgene מושגת בדרך כלל על ידי חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) recombinases. Cre (רקומבינציה סיבות) וFLP (אנזים רקומבינציה flippase) לזרז את הכריתה, היפוך או טרנסלוקציה של מקטעי דנ"א המוקפים loxP (לוקוס של x המעבר מעל, P1) או FRT (יעד ההכרה flippase) אתרים בהתאמה ^1. יישומים כוללים הפעלת גן או השתקה וחומצה ריבונוקלאית מושרה (RNA) הפרעות > 2. ביטוי תנאי כתבי ניאון או האנזימטית כגון β-גלקטוזידאז או phosphatase אלקליין ניתן להשתמש כדי לתייג תאי עצב ולבדוק את הארגון וקישוריות ³ האקטואליים שלהם. פרויקטי mutagenesis רחב היקף בצפון אמריקה (http://www.norcomm.org/index.htm) ובאירופה (http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm) מייצרים ספריות של שיבוטי תאי גזע עובריים של עכברים עם יעדים מותנים גנים ומלכודות שסופו של דבר מכסים את כל גנום העכבר. עכברים שנוצרו משיבוטים אלה עשויים להיות חצו עם מספר ההולך וגדל של קווי עכברים שמבטאים recombinases DNA תחת יזמים או לוקוסים ספציפיים לאוכלוסייה מסוימת של תאי עצב למניפולציה גנטית סלקטיבי (http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . Php).

= "Jove_content"> עם זאת, הגבלת מניפולציה גנטית לאוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של עניין לא יכולה להיות מושגת על ידי מיקוד גנטי לבד אם אמרגן ספציפי לאוכלוסיית הנוירון של ריבית אינו ידוע או שאינו באו לידי ביטוי בכל תאי העצב באזור של עניין. בחוט השדרה, עיצובים ניסיוניים עשויים לדרוש הגבלה המרחבי של המניפולציה הגנטית לקטע אחד או שתיים craniocaudal. הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי שמבטא Cre או FLP מאפשר הגבלת רקומבינציה גן לאזורים בחוט השדרה של עכברים שבברי DNA הם מוקפים אתרי FRT loxP או, מה שמכונה אללים floxed או flrted. בניגוד לארגון מחדש דנ"א מכונן, אשר יגרום מהכלאת החיות עם עכברים המבטאים recombinase, אסטרטגיה זו גם מספקת שליטה זמנית על הפעלת גן או השתקה. וקטורים ויראליים קידוד floxed או פלירטט transgenes להציע אופציה הפוכה של מניפולציה גנטית בעכברים המבטאות את corresponding מורד recombinase של אמרגן נוירון ספציפי. כמה וקטורים רקומביננטי עם זיקה לנוירונים זמינים ^4. קיבולת גבוהה אדנווירוס (פחדן), וירוס adeno-משויך, וירוס הרפס סימפלקס וlentivirus משמשים וקטורי neurotropic. בחירת הווירוס המתאים לשאלת מחקר היא חלק מכריע בעיצוב ניסיוני. גודל transgene, מסלול משלוח, סגולי של הזיהום לנוירונים בניגוד לתאי גליה, יעילות זיהום, תופעות לוואי רעילות דלקתיות וצריכות להילקח בחשבון ^4.

כאן אנו מתארים את זריקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית של חוט השדרה, טכניקה שאנו נוקטים לויסות גנים מותנות במחקר שלנו על נוירוביולוגיה של כאב. הקרן הגבתה מקבלת קלט מביא מהנוירונים חושיים עיקריים כוללים נוירונים nociceptive. interneurons המקומי לעבד את המידע לפני נוירונים הקרנה להעביר אותו מקרן האחורית למוח ^5. אנחנו מדגימים את הזיהום של נוירונים קרן אחורית ברמה מגזרית שדרת L4 עם וירוס neurotropic אדנו-משויך (rAAV) שמבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGfp) תחת אמרגן ציטומגלווירוס constitutively פעיל.

Protocol

ההליך כירורגי תאר אושר על ידי בעלי החיים וטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) מאוניברסיטת קולומביה.

1. הכנת הציוד והשעית חלקיקי וירוס

1. לנקות ולחטא את הציוד, לעקר את מכשירי ניתוח ואת הקוצים לחרוץ V שישמשו לתיקון החוליה L1.
2. משוך וpipettes זכוכית פוע. אנו משתמשים pipettes בעלי קוטר קצה של 40 מיקרומטר והם משופעים בזווית של 20 מעלות. לעקר את pipettes הזכוכית.
3. הגדרת מסגרת stereotaxic, הר microsyringe המזרק על מניפולטור ולהתחבר למזרק הבקר.
4. צרף אחד מpipettes הזכוכית לשימוש בערכת microsyringe הולמת הדחיסה.
5. הסר את הבוכנה מmicrosyringe ולמלא את המזרק עם שמן מינרלים. השמן האדום O (1 - (2,5-דימתיל-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo)-2-naphthol) ניתן יהיה להוסיף לשמן המינרלים להגדיל visibility. החזר את הבוכנה ולדחוף אותו לכל אורך הדרך עד לקצה. זהירות להימנע מיצירת בועת אוויר.
6. הכן את השעית חלקיקי הנגיף בארון בטיחות ביולוגי. הפשר את הווירוס הקפוא על קרח, ורגע לפני השימוש, לדלל אותו עם סטרילי שנאגר מלוח פוספט לריכוז החלקיקים הרצויים.
7. הכנס microsyringe לתוך המחזיק במזרק.
8. 5 μl פיפטה של השעית הווירוס על גבי יריעת פלסטיק קטנה, למשל Parafilm. הנמך את קצה פיפטה זכוכית לירידה ומשוך את הבוכנה למלא microsyringe. יצירת בועת אוויר קטנה בקצה פיפטה כדי למנוע ממנה הסתימה.

2. Laminectomy

1. הכן את אזור הניתוח על ידי ניגוב ספסל וכרית חימום עם חומר חיטוי.
2. הרדם את העכבר. אנו משתמשים בהרדמת משאיפת עם isoflurane (3% במהלך אינדוקציה, 2% -3% במהלך תחזוקה).
3. הנח חומר סיכה על כל עין כדי להגן על העיניים מפני התייבשות במהלךפעולה.
4. לגלח את הפרווה מהגב התחתון לצוואר של העכבר ולחטא את העור עם לסירוגין מגבונים של חיטוי אקטואלי כגון כלורהקסידין או povidone-יוד ו70% אתנול. לבודד את האתר נקי מחיידקים, שהוכן עם וילון כירורגית ולחדור אתר החתך עם bupivacaine (0.25%, 1:10 מדוללים עם תמיסת מלח פיזיולוגית).
5. חתוך העור בקצה הזנב של כלוב הצלעות לאורך קו האמצע (2-3 סנטימטר) ולהפריד את fascia מכסה את עמוד שדרה.
6. כי חוט השדרה מפסיק לגדול מוקדם יותר במהלך התפתחות לאחר לידה מעמוד השדרה, קטע שדרת L4 טמון מתחת לחוליה הראשונה (L1). חולית L1 נמצא זנב לחוליה שמחזיקה את הזוג האחרון של צלעות. לזהות ולחשוף את החוליה L1 ידי הסרה את השרירים והרצועות בעמוד השדרה הקטנים צמודות למשטח הגב שלה.
7. מעט להרים ולהחזיק L1 חוליה עם כ מלקחי Adson. השתמש במלקחי Laminectomy ייעודיים להסרת portio הגבהn של החוליה (עמוד שדרה וlamina) ולחשוף את חוט השדרה. להימנע מהפגיעה בחוט השדרה.
8. העבר את העכבר על גבי צלחת החימום במסגרת stereotaxic. לנטר את הטמפרטורה של העכבר במהלך המבצע הבא.

3. הזרקה

1. תקן החוליה L1 עם קוצים לחרוץ V. את הקוצים חייבים לייצב את עמוד השדרה, כך שהחוליה לא זזה במהלך נשימה.
2. הבא microsyringe קרוב יותר, כך שקצה פיפטה הוא מעל אתר laminectomy. מנמיך את הבוכנה, עד שאתה רואה את השעית וירוס יציאת פיפטה. הסר את האגל בקצה כותנת סטרילי.
3. מקם את קצה פיפטה במקורי ביותר חלק מחוט השדרה החשופה. מרכז פיפטה לעיל מענית החציון האחורית, ואז להעביר את הקצה רוחבי 500 מיקרומטר. הנמך את הקצה אל פני השטח של החוט ולנקב את דורת מאטר, או אם אתה עובד עם כוס טפטפה unbeveled, השתמש צינורית פלדה משופעת לנקב דURA. הנמך את הקצה של 300 מיקרומטר זכוכית פיפטה לתוך חוט השדרה.
4. הזרק μl 1 מתוך השעית וירוס בשיעור של 200 nl / דקה.
5. בסופו של הזריקה, לחכות לפחות 2 דקות לפני לאט חוזר בי פיפטה.
6. חזור על שלבים 3.3-3.5 בזנב ביותר החלק מחוט השדרה החשופה כדי להשיג הפצה מלאה של וקטור ויראלי בL4 קטע שדרה. שני אתרי ההזרקה נמצאים מקורי וזנב של L4 המגזר, כדי למנוע ניזק לרקמות באזור היעד.

4. סגירת פצעים

1. שחרור החוליה L1 ממהדקי חריץ V ולהסיר את העכבר ממסגרת stereotaxic.
2. לתפור fascia עם 5.0 vicryl. Fascia הסגור מספק כיסוי לאתר laminectomy.
3. סגור את העור עם תפרי ניילון או סיכות ניתוחיות.

5. טיפול לאחר הניתוח

1. העבר את העכבר לכלוב התאוששות עם מצעים רכים, nonparticular. מניח אותו על לאהוא הצד לנשימה נוחה. פקח את החיה עד שהוא ערני לחלוטין, נודד ומתחיל לשתות.
2. אנו מספקים שיכוך כאבים לאחר ניתוח במשך 72 שעות ביום זריקות תת עורית של carprofen (5.0 מ"ג / ק"ג).
3. פקח על התאוששות לאחר ניתוח על ידי בדיקה יומית במשך 3 הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום אחר, או 3 ימים בשבוע עד לניסוי הושלם.
4. הסרת תפרי העור או סיכות 7 עד 10 ימים לאחר הניתוח, כאשר ריפוי פצע הוא מוחלט.
5. להרדימו לאחר השלמת הניסוי.

תוצאות

תשואות transfection מוצלחות ביטוי גנים בתאי עצב חזק של קרן האחורית הזרקה (איור 1), שאינו מרבה הקרן האחורית של הצד הנגדי, הקרן הבטנית וגרעיני השורש הגבו.

איור 1. Transfection של נוירונים קרן ?...

Discussion

הזרקת הווקטור Stereotaxic מאפשרת מיקוד תאי עצב בחוט שדרה עבור יישומים כגון מיפוי רשת עצבית המבוסס על הנגיף מתפשט transsynaptic ^6,7 או נתיחת optogenetic ^8, הדרכת האקסון במהלך רגנרציה מפציעת ^9,10, או טיפול גנטי למניעה או הטיפול של ¹¹ ניוון ^{מוחיה, 12.} וקטורים נגיפי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם חומר	חברה	מספר קטלוגים
צלחת בסיס עמוד שדרה	דוד קופף מכשירים	912
מכשיר stereotaxic חיה קטן	דוד קופף מכשירים	900
בעל ראש הרדמת גז מאוס	דוד קופף מכשירים	923-B
mounts הבסיס מתכוונן	דוד קופף מכשירים	982
קוצי V לחרוץ	דוד קופף מכשירים	987
מערכת בקרת טמפרטורת חיה קטנה	דוד קופף מכשירים	TCAT-2LV
Adson מלקחיים	כלי מדע פיין	11006-12
מלקחי Laminectomy	כלי מדע פיין	11223-20
UltraMicroPump (1) עם SYS-Micro4 בקר	מכשירי Precision העולם	UMP3-1
Microsyringe, 65RN	המילטון	7633-01
RN דחיסה המתאימה, 1 מ"מ	המילטון	55750-01
ורוסיליקט זכוכית נימים	מכשירי Precision העולם	1B100F-4
Microgrinder	Narishige	EG-44