立体定向注射病毒载体的基因操作在小鼠脊髓条件

摘要

病毒载体可以进行有针对性的基因操作。我们提出了一个条件性基因的表达或消融方法在小鼠脊髓，采用立体的病毒载体注射到脊髓背角，初级躯体感觉传入中枢神经系统的神经元之间的突触接触的一个突出的部位。

摘要

实质内注射病毒载体使在不同人群的中枢神经系统的神经元或特定区域的条件的基因操作。我们展示了一个立体的注射技术，可以使靶基因的表达或沉默的小鼠脊髓背角。手术是短暂的。它需要一个单一的椎椎板切除术，提供快速恢复脊柱的动物和不受影响的活力。在低速和使用微量的斜角玻璃套管控喷射的小矢量悬浮液体积减少组织损伤。局部免疫反应的矢量取决于采用的病毒的内在特性;根据我们的经验，这是轻微和短暂的，使用时的重组腺相关病毒。如增强型绿色荧光蛋白报告基因的方便的载体，空间分布监测和疗效和蜂窝指定的转染ficity。

引言

有条件的基因操作在小鼠的先进技术，使多方面的探索中枢神经系统的的突触途径和功能连接方法。转基因可能是受小分子效应如强力霉素，四环素控制的反式激活，它可以被设计为充当一个阻遏或激活基因转录，或他莫昔芬承认的雌激素受体^​​1的配体结合域的突变作用于。通常是不可逆的转基因修饰的实现由脱氧核糖核酸（DNA）的重组酶。华创（的原因重组）和FLP（flippase重组酶）催化loxP位（轨迹，穿越x，P1）或首次登记税（flippase识别目标）的网站，分别为¹的DNA片段，这些片段两侧切除，反转或易位。应用范围包括基因的激活或沉默和诱导型核糖核酸（RNA）干扰 ^{2。可以使用的条件表达的荧光或酶如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶的记者标记神经元，并检查它们的局部组织和连接3。大型诱变项目在北美（ http://www.norcomm.org/index.htm ）和欧洲（ http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ）的小鼠胚胎干细胞克隆库有条件的靶基因和陷阱，最终将覆盖整个小鼠基因组中。鼠标线膨胀的数目，反映根据特定的神经元的选择性基因操作（ http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index某一特定人群的启动子或基因座的DNA的重组酶，可以划线，从这些克隆产生的小鼠PHP ）。}

然而，限制基因操作不同人群的神经元或感兴趣的特定区域可能不实现通过基因单独定位，如果还没有已知的或不表达在该区域的所有神经元到神经元特异性的启动子人口的利益的兴趣。在脊髓中，实验设计，可能需要一个或两个头尾段空间限制的基因操作。立体定位注射病毒载体表达Cre或FLP，允许限制基因重组小鼠脊髓中的DNA片段由loxP位或frt位点两侧的区域，即所谓的两侧装接loxP的或flrted等位基因。与组成DNA重排，这将导致从杂交育种与重组表达小鼠的动物，这种策略还提供了时间控制基因的激活或沉默。病毒载体编码两侧装接loxP或调情转基因提供了一个逆向选择的基因操作在小鼠体内表达的corresponding重组的神经元特异性启动子的下游。重组表达载体亲和力的神经元是^4。高容量（无胆）腺病毒，腺相关病毒，单纯疱疹病毒和慢病毒常​​用嗜神经载体。选择合适的病毒用于研究的问题是实验设计的一个重要组成部分。的转基因的大小，送货路线，特异性感染的神经元，而不是神经胶质细胞，感染的疗效，炎性和毒性副作用需要考虑^4。

在这里，我们描述了立体的病毒载体注射到脊髓背角，采用的技术，我们的条件在我们的研究对疼痛的神经生物学基因调控。背角接收传入的初级躯体感觉神经元的输入，包括伤害性神经元。当地的interneurons处理信息，然后投射神经元的传递从背角的大脑^5。我们展示了一种嗜神经的重组腺相关病毒（rAAV），组成性激活的巨细胞病毒启动子表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）下背角神经元在脊髓节段L4感染。

研究方案

描述的外科手术已经批准了哥伦比亚大学实验动物护理和使用委员会（IACUC）。

1。设备和病毒颗粒悬浮液的制备

1. 清洁和消毒的设备，消毒的外科手术器械和V形缺口，将用于修复椎骨L1尖峰。
2. 拉和锥玻璃吸管。我们使用的移液管的前端的直径为40μm，并在以20°的角度倾斜的。消毒的玻璃吸管。
3. 设置的立体定位框架，安装到操纵器上的微量喷射器，喷射器连接到控制器。
4. 微量使用压缩装配套件安装的玻璃吸管。
5. 将柱塞微量矿物油填补了注射器。油红O（1 - （2,5 - 二甲基-4-（2,5-dimethylphenylazo）苯基偶氮）-2 - 萘酚）可被加入到矿物油，以增加它的visibility。重新将活塞推给小费的方式。小心避免气泡。
6. 准备病毒颗粒悬浮在生物安全柜。在冰上解冻冷冻病毒，只是在使用前，用无菌磷酸盐缓冲盐水所需的颗粒浓度稀释。
7. 将微量注射器持有人。
8. 吸取5μl病毒悬液到一个小塑料片， 如封口膜。降低玻璃吸液管头下降到拉活塞，填补了微量。创建一个小气泡，在移液管尖，以防止它从堵塞。

2。椎板切除术

1. 准备手术部位用消毒液擦拭工作台和加热垫。
2. 麻醉鼠标。我们使用吸入异氟醚麻醉诱导过程中，在维修过程中的2％-3％）（3％。
3. 将每只眼睛以保护眼睛免受干燥过程中的润滑剂操作。
4. 剃须从下背部的鼠标的颈部和皮草消毒皮肤与交替的局部消毒剂如洗必泰或聚维酮碘和70％乙醇的湿巾。隔离无菌制备的网站与手术被单和渗透布比卡因（0.25％，生理盐水稀释1:10）的切口部位。
5. 在尾端的肋骨沿中线（2-3厘米），切开皮肤，分离筋膜覆盖脊柱。
6. 由于脊髓停止生长早期发育过程中的比脊柱，脊髓节段L4位于下方的第一腰椎（L1）。 L1椎体位于骶管的脊椎骨持有的最后一对肋骨。识别和消除小脊髓肌肉和韧带连接到其背表面暴露椎体L1。
7. 轻轻抬起，保持脊椎的L1与一个ADSON的钳。使用专用的椎板钳，删除背portioN的椎体（脊椎和叶片）和暴露脊髓。避免损伤脊髓。
8. 转移鼠标在立体定位框架到加热板。随后的操作过程中，监测温度的鼠标。

3。注射

1. 修复椎体L1与V型缺口的峰值。尖峰必须稳定，使脊柱的椎体呼吸过程中不动。
2. 带来的微量近点儿，让吸头以上椎板网站。降低活塞，直到你看到病毒悬液退出吸液管。用无菌棉棒取出液滴。
3. 移液管尖头定位在最延髓部的暴露的脊髓。中心后正中沟以上的吸管，然后将尖端500μm的横向。降低头电源线和刺破硬脑膜表面，如果您使用的是未斜切的玻璃吸管，用一个斜面钢套管穿刺的d市区重建局。放下的前端的玻璃吸移管300微米到脊髓。
4. 注射1微升病毒悬浮液，在200升/分钟的速率。
5. 在注射完毕，等待至少2分钟，才慢慢地缩回吸管。
6. 重复步骤3.3至3.5，最的尾部的露出的脊髓的病毒载体在脊髓节段L4实现完全分布。两个注射部位位于延髓和尾侧的L4段，以避免在目标区域中的组织损伤的。

4。伤口愈合

1. 发布椎体L1的V型缺口夹，删除鼠标的立体框架。
2. 缝合筋膜与5.0薇乔。封闭的筋膜椎板网站提供保障。
3. 关闭肌肤的尼龙手术缝合或钉书钉。

5。术后护理

1. 鼠标传输到恢复笼被褥与柔软，nonparticular的。将它放在吨他一边舒适的呼吸。监控动物，直到它是完全清醒的，能行走，并开始饮用。
2. 我们提供术后镇痛的72小时：每日皮下注射的卡洛芬（5.0毫克/公斤）。
3. 监测术后第3天恢复日常检查，然后隔日或每周3天，直到试验完成。
4. 去除皮肤缝合或钉书钉，手术后7〜10天，当伤口完全愈合。
5. 实验完成后，安乐死动物。

结果

成功转染产生强大的基因的表达，不惜背角对侧，腹角和背根神经节神经元的注入背角（ 图1）。

图1。 （A）表达的荧光记者左背角L4脊髓，两个星期后的rAAV-EGFP的立体定向注射（血清型AAV2 / ^8，9个基因组拷贝/ EGFP（绿色） 转染背角神经元。微升）。神经元进行免疫染色的神经?...

讨论

立体定向的载体注射可针对脊髓神经元的应用程序，如神经网络映射的基础上跨突触传播的病毒^6,7或optogenetic解剖，轴突引导再生过程中从伤病中^9,10，或基因治疗用于预防或治疗神经退行性疾病^{11， 12。}病毒载体用于基因操作的脊髓研究躯体感觉，运动和植物神经途径^{9,10,13-15。}鼠标是最广泛使用的模式生物的研究涉及立体病毒载体注射到大脑或脊髓，但该技术已?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料名称	公司	目录编号
脊髓底板	大卫KOPF工具	912
小动物立体定位仪	大卫KOPF工具	900
鼠标气体麻醉头支架	大卫KOPF工具	923-B
可调底座支架	大卫KOPF工具	982
V型缺口尖峰	大卫KOPF工具	987
小动物的温度控制系统	大卫KOPF工具	TCAT-2LV
ADSON钳	精细科学工具	11006-12
椎板切除术钳	精细科学工具	11223-20
UltraMicroPump（一）SYS-MICRO4控制器	世界精密仪器	UMP3-1
微量，65RN	汉密尔顿	7633-01
RN压缩接头，1毫米	汉密尔顿	55750-01
高硼硅玻璃毛细管	世界精密仪器	1B100F-4
Microgrinder	成重	EG-44