في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Summary

هنا، فإننا نقدم مقاربة منهجية لتطوير ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وحساسة ومحددة في الجسم الحي المقايسات لتفسير التباين في علم الأمراض البشرية. التلاعب الجيني عابرة عبر Microinjection من WT ومتحولة مرنا الإنسان وmorpholino (MO) أليغنوكليوتيد] العقاقير تسخير معرفة منشأ من البلدان النامية الجنين الزرد لفحص الطفرات المسببة للأمراض بسرعة، وخاصة، ولكن ليس على سبيل الحصر، في سياق اضطرابات النمو البشري.

Abstract

هنا، فإننا نقدم طرق لتطوير المقايسات للاستعلام تغييرات nonsynonymous يحتمل أن تكون هامة سريريا باستخدام تكامل في الجسم الحي في الزرد. الزرد (دانيو rerio) هي نظام الحيوانية مفيدة بسبب معرفة منشأ بهم التجريبية؛ أجنة شفافة لتمكين عرض السطحية، والخضوع السريع فيفو السابقين التنمية، ويمكن التلاعب بها وراثيا ¹ وقد سمحت هذه الجوانب لتحقيق تقدم كبير في تحليل التطور الجنيني،. العمليات الجزيئية، والتخلق الإشارة. أخذت معا، ومزايا هذا النموذج الفقاريات جعل الزرد قابلة للغاية لنمذجة العيوب التنموية في أمراض الأطفال، وفي بعض الحالات، واضطرابات يظهر في مرحلة الكهولة. لأن الجينوم الزرد يتم حفظها للغاية مع أن البشر (~ 70٪ orthologous)، فمن الممكن أن ألخص الحالات المرضية البشرية في الزرد. ويتم إنجاز هذا إما عن طريق الحقن من M الإنسان متحولةالحمض النووي الريبي للحث على زيادة المهيمنة سلبية أو الأليلات وظيفة، أو الاستفادة من morpholino (MO) أليغنوكليوتيد] العقاقير لقمع الجينات لتقليد فقدان المتغيرات وظيفة. من خلال تكامل من الظواهر MO التي يسببها الإنسان مرنا مع المغطاة، نهجنا تمكن تفسير تأثير ضار من الطفرات في تسلسل البروتين البشري يعتمد على قدرة مرنا متحولة لانقاذ قابلة للقياس، النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. النمذجة من الأليلات الأمراض التي تصيب البشر يحدث من خلال Microinjection من الأجنة الزرد مع MO و / أو مرنا البشري في مرحلة الخلية 1-4، وphenotyping تصل إلى سبعة أيام بعد الإخصاب (DPF). ويمكن تمديد هذه الاستراتيجية العامة لمجموعة واسعة من الظواهر المرض، كما هو موضح في بروتوكول التالية. نقدم نماذجنا التي أنشئت لالتخلق إشارات، القحفي، القلب، وسلامة الأوعية الدموية، وظيفة الكلى، والهيكل العظمي الظواهر اضطراب العضلات، فضلا عن غيرهم.

Introduction

تفسير وظيفي من المعلومات الوراثية والتنازل عن قيمة السريرية التنبؤية إلى التركيب الوراثي يمثل مشكلة كبيرة في مجال علم الوراثة الطبية وأصبحت مؤثرة على نحو متزايد مع الجدوى التقنية والاقتصادية المتسارعة من تسلسل الجينوم واسعة. ولذلك، فمن الضروري لتطوير وتنفيذ نماذج جديدة لاختبار الإمراضية من المتغيرات ذات الأهمية غير معروف (VUS) الكشف في المرضى. يجب أن تكون هذه المقايسات ثم دقيقة، والوقت وفعالة من حيث التكلفة، والميناء القدرة على تحفيز التحول إلى فائدة سريرية.

بينما كان الماوس تقليديا أداة للاختيار في مجال النمذجة الأمراض التي تصيب البشر، الزرد آخذة في الظهور كبديل علميا ومواتية اقتصاديا. على عكس الفأر، الزرد البيولوجيا يتيح الوصول السهل والمناسب لجميع مراحل النمو، وساعد على وضوح بصري من الأجنة التي تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي من الأمراض النامية. ^{1 وقدمت جيل حديث نسبيا من خطوط الزرد متحولة إجراء اختبارات إضافية وخيارات النمذجة، والتي تستخدمها العديد من الدراسات في وظيفية، ولكن لا تزال هذه التكنولوجيا لتكون محدودة (تم استعراضها في 1،38). ليس فقط هي المسوخ الجينية مع المغلوب الإضافية من الطفرات محددة شاقة لتحقيق، بل هي أيضا غير قابلة للتحليل متوسطة أو عالية الإنتاجية لاختبار مجموعة من الطفرات في جين واحد. الأهم من ذلك، يمكن للجناح واحد من الاختبارات تقديم معلومات ليس فقط عن القدرة المسببة للأمراض من الأليلات، ولكن أيضا لاتجاه تأثير على المستوى الخلوي (مثل فقدان وظيفة مقابل مكاسب من وظيفة)، وهو أمر حاسم لوضع الميراث إعلام في الأسر، وخصوصا عندما تؤوي الأنساب بشرية صغيرة معلومات محدودة عن طريقة انتقال الوراثية. لمزيد من المقارنة لاستخدامات الماوس المتاحة والنماذج الزرد، انظر الجدول رقم 1.}

نلاحظ أيضا أنإعادة قيود متأصلة في النظام النموذجي الزرد. على الرغم من أن د. rerio يكون التطوير الأولي السريع للأجهزة الجسم، النضج الجنسي يتطلب ما يقرب من ثلاثة أشهر. وبسبب هذا، واضطرابات ما قبل الولادة والأطفال الظهور هي الأكثر قابلية لهذا النموذج التعبير عابر. في حين المثالي لإجراء شاشات كبيرة مركب كيميائي، واستخدام المسوخ الجينية ليست مجدية لاختبار منهجي الآلاف من المتغيرات التي تسهم في nonsynonymous، والاستمرار في الكشف عن الاضطرابات في طب الأطفال.

الاختبارات تكامل وصفها هنا الاستفادة من هذا معرفة منشأ التجريبية، ودرجة عالية من التماثل، والحفاظ على وظيفة بين البروتينات البشرية والزرد، بشكل خاص بالنسبة لجزيئات اللازمة لعمليات الحفظ التنموية. الشكل 1 يبين الاختبار وتحديد استراتيجية للآثار أليل مختلف. كلا فقدان وظيفة (LOF) والمقايسات المهيمنة لا يمكن أن يؤديها. لLOF، تبدأ التجربة مع قمع الجينات في المصالح مع ضربة قاضية morpholino، ويعاير لالظواهر التي قد تكون ذات صلة إلى النمط الظاهري السريرية قيد التحقيق. لا يمكن أن يتحقق قمع إما عن طريق منع ترجمة من خلال استهداف MO في أو قرب بدء موقع متعدية من الزرد موضع (ترجمة مانع morpholino؛ tbMO) أو عن طريق التداخل مع الربط عن طريق وضع MO على تقاطع لصق، الأمر الذي أدى عادة إما إدراج إنترون اكسون أو الشاذة تخطي (لصق حجب morpholino؛ sbMO).

وفي وقت لاحق، وقدم مرنا توج من نص الإنسان orthologous ويتم قياس الانقاذ قابلة للقياس الكمي من النمط الظاهري. وبمجرد إنشاء الفحص، ويمكن إدخال طفرات مرشح في رسالة الإنسان ويعاير لقدرتها على إنقاذ النمط الظاهري MO التي يسببها في نفس الكفاءة ومرنا الإنسان WT. وعلى العكس، لمرشح الأليلات السائدة، مرنا الإنسان (ولكن ليس MO) هي introducإد مع توقع بأن مرنا الإنسان WT لن يؤثر بشكل صارخ علم التشريح وعلم وظائف الزرد، في حين مقدمة من الطفرات اختبار أن يكون لها تأثير مهيمن من شأنها أن تحفز الظواهر مماثلة لتلك التي لوحظت في حالة اكلينيكية على البشر. هذه التجربة يمكن أن تكون كذلك غرامة الحبيبات لتشريح ما إذا كان الأثر المهيمن يحدث من قبل مكسب من وظيفة (GOF) أو آلية المهيمنة السلبية عن طريق مزج مرنا الإنسان WT ومتحولة؛ للأحداث GOF، إضافة مرنا الإنسان WT ومن المتوقع أن يكون غير ذي صلة، في حين لالأليلات السائدة السلبية، ومزج من مرنا WT ومتحولة وينبغي تغيير شدة النمط الظاهري الناجمة عن رسالة متحولة. في جميع الحالات، ونحن نوصي جميع مجموعات من حقن (MO مع مرنا الإنسان WT مقابل morpholino مع متحولة الإنسان الخ مرنا أن يؤديها، ويفضل في نفس القابض من الأجنة (انظر الشكل 1) التفسير هو على النحو التالي:

لاختبارات LOF:

• إذا كانت ضربة قاضيةينتج النمط الظاهري الذي يمكن انقاذ مكافئ من قبل مرنا متحولة وWT، وأليل من المرجح حميدة.
• إذا كان الإنقاذ متحولة من النمط الظاهري ضربة قاضية لا يمكن تمييزه عن النمط الظاهري ضربة قاضية نفسها، وأليل هو لاغ وظيفية احتمالا. التجربة لا تستطيع أن تميز بين القيم الخالية الحقيقية (أي بروتين وظيفي) ومستويات النشاط بروتين فائقة الانخفاض التي ليست لها القدرة الانقاذ.
• إذا كان الإنقاذ متحولة من النمط الظاهري ضربة قاضية هو أفضل إحصائيا من MO، لكن أسوأ من WT، وأليل من المحتمل أن يكون ناقص المفعول كما يوضح هذا نتيجة فقدان جزئي من وظيفة.

لاختبارات السائدة:

• إذا لم يكن هناك النمط الظاهري ضربة قاضية، ولكن حقن مرنا WT تنتج النمط الظاهري، خطة طوارئ يجب أن تستخدم إذا كانت التجربة هي في المضي قدما (انظر أدناه).
• إذا لم يكن هناك النمط الظاهري ضربة قاضية وحقن مرنا WT لا ينتج النمط الظاهري، التجربة العائدات على النحو المعتاد.
• إذا حقنمن مرنا متحولة ما يعادل ذلك من البرية من نوع مرنا، قد يكون أليل إما حميدة أو فقدان وظيفة، أو الفحص قد فشلت. وهذا يتطلب مزيد من التجارب للتمييز بين هذه الخيارات.
• إذا حقن مرنا متحولة لا يمكن تمييزه من MO ضربة قاضية، من المحتمل تغيير وظيفة الجين المنتج في بعض الطريق. لتبين تغير في وظيفة، ينبغي إجراء المعايرة من مرنا متحولة مع من النوع البري مرنا بها.
• إذا كانت نتيجة هذه المعايرة لا يمكن تمييزه إلى البرية من نوع مرنا وحده، فقد تبين أن المنتج بروتين متحولة يستخدم بروتين من النوع البري باعتباره الركيزة، كما وتتنوع تأثيره مع كمية من المعايرة. وهذا يدل على النمط الظاهري السلبية المهيمنة.
• إذا كانت نتيجة هذه المعايرة لا يمكن تمييزه إلى مرنا متحولة وحده، فقد تبين أن المنتج بروتين متحولة لم يعد لديه بنفس وظيفة من نوع البرية، وبالتالي لا يتأثر بمقدار البرية من نوع البروتين قبل المنتجأرسلت. هذا يدل على أن أليل هو مكسب الأرجح من وظيفة.

خطة طوارئ:

• إذا لم يعرض النمط الظاهري من MO ضربة قاضية، لكن لا الحاضر مع مرنا WT، يمكن أن يحدث مزيد من التجارب، على الرغم من أننا نؤكد أن هذا الوضع ليس وضعا مثاليا. وينبغي معاير مرنا الإنسان WT للحد من النمط الظاهري، ويمكن أيضا أن تستخدم كنقطة مجموعة جديدة. يمكن تقييم مزيد من WT ومرنا الإنسان متحولة coinjection يعتمد على قدرة إنقاذ من متحولة.

Protocol

1. المعلوماتية الحيوية تحليل

1. تحديد ما إذا كانت الجينات البشرية من الفائدة لديها ortholog الزرد، وإذا كان الأمر كذلك، كم من النسخ. نوصي انفجار متبادلة ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ) من البروتين البشري ضد الجينوم الزرد، وانفجار لاحق من أفضل الزرد ضرب ضد الجينوم البشري. الإرادة الحقيقية orthologs يكون أفضل ضرب في كل حالة.
2. تحديد حجم الإطار القراءة المفتوحة (ORF) من الجينات البشرية. إذا كان أطول من 6 كيلو بايت، هذا النموذج هو مستعصية على الحل في الوقت الحاضر بسبب القيود المفروضة على جودة عالية في النسخ المختبر من القوالب طويلة.
3. الحصول على أو إنشاء بناء يحتوي على ORF الإنسان في pCS2 + العمود الفقري النواقل (أو ما يعادلها ناقلات مع 5 'SP6 موقع النسخ و3' بوليا إشارة).
4. تصميم MO لمنع الربط أو الترجمة من الجين الزرد المستهدفة. في حالة وجود نسخ متعددة في الجينوم الزرد، ذره خياران: أ) تصميم من المنظمات الأعضاء إضافية، أو ب) تحديد موقع لصق حفظها تماما بين النسخ التي ضد مو واحد يمكن أن تكون فعالة. تتوفر في بعض متواليات MO نشرت www.zfin.org .

2. تحليل التعبير في البلدان النامية الأجنة الزرد

1. تحديد ما إذا كان يتم التعبير عن ortholog الزرد في سياق الزمانية المكانية ذات الصلة قراءات المظهري. إذا توجد بيانات متاحة للتعبير الجينات في المصالح، وإجراء النسخ العكسي (RT)-PCR باستخدام [كدنا] من الأجنة الزرد كليا أو التهجين في الموقع. (راجع ^2،3).

3. الطفرات موقع الموجه

1. تصميم الاشعال الطفرات 25-45 قواعد في الطول، مع الطفرة المرجوة في المركز. يجب أن تكون درجة حرارة انصهار التمهيدي أكبر من أو يساوي 78 درجة مئوية. تصميم التمهيدي إلى الأمام وعكس الطفرات ليصلب لالمعاكسخيوط من البلازميد.
2. الحصول الاشعال لتأكيد تسلسل ORF بعد الطفرات، وهذه ينبغي البلاط عبر ~ 300 أقسام قاعدة بين زوج لتغطية ORF كامل.
3. تجميع رد فعل الطفرات مع البلمرة عالية الدقة ودورة على النحو التالي (1: 95 ° C 30 ثانية، 2: 95 ° C 30 ثانية، 3: 55 ° C 1 دقيقة، 4: 68 ° C 6 دقائق، 5: الذهاب إلى 2 18X، 6: 4 ° C إلى الأبد، 7: نهاية).
4. إضافة 1 ميكرولتر DpnI تقييد نوكلياز داخلية في رد الفعل لإزالة قالب ميثليته السد؛ احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
5. تحويل 2 ميكرولتر من رد فعل الطفرات في الخلايا المختصة 20 ميكرولتر وفقا لبروتوكولات القياسية.
6. اختيار 3-4 المستعمرات وتطعيم 5 مل من وسائل الاعلام LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. يهز عند 37 درجة مئوية خلال الليل في 225 دورة في الدقيقة.
7. Miniprep الحمض النووي وتحديد تركيز.
8. تسلسل موقع تحور لتأكيد وجود طفرة في المصالح.
9. تسلسل كامل ORF لتأكيد سلامة تسلسل.

4. النسخ في المختبر مرنا

1. باستخدام خطي pCS2 + قالب، وتوليد مرنا توج باستخدام mMessage mMachine SP6 مجموعة (AMBION). ونحن نوصي باستخدام نصف كميات عنصر رد الفعل.
2. تنقية عينة الحمض النووي الريبي مع هطول LiCl أو كلوروفورم الفينول كما هو موضح في تعليمات عدة.
3. تحديد تركيز مرنا باستخدام الامتصاصية، وضمان سلامة مرنا باستخدام الكهربائي للهلام، وتخزين العينة في ثلاثة أو أكثر من aliquots في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام. نحن لا ننصح متعددة تجميد أذاب دورات من مأخوذة مرنا.

5. في الفحص الجسم الحي من فقدان البديل من وظيفة

1. الحصول على الأجنة الزرد من التزاوج الزرد الطبيعية، والمحافظة عليها عند 28 درجة مئوية في الماء الجنين في 6 أو 10 أطباق سم.
2. إجراء جرعة منحنى استجابة morpholino لتقييم خصوصية النمط الظاهري، والكفاءة MO MO وسمية. حقن جرعة منحنى فيلا يقل عن ثلاثة تركيزات مختلفة بين 1-10 نانوغرام MO إلى 50-100 (1-4 مرحلة الخلية) الأجنة الزرد / دفعة. يجب المنظمات الأعضاء فعالة تؤدي إلى زيادة الجرعة التي تعتمد على نسبة من الأجنة المصابة في دفعة واحدة.
3. الأجنة النمط الظاهري في المرحلة التنموية المناسبة على أساس التعبير عن الجينات الزرد المستهدفة من الفائدة والمرحلة التي وسيراعى في النمط الظاهري ذات الصلة. قد يكون هذا إما كميا (مثل قياس بين الهياكل التشريحية) أو النوعية (على أساس معايير موحدة المظهري). سجل لجميع الحقن> 24 HPF: ينبغي أن يعامل الأجنة مع PTU (0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا في وسائل الإعلام الجنين) في 24 HPF إلى الحد الأقصى من تشكيل الخلايا الصباغية.
4. للصق تسد المنظمات الأعضاء، واختبار كفاءة MO عن طريق استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الجنين كله لست] في نقطة زمنية من التهديف المظهري، وتوليد [كدنا] وإجراء RT-PCR من الجين المستهدف باستخدام بادئات المرافقة الموقع المستهدف MO.
5. للتحقق من effic قمعiency من TB-MO، الحصاد كله لست] بروتين الجنين وإجراء immunoblotting لمقارنة مستويات البروتين المستهدفة مقابل السيطرة. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يستجيب للجميع الجينات المستهدفة لأن هناك محدودة عبر التفاعل لكثير من الأجسام المضادة للبروتينات التجارية الزرد. طريقتين غير المباشرة لإظهار MO خصوصية، ما يلي: أ) مما يدل على أن هناك تأثير تعتمد على الجرعة على النمط الظاهري؛ وب) تبين أن شارك في حقن مرنا wildtype مع TB-MO إنقاذ النمط الظاهري بكفاءة. لهذه الأسباب، فإننا نوصي مانع لصق عندما يكون ذلك ممكنا لأن كفاءة يمكن رصدها مباشرة.
6. إذا لوحظ النمط الظاهري انتقل إلى الخطوة 5.7، إذا لوحظ أي النمط الظاهري انتقل إلى الخطوة 6.1.
7. لالظواهر النوعية، حدد جرعة MO التي تتأثر 50-75٪ من الأجنة؛ للالظواهر الكمية، حدد جرعة MO في التدبير الذي المظهري يختلف كثيرا عن البرية من نوع (P <0.001). حقن دفعات جديدة من الزرد الإدارة الانتخابيةryos (1-4 مرحلة الخلية، ن = 50-100/batch) مع كوكتيل يحتوي على "الفحص" جرعة من MO ومنحنى الجرعة من مرنا WT الإنسان (تتراوح 10-200 مرنا خريج، وهذه جرعة كبيرة من overexpression ضمان أعلاه خط الأساس من أي نص واحد، وهو ما يمثل 0.25-0.5٪ من إجمالي مرنا بوليا في الجنين الزرد). ⁴
8. إجراء التهديف ملثمين من دفعات الحقن؛ اختيار جرعة مرنا WT مع الانقاذ الأكثر أهمية في المقارنة إلى MO وحده، وهذا هو "الاختبار" جرعة من مرنا.
9. حقن دفعات جديدة (1-4 مرحلة الخلية، ن = 50-100/batch) مع جرعة من فحص MO وجرعة مقايسة من مرنا الإنسان متحولة. الأجنة النمط الظاهري في المرحلة المناسبة، ومقارنة النتائج إلى WT الانقاذ مرنا الإنسان باستخدام اختبار الإحصائية المناسبة (اختبار t أو خي مربع). انظر الشكل 1 لنتائج وانتقل إلى الخطوة 7. حقن جرعات من فحص WT ومتحولة مرنا وحدها للسيطرة على الآثار السمية مرنا.

6. في الفحص الجسم الحي من البديل دومinant سلبي أو كسب وظيفة الآثار

1. إذا لوحظ عدم فقدان وظيفة النمط الظاهري (الخطوة 5.5) أو إذا مرنا متحولة يثير الظواهر لا تختلف كثيرا عن MO وحده (الخطوة 5.7)، وضخ منحنى الجرعة تتراوح 10-200 خريج WT مرنا الإنسان (ونحن نوصي 25، 50 ، و 100 خريج واختبار أولي) إلى دفعات الجنين (1-4 مرحلة الخلية؛ 50-100 الأجنة / دفعة).
2. في المرحلة المناسبة (انظر 5.3 أعلاه)، وإجراء التهديف المظهري، وتحديد أعلى جرعة التي لم يكن هناك عدد كبير من الأجنة الميتة إحصائيا و / أو المتأثرة بالمقارنة مع الضوابط uninjected. هذه هي الجرعة "فحص".
3. حقن جرعة مقايسة من مرنا الإنسان متحولة (1-4 مرحلة الخلية؛ 50-100 الأجنة / دفعة). الأجنة النمط الظاهري ومقارنة النتائج إلى التهديف من الجرعة مقايسة من WT حقن مرنا الإنسان أو MO تركيز مقايسة. انظر الشكل 1 لنتائج.
4. إذا كانت النتائج لا يمكن تمييزها عن MO، عاير مرنا متحولة الإنسان مرنا مع WTومقارنة WT الإنسان وحقن مرنا متحولة. تحسين الظواهر مع متحولة زائد WT دفعات مرنا حقن يشير إلى السلبية المهيمنة. أي تحسن يشير إلى وجود مكاسب من وظيفة.

7. تتكاثر في الجسم الحي اختبار النتائج

1. تكرار في المقايسات فيفو ما لا يقل عن ثلاث مرات.

8. دمج الزرد في البيانات الإمراضية الجسم الحي مع خطوط أخرى من الأدلة

1. مقارنة البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب المرضية الزرد إلى: البيانات الجينية ضمن النسب (إن وجد)، وبيانات السكان تردد السيطرة، في الدراسات المختبرية (المقايسات خلية مقرها الاستقرار البروتين، وتوطين الخلوية، مما يشير إلى الإخراج، أو النشاط الأنزيمي).

النتائج

اضطرابات المتنحية وPseudorecessive

أهداب الأولية هي هياكل شبه في كل مكان على خطة هيئة الفقارية التي تلعب دورا يشير الخلوية في مصائر خلية متعددة، بما في ذلك الانتشار، والاستقطاب، والتمايز، وصيانة الأنسجة. ⁵ الضعف هذه العضيات يؤدي إلى مجموعة واسعة من الاضطرابات الجينية البشرية التي يشار إليها مجتمعة كما ciliopathies. ^6،7 واحد هذا الكيان السريرية هي متلازمة بارديه-بيدل (BBS)، وهو اضطراب الأطفال multisystemic تتميز تنكس الشبكية، والسمنة، وقصور الغدد التناسلية، عنش؛ كثرة الأصابع، والفشل الكلوي. ⁷ تطور في الجسم الحي المقايسات الإمراض من أليل كان ضروريا لل BBS بسبب أ) هو اضطراب غير المتجانسة وراثيا التي تسببها التغيرات في المقام الأول nonsynonymous خاصة التي تحدث في لا يقل عن 17 جينات ^7-10؛ وب) الميراث قليل الجينات في> 25٪ من الأسر BBS، حيث وجود تغييرات متخالف في الثانيةBBS الجين (بالإضافة إلى الطفرات المتنحية السببية الأولية) يمكن أن تعدل انتفاذ السريرية والتعبيرية. عادة، مثل هذه الأليلات الثالثة هي التغييرات nonsynonymous متخالف من، من وجهة النظر الجينية، وإمكانات المسببة للأمراض غير واضحة، مما يستلزم التفسير الدقيق لتأثير بيولوجي على وظيفة البروتين. ^11-13

للتحقيق في إمكانية المسببة للأمراض من الطفرات تسهم في الحمل طفرية في BBS، اختبرنا في البداية كل التغييرات التي تم تحديدها في مغلطة BBS1 - BBS14. كلا نحن وغيرنا قد أظهرت أن فقدان بروتينات الجسم القاعدية يؤدي إلى التقلبات من قطبية الخلية مستو (PCP؛ إشارات WNT غير متعارف عليه). كما يظهر العيوب تمديد المتقاربة في الأجنة الزرد منتصف somitic ¹⁴ عن طريق هذا قراءات المظهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، ونحن وقد وجدت أن قمع الجينات BBS أسفرت عن محاور تقصير الجسم، somites أوسع وأرق، واسعة، notochords متلوى ^{15 <}/ sup> في (الشكل 2) العيوب تكون المعيدة قمع MO التي يسببها المنتجة، وشارك في حقن مرنا مع الإنسان انقاذ بشكل ملحوظ (وبتكاثر) هذه الظواهر كما سجلها ثلاثة مختلفة في طرق الجسم الحي. الاولى، سجل الأجنة الحية وفقا لمعايير النوعية المظهري (عادي، من الدرجة الأولى والدرجة الثانية، للحصول على تعريفات مفصلة من الطبقات المظهري انظر ^15). المقبل، ونحن quantitated الهجرة الخلية أثناء اكتفار (مرحلة النمو المبكر تتميز رقيق ونشر من طبقات الخلايا فوق الخلية صفار ¹⁶⁾ من خلال توظيف التتبع فلوريسئين لتصور الخلايا المهاجرة. أخيرا، قمنا بقياس طول الجسيدة الجذع في الأجنة لمدة تسعة الجسيدة في الموقع تهجين مع كوكتيل من krox20، pax2 وriboprobes myoD، التي شنت شقة للتحليل الصرفي.

وقد استخدمت هذه المنهجية لاختبار ما يزيد على 500 الأليلات في الفضاء طفرية الهدبية. في واحددراسة وحدها، في اختبار الجسم الحي من> 130 الأليلات أنتجت مجموعة كبيرة من عشرات المظهري؛ كما يتبين من بروتوكول لدينا (الشكل 1) كاملة الإنقاذ تم تصنيفها على أنها حميدة (لا يختلف كثيرا عن WT الانقاذ)، جزئية ينقذ تم تصنيفها على أنها hypomorphs (تحسنت بشكل ملحوظ من MO، ولكن أكثر شدة من WT الانقاذ)، تم تصنيف الفشل في الانقاذ لاغيا وظيفية (لا يختلف كثيرا عن MO)، والظواهر الناجمة عن متحولة مرنا وحده مقارنة MO صنفت على أنها السلبيات المهيمنة.

لقد قيمت أيضا حساسية وخصوصية في الجسم الحي فحص تكامل في الزرد. وأكد خصوصية من قبل المشترك عن طريق الحقن تعدد الأشكال الشائعة (> 5٪ تردد أليل طفيفة في السكان الأصحاء)؛ تم العثور على هذه الظواهر لإعطاء حميدة في 14/17 اختبار (> 82٪)، وأبدى حساسية لتكون 98٪ كما هو مبين بواسطة التوافق بين الجسم الحي في البيانات والحجج الوراثية كافية رس يعزو الأليل كما السببية في نسب BBS ¹⁷ وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت آثار المظهري باستخدام ثلاثة في تدابير الجسم الحي (التهديف الحية، وتتبع اكتفار، وISH morphometrics) تم التحقق من صحتها في المختبر باستخدام دراسات التعريب immunoblotting والخلوية. في حين أن تفسير هذه النتائج المطلوبة معرفة مسبقة آلية واحدة على الأقل من المرض والتسبب، ويوفر هذا المثال أدلة لإثبات فائدة ومتانة بروتوكول لدينا. لقد أيدت منذ لدينا في الجسم الحي التهديف مع خطوط أخرى متعددة من الأدلة التجريبية في الفرز طفرية متحيز ودراسة التحليل الوظيفي من TTC21B، وهو بروتين النقل intraflagellar إلى الوراء. ¹⁸

اضطرابات المهيمن

أطرافهم الزنار ضمور العضلات (LGMD) هي فئة مقهورة من ضمور العضلات، مما تسبب في بطء الترقي ضعف العضلات في الوركين والكتفين. هذا لي وراثياويتسبب مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات chanistically من قبل كل من الطفرات السائدة والمتنحية عبر sarcolemmal متعددة، الساركومير، حشوية، والبروتينات النووية. وبناء على عرض من الظواهر السريرية وأدلة على تورط العضلات من التصوير بالرنين المغناطيسي، ونحن التحقيق في سبب LGMD المهيمنة وجدت في الفنلندية، الولايات المتحدة، والأسر الايطالية ^19. تسلسل المرشحين الموضعية داخل مكان معين وكشف الطفرات في DNAJB6، جين ترميز المشترك كوصي من عائلة HSP70 أعرب عن اثنين على الأقل الإسوية لصق (النووية وحشوية) في البشر. للحصول على مزيد من نظرة ثاقبة DNAJB6 وظيفة وصلته LGMD، درسنا دورها في سلامة العضلات في الزرد. RT-PCR من الزرد ortholog (dnajb6b) الكشف عن التعبير في وقت مبكر من مرحلة خمس الجسيدة، الذي تبعه حقن الأجنة مع morpholino لصق تسد. في آخر 48 ساعة الإخصاب، وأظهرت التهديف ملثمين مفرزة من بطءألياف من نقطة الإدراج بهم. تم اختبار خصوصية هذا النمط الظاهري ثم مع الثاني غير متداخلة MO وانقاذ في وقت لاحق مع WT الإنسان DNAJB6 مرنا.

للاستعلام كيفية فقدان وظيفة DNAJB6 يؤدي إلى عيوب في سلامة العضلات، قدمنا ​​الطفرات مغلطة وجدت في المرضى في النصوص الإنسان من كل الأشكال الإسوية وحقن لهم في الأجنة الزرد. في حين حقن مرنا الإنسان WT لم تسفر عن النمط الظاهري ملموس، phenocopied هذه التغيرات فقدان الآثار ظيفة MO عندما هندسيا في حشوية، ولكن لا الإسوي النووية. وأعقب ذلك coinjection من المبالغ متساوي المولية من مرنا متحولة وWT، والتي أظهرت زيادة شدة النمط الظاهري العضلات، مما يشير إلى تأثير مهيمن. لاختبار هذه الفكرة، تم تنفيذ المزيد من الحقن خارجا مع تغيير نسب المولي من مرنا متحولة وWT. متسقة مع التنبؤ، وجود فائض من مرنا متحولة مقارنة مع WT الفتك يتسبب في الأجنة، في حين أنن تتجاوز WT أنتجت الإنقاذ زادت تدريجيا. وأعقب ذلك في التجارب المختبرية لتحديد خصائص oligimerization وتفاعلات البروتين ممكن. هذه أظهرت أن الطفرات يضعف النشاط antiaggregation من DNAJB6 حشوية وتتداخل مع دوران كل من متحولة وWT، فضلا عن التفاعل مع جزيء آخر، BAG3، التي هي أيضا ذات الصلة ميكانيكية حدوث LGMD، منذ LOF BAG3 يؤدي إلى شكل من الأطفال ضمور العضلات ^20. ثم سألنا عما إذا BAG3 يمكن أن تعدل النمط الظاهري الناجمة عن DNAJB6b متحولة في الزرد. في حين حقن WT BAG3 تنتج وحدها لا النمط الظاهري، coinjection مع DNAJB6 المسوخ زيادة كبيرة شدة المظهري، مما يوحي بأن BAG3 يلعب دورا في التوسط في تسببها مثل هذه المسوخ ^19.

	عابر الزرد نموذج	المسخ اسماك الزرد لاين	المعدلة وراثيا ماوس لاين
العمر من ظهور النمط الظاهري الإنسان قيد التحقيق	قبل الولادة الأطفال حديثي الولادة أطفال	قبل الولادة الأطفال حديثي الولادة أطفال	قبل الولادة الأطفال حديثي الولادة أطفال بالغ
الظواهر ممكنا	القحفي عضلي إنذار القلب كلوي الأوعية الدموية	القحفي عضلي إنذار القلب كلوي الأوعية الدموية	القحفي عضلي إنذار القلب كلوي الأوعية الدموية حسي الهيكل العظمي الحشوية السلوكية تنفسي الإنجابية الغدد الصماء الأيضية
الوقت حتى استخدام (منذ الولادة)	1-7 أيام	> 3 أشهر	> 6 أشهر
الإنتاجية	متوسطة وعالية	منخفض	منخفض
مزايا	القدرة على اختبار الطفرات محددة القدرة على توليد الضربة القاضية في النماذج القدرة على استخدام knockdowns morpholino صيانة منخفضة التكلفة	تقلب أقل تجريبية	أقرب العلاقة التطورية الحفاظ على هياكل الجهاز القدرة على الجينمعدل الضربة القاضية في النماذج

الجدول 1. مقارنة في النماذج الحية.

الجدول 2. أمثلة على النمذجة في الجسم الحي من dysmorphologies الإنسان. الظواهر المختلفة اختبارها بموجب البروتوكول المقدمة. قد تكون استخدمت مجموعة من قراءات المظهري وتقنيات التصور القائم على نوع من الاضطراب. انقر هنا لعرض جدول أكبر.

الشكل 1. في التجارب الفنية المجراة من المتغيرات nonsynonymous. نهج منتظم لاختبار وظيفي لجميعالانقليس من أهمية غير معروف أو الافتراض. ويتبع ضربة قاضية الجينات عبر morpholino حقن مكروي من خلال سلسلة من (CO) الحقن من كلا WT ومرنا الإنسان متحولة. التحليلات الإحصائية لنتائج المظهري إبلاغ المرضية أليل وظيفة الجزيئية. لفترة وجيزة، لفقدان اختبارات وظائف: إذا كان ضربة قاضية تنتج النمط الظاهري الذي يمكن انقاذ مكافئ من قبل مرنا متحولة وWT، وأليل من المرجح حميدة (الصندوق الأخضر). إذا كان الإنقاذ متحولة من النمط الظاهري ضربة قاضية لا يمكن تمييزه عن النمط الظاهري ضربة قاضية، وأليل هو لاغ وظيفية المرجح (المربع الأصفر). إذا كان الإنقاذ متحولة من النمط الظاهري ضربة قاضية هو أفضل إحصائيا من MO، لكن أسوأ من WT، وأليل من المحتمل أن يكون ناقص المفعول (الصندوق الأخضر) للاختبارات المهيمنة: إذا حقن مرنا متحولة ما يعادل ذلك من البرية من نوع مرنا وأليل قد تكون إما حميدة أو فقدان وظيفة، أو للمقايسة قد فشلت (الصندوق الأخضر). إذا حقن مرنا متحولة هو INDIS tinguishable من MO ضربة قاضية، من المحتمل تغيير وظيفة الجين المنتج في بعض الطريق. لتبين تغير في وظيفة، عاير مرنا متحولة مع من النوع البري مرنا. إذا كانت نتيجة هذه المعايرة لا يمكن تمييزه إلى البرية من نوع مرنا وحدها، والمنتج يستخدم البروتين متحولة البروتين من النوع البري باعتباره الركيزة، مما يدل على أن النمط الظاهري السلبية المهيمنة (المربع الأزرق). إذا كانت نتيجة هذه المعايرة لا يمكن تمييزه إلى مرنا متحولة وحدها، والمنتج بروتين متحولة لم يعد لديه بنفس وظيفة من نوع البرية، وبالتالي من المحتمل أن يكون الكسب من وظيفة (المربع الأزرق). إذا لم يعرض النمط الظاهري من MO ضربة قاضية، لكن لا الحاضر مع مرنا WT، يمكن أن يحدث مزيد من التجارب، وينبغي معاير مرنا الإنسان WT للحد من النمط الظاهري، ويمكن أيضا أن تستخدم كنقطة مجموعة جديدة. يمكن تقييم مزيد من مرنا الإنسان WT ومتحولة coinjection يعتمد على قدرة الإنقاذ من متحولة (المربع الوردي).وآخرون = "_blank"> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

الشكل 2. التقييم الكمي والنوعي للMKS1 الطفرات التي رصدت في البشر. العيوب التنموية في mks1 الأجنة morphant. استنادا إلى شدة، تم تصنيف الظواهر إلى ثلاث مجموعات. وترد أمثلة من كل فئة (أ)، وتم تبويب انتشارها داخل الفوج الجنين بهم (ن = 100-160 الأجنة) (لا يظهر). حقن الأجنة MO مع فئة كان لي الظواهر بشكل صارخ مورفولوجيا العادي ولكن كانت أقصر، مع الأنسجة الجنينية المفرط على صفار البيض مقارنة للسيطرة على الأجنة حقن في نفس العمر somitic (8-9 somites). وقد ضعفت morphants الدرجة الثانية، قصيرة وضعيفة قد وضعت الرأس والذيل الهياكل، وتفتقر إلى الوضوح بالإضافة إلى ذلك somiticوالتماثل. وفئة الأجنة III بشدة تأخر مع somites متطورة وممسوخ، بتموجات notochords، وعادة لم تنج الماضي المرحلة 10 الجسيدة. شارك في حقن الإنسان MKS1 مرنا انقاذ كل من هذه العيوب، مما يدل على خصوصية الظواهر إلى mks1 قمع. التهجين في الموقع من الأجنة في مرحلة 11-الجسيدة (± 1 الجسيدة) ملطخة krox20، pax2 وriboprobes myoD (ب، ج ). وتم قياس كمية الظواهر بواسطة قياسات من الأول إلى الجسيدة ملموس الأخير من كل جنين (الأسهم)، كميا في ج. الرقم تكييفها مع إذن من ^15.

الشكل (3). أمثلة على النمذجة في الجسم الحي من dysmorphology الإنسان. (أ) dysmorphology الجمجمة. مرنا مراقبة حقن الجنين (يسار) ومتحولة الجنين حقن (يمين) ملطخة زرقة الألسيان في 5 DPF. المسوخ مرنا حقن الأجنة عرض رؤساء ولا سيما الصغيرة وممسوخ مع الفوضى العامة لهيكل عظمي غضروفي القحفي بما في ذلك الأقواس خيشومي مفلطحة والمفقودين أو هياكل تالف. (ب) مايكرو / رأس كبير. uninjected مراقبة الجنين (يسار) وkctd13 الجنين MO حقن (يمين) في 5 DPF. عرض Morphants اتساع الرأس، كما يراها المسافة بين العينين. ²¹ (ج) سلامة الأوعية الدموية مخفض. uninjected مراقبة الجنين (أعلى) والمهندس الجنين MO حقن (القاع) التقط باستخدام المجهر مضان في 2 DPF في fli1: EGFP خط مراسل المعدلة وراثيا. عرض Morphants ضعاف تنتشر الأوعية بين القطع والهياكل الأوعية الدموية الأخرى. ⁴¹ (د) غيرت حلقات القلب. التهجين في الموقع من يونيالأجنة من النوع البري njected (يسار) تظهر التعبير SPAW في اليسار الجانبي لوحة الأديم المتوسط، في حين أظهرت ccdc39 الأجنة morphant الثنائية (يمين) أو، في معظم الحالات، لا يمكن الكشف عنها التعبير SPAW (لا يظهر) ⁴³ (ه) الخراجات الكلى. Uninjected جنين WT (أعلى) وift80 morphant (القاع). عرض Morphants الخراجات الكبيرة الكلى (السهم)، وذمة التامور (رأس السهم) وذيل كرة لولبية ⁴⁴ (و) الحد من الترشيح الكبيبي. التصور فلوري من عنصر تحكم حقن الجنين (أعلى) وift80 morphant (القاع) 24 ساعة بعد حقن رودامين ديكستران في القلب. تم اجلاء تماما تقريبا يشتت مضان في جميع أنحاء منظومة الأوعية الدموية والكلى كما رأينا الغياب الكامل للمضان في عنصر التحكم. يعرض morphant الفلورسنت ديكستران الثابتة، مما يشير إلى انخفاض الترشيح الكبيبي. ⁴⁶ (ز) ضمور العضلات. WT DNAJB6 السيدNA الأجنة حقن (أعلى) تظهر myofibers بطيئة طبيعية تمتد و somites عادة بين myosepta المجاورة على النحو الذي يحدده المناعية استخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة الميوسين البطيء. متحولة DNAJBb (القاع) أظهرت جزئية لإكمال مفرزة من myofibers من myosepta في واحدة أو متعددة somites ¹⁹ (ح) الجسيدة زاوية. تضخيم عدد المشاهدات الحية الوحشي للسيطرة uninjected (أعلى) أو kif7 morphants (القاع) التقط في 30 HPF. Morphants عرض somites على شكل غير طبيعي، وتعزى إلى خارج الرحم القنفذ يشير في بضعة عضلية الزرد ⁴⁷

جميع الأرقام تكييفها مع إذن.

Discussion

الطرق الموضحة هنا تمثل بروتوكول عام ينطبق على فحص التغيرات nonsynonymous يرتبط مع مجموعة متنوعة من الظواهر مرض وراثي الإنسان (الجدول 2، الشكل 3). وقد أثبتت نهجنا مفيدة لتقييم التأثير المحتمل للتغير في الظواهر المرض، والمساعدة في تشريح آليات المرض (مثل مساهمة الطفرات السلبية المهيمنة لمتلازمة بارديه-بيدل، وهو اضطراب وراثي جسمي مقهور في المقام الأول ^17). حتى الآن، من خلال وضع شجرة القرارات المقدمة، قمنا غرار بتكلفة معقولة والوقت ما يزيد على 200 الجينات المرتبطة سببيا مع اضطرابات وراثية، إلى وجود فائض من 1،000 الأليلات.

على الرغم من أن لم تناقش بالتفصيل هنا، لقد أظهرنا أيضا أن هذه الأساليب هي المناسبة لنمذجة أنواع أخرى من الآفات الجينية، مثل التنوع في عدد النسخ (التنوعات في عدد النسخ)، وكذلك والوراثية التفاعلات. التحليلات لمثل هذه الأحداث هي خارجة عن نطاقوصف الطريقة الحالية، على الرغم من أنها تعتمد بشكل أساسي على نفس مبدأ الاختبار المنهجي للجينات مرشحة (بما في ذلك زوج من الجينات في وقت واحد حقن) لتحديد الاستقراء أو تفاقم الظواهر مناسبة سريريا. على سبيل المثال، لتوضيح أي من الجينات 29 في 16p11.2 CNV قد تكون ذات صلة إلى صغر الرأس الملحوظة لوحظ في المرضى الذين يعانون من الازدواجية من 660 قطعة الجيني كيلوبايت، mRNAs والمقابلة لكل من الجينات 29 ضمن القطعة تم حقن ورئيس أجريت قياسات حجم في 2 و 5 DPF DPF، وكشف عن مساهمة كبيرة من نسخة واحدة، KCTD13 ²¹ بالإضافة إلى ذلك، وقد استخدمنا هذا النموذج للتفاعلات وراثية فحص الآفات الجيني في المرضى الذين يعانون من متلازمة بارديه على حد سواء-بيدل والمرض هيرشسبرونغ ²² من خلال المقارنة بين MO قمع الجينات المسببة للاثنين هويات السريرية بشكل منفصل في وقت واحد، وكنا قادرين على تحديد النمط الظاهري الناتج كما باينانوغرام تفاعل التآزر بدلا من مجرد شدة المضافة.

على الرغم من قيامه بإنشاء حساسية عالية (98٪) والنوعية (> 82٪) عن المتغيرات التي تسهم في ciliopathies ^17، ليس لدينا حتى الآن بيانات كافية لتحديد ما إذا كانت هذه قابلة للتعميم لجميع قراءات المظهري في نماذج الزرد. وتوقع عدد كبير من الأليلات، أن تفعل ذلك وراثيا لتكون إما حميدة أو المسببة للأمراض، يجب أن يتم اختبار داخل كل فئة المظهري. وسوف يكون هذا أهمية خاصة لتنفيذ مثل هذه المقايسات في إعداد سريرية، حيث تفسير وظيفي من VUSs يمكن إبلاغ التشخيص والتدبير العلاجي فقط إذا فهم قوية من ايجابيات كاذبة والسلبيات كاذبة يمكن أن تصاحب تقديم هذه النتائج إلى الأطباء والمرضى. ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب تسهم إسهاما كبيرا نحو فهم أفضل لطبيعة المرض الوراثية البشرية. ونحن نتوقع أن هذه النماذج لا إلا أن تكون بمثابة founكما سيتم توظيف dation لتحسين تفسير المعلومات الجينية السريرية، ولكن كنماذج المفيد إجراء شاشات العلاجية. في البيانات الجسم الحي كما يمكن مقارنة في سيليكون والتوقعات الحسابية من مصادر مثل PolyPhen ^23، فرزت ^24، تعدد الأشكال وGO ^25، أو MutPred ²⁶ لإظهار التوافق. لاحظ أنه تم العثور عليها في دراسة سابقة للتنبؤ قواعد البيانات النيوكلوتايد & GO وMutPred ليكون أكثر دقة، مع دقة تصل إلى 0.82 و 0.81 فقط، على التوالي. ²⁷

على الرغم من أننا قد أوجز متانة هذه الأساليب لمجموعة فرعية من العيوب التشريحية للأطفال (الجدول 2، الشكل 3)، وبعض الظواهر هي أقل لين العريكة بواسطة هذه الأساليب. على الرغم من وجود بعض الاستثناءات، وهناك ثلاث فئات رئيسية من اضطرابات غير قابلة للبروتوكول لدينا. اضطرابات يظهر في مرحلة الكهولة (مثل مرض باركنسون) تمثل تحديا لنموذج في نظام الجنينية. بطء بروغression الظواهر التنكسية (مثل الخرف الجبهي) قد تتطلب وقتا أكثر مما النافذة DPF سبعة من النشاط MO لإنتاج النمط الظاهري. تكنولوجيات ضربة قاضية الجينات الأخرى مثل رني وسيرنا متاحة لتتداخل مع أو تحط من الجين المستهدف، ولكن ثبت أن لا شيء غير محددة ومستقرة، وغير سامة، أو طويلة الأمد كما المنظمات الأعضاء ^28، مما يحد أيضا الإطار الزمني لphenotyping. ثالثا، بعض الهياكل الفقارية، مثل الرئة الثدييات، لا يكون لها هيكل orthologous بما فيه الكفاية في الجنين الزرد. قدمنا ​​أيضا خطة طوارئ اقترح للتحقيق في تلك الحالات التي WT حقن مرنا الإنسان يؤدي إلى النمط الظاهري، على الرغم من أننا نحذر هذه حالة غير عادية وغير مرغوب فيه.

قد بعض الظواهر المرض ثم تتطلب درجة أكبر من التجريد وتأجير الأرحام. فمن الممكن أن وظيفة الجين قد تباعدت بما فيه الكفاية لإضعاف التشابه المظهري بين نموذج و TRUE النمط الظاهري، أو أن الزرد علم وظائف الأعضاء يعقد بطبيعتها آثار المرض التي يسببها. في مثل هذه الحالات، فإننا نقترح مزيد من تشريح النمط الظاهري أنتجت قبل الفصل. لقد أنتجنا بعض الأمثلة الناجحة التي تم غرار الظواهر الإشكالية لهذا الاختبار في الأجنة الزرد. على سبيل المثال، والطفرات في TCF8، ويعاير الجين المرتبط فوكس ضمور القرنية (FCD)، وذلك باستخدام بروتوكول لدينا باستخدام العيوب تكون المعيدة باعتبارها قراءات المظهري بديلة استنادا إلى الأدوار المعروفة لهذا النص في التنمية في وقت مبكر. ²⁹ وفي حالات أخرى، مثل كما الحثل العضلي الذي يصيب البالغين التي تسببها طفرات في DNAJB6، كنا قادرين على توليد الظواهر ليف عضلي في الأجنة 5dpf على الرغم من حقيقة أن البشر هم مجردة من العضلات ملموس في علم الأمراض من العقود الثلاثة أو الأربعة الأولى من الحياة. ¹⁹

بالإضافة إلى نماذج متحولة عابر المعروضة هنا، اتخذت الآخرين أيضا ADVANTAجنرال الكتريك لهذا النظام عابرة إلى نموذج المرض الإنسان في مجموعة متنوعة من أجهزة الجسم. في مثال واحد، كان على غرار التهاب الشبكية الصباغي في الزرد من قبل ضربة قاضية للRP2 الجينات، مما يؤدي إلى موت الخلايا في شبكية العين وانخفاض التصفيح الشبكية. أدى الانقاذ مع الإنسان مرنا من النوع البري في التنمية من جميع الطبقات الثلاث من التصفيح في شبكية العين، في حين أن أربعة من أصل خمسة mRNAs ومتحولة فشلت في إنقاذ ³⁰ على الرغم من أن هذا النموذج من اضطراب الحواس البشرية يستند إلى النمط الظاهري المورفولوجية، فمن الممكن أيضا أن استجابة مقايسة للمؤثرات مثل جفل الصوتية أو prepulse تثبيط ⁴⁷

مؤخرا، تم استخدام نموذج الزرد للتحقيق الزهايمر المرضية المرض من خلال بروتين اميلويد السلائف. أظهرت ³¹ المؤلفان أن تسبب ضربة قاضية الجينات ضعاف ثمرة محواري الخلايا العصبية الحركية، والتي يمكن انقاذ مع مرنا الإنسان. وقد أثبت هذا النموذج لتكون خاصة بالمعلومات، كما عرض نماذج الماوس فقط phenot خفيةypes (ضربة قاضية واحدة) أو الفتك بعد الولادة (ضربة قاضية مزدوجة). ساعدت القدرة على تقييم الأجنة الزرد في الجسم الحي خلال مراحل تطوره لتبين تأثير المسببة للأمراض انخفاض بروتين اميلويد السلائف، وكذلك أدلة مباشرة على أن يكون البروتين يتطلب مجال خارج الخلية وبين الخلايا من أجل وظيفة مناسبة. وتشمل نماذج بارزة أخرى من ضمور العضلات إضافية ^32، الماس Blackfan فقر الدم ^33، آكسينفيلد-Reiger متلازمة (تطوير العين والجمجمة) ^34، مرض التهاب الأمعاء ³⁵ (نشاط مضاد للجراثيم)، مرض باركنسون ³⁶ (الخلايا العصبية وفقدان تحرك)، ومصادرة ³⁷ (استسقاء الرأس وفرط النشاط).

أكثر شيوعا هي خطوط الزرد متحولة التي ثبت أيضا أن ألخص النمط الظاهري الأمراض التي تصيب البشر. استعرضت في ^1،38، وتشمل نماذج سرطان الدم، سرطان الجلد، بعضلة القلب المتوسعة، ضمور العضلات دوشين،وغيرها الكثير.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S, M0530L
DpnI restriction endonuclease	NEB	R0176L, R0176S
Max Efficiency DH5α competent cells	Invitrogen	18258-012
Big Dye Terminator	Applied Biosystems	4337455
mMESSAGE mMACHINE Kit	Invitrogen	AM1340, AM1344, AM1348
Morpholino	Gene-Tools	n/a
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629	Prepare as 0.003% PTU in embryo media
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%
Tricaine methane sulfonate	Western Chemical	N/A	For anesthetization and euthanasia
Equipment
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler	BioRad	Any equivalent thermal cycler
Nano Drop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
SMZ 745T Stereomicroscope	Nikon
AZ100 Stereomicroscope	Nikon
DS Fi1 Digital Camera	Nikon	For color/fluorescent imaging
DS QiMC Digital Camera	Nikon	For black/white imaging
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software	NIS- Elements