Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Özet

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve özgül In vivo Insan patolojisinde varyasyon yorumlamak için ölçülür. WT ve mutant insan mRNA ve morfolino (MO) antisens oligonükleotitler mikroenjeksiyon yoluyla geçici genetik manipülasyon insan gelişim bozuklukları bağlamında özel olarak hızlı bir şekilde, özellikle patojen tahlilinde mutasyonlar, ama bunlarla zebrabalıkları gelişen embriyonun izlenebilirlik koşum.

Özet

Burada, zebrabalıkları in vivo tamamlama kullanarak potansiyel klinik olarak anlamlı bir değişiklik nonsynonymous sorgulamak için testlerin geliştirilmesi için yöntemler sunar. Zebra balığı (Danio rerio) kendi deneysel tractability nedeniyle yararlı bir hayvan sistemi olan, embriyolar, basit görüntülenmesini sağlamak hızlı bir gelişme ex vivo geçmesi şeffaf, ve genetik olarak manipüle edilebilir Bu açıdan embriyogenezin analizinde önemli gelişmeler için izin ^1,. moleküler süreçler ve morfogenetik sinyal. Birlikte ele alındığında, bu omurgalı modelin avantajları pediatrik hastalık gelişim kusurları modelleme için Zebra balığı son derece mükellef yapmak, ve bazı durumlarda, erişkin başlangıçlı bozukluklar. Zebrabalıkları genom insanlarda çok (orthologous ~% 70) o ile korunmuş olduğu için, bu zebrabalıkları insan hastalık durumları özetlemek mümkündür. Bu mutant insan m enjeksiyon yoluyla gerçekleştirilirNegatif baskın veya fonksiyon allel kazanç veya fonksiyon çeşitleri kaybı taklit genlerin bastırmak için morfolino (MO) antisens oligonükleotidler kullanımı ikna etmek için RNA. Şapkalı insan mRNA ile MO bağlı fenotipleri tamamlama sayesinde, bizim yaklaşım ölçülebilir, fizyolojik ilgili fenotip kurtarmak için mutant mRNA yeteneğine dayalı insan proteini dizisi mutasyonların zararlı etkisi yorumlanması sağlar. Insan hastalık allel modelleme MO ve / veya 1-4 hücreli aşamada insan mRNA ve yedi gün sonra döllenme (dpf) kadar fenotipleme ile Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon yoluyla gerçekleşir. Aşağıdaki protokol gösterildiği gibi Bu genel strateji, hastalık fenotipleri geniş bir uzatılabilir. Biz morfogenetik sinyalizasyon, kraniofasial, kalp, damar bütünlüğü, böbrek fonksiyonları ve iskelet kası bozukluğu fenotipleri, hem de başkaları için kurulan modelleri sunuyoruz.

Giriş

Bir genotip için öngörü klinik değerinin genetik bilgi ve atama fonksiyonel yorumlanması tıbbi genetik büyük bir sorun temsil eder ve genom dizileme ve hızlandırılması teknik ve ekonomik fizibilite ile giderek daha dokunaklı hale gelmektedir. Bu nedenle, hastada bilinmeyen önemi türevleri (VUS) ve patojenite test etmek için yeni paradigmalar geliştirmek ve uygulamak gereklidir. Bu testler daha sonra zaman ve maliyet-etkin, doğru olmalıdır, ve liman potansiyel klinik programı için bir geçiş katalize.

Fareyi geleneksel insan hastalığı modelleme alanında tercih edilen bir araçtır olsa da, Zebra balığı bir bilimsel ve ekonomik olumlu vekil olarak ortaya çıkmaktadır. Fare aksine, Zebra balığı biyoloji gelişmekte olan patolojilerin gerçek zamanlı görüntüleme sağlar embriyo optik netlik yardımıyla tüm gelişim aşamaları, kolay ve zamanında erişim sağlar. ^{1 mutant Zebra balığı hatlarının nispeten yeni nesil fonksiyonel çalışmalarda birçok kişi tarafından kullanılan ek test ve modelleme seçenekleri, sağlamıştır, ancak bu teknoloji (1,38 gözden) sınırlı olmak üzere devam ediyor. Sadece elde etmek zahmetli belirli mutasyonların knock-ins ile genetik mutantlar, aynı zamanda tek bir gen içinde mutasyonlar bir dizi test için orta veya yüksek verimlilik analizi için uygun değildir. Önemlisi testleri tek bir paketi miras modu bilgilendirmek için önemlidir hücresel düzeyde (fonksiyonu vs fonksiyonu kazanç örneğin kaybı), de alel patojenik potansiyeli için sadece bilgi vermek değil, aynı zamanda etki yönünü için olabilir ailelerde, özellikle küçük insan soy ağacı genetik iletim modu hakkında sınırlı bilgi liman. Kullanılabilir fare ve Zebra balığı modellerin kullandığı daha Karşılaştırma için, Tablo 1.}

Ayrıca dikkat edinyeniden Zebra balığı model sistem doğasında sınırlamalar vardır. Rağmen D. rerio organ sistemlerinin hızlı bir başlangıç ​​gelişme var, cinsel olgunluğa yaklaşık üç ay gerektirir. Bu nedenle, doğum öncesi ve pediatrik başlangıçlı bozukluklar bu geçici ifade modele en uygun. Büyük bir kimyasal bileşik ekranlar yürütülmesi için idealdir da, genetik mutantların kullanılmasını katkı nonsynonymous türevleri binlerce sistematik olarak test için uygun değildir, ve pediatrik bozukluklarda tespit olmaya devam etmektedir.

Tamamlama testleri korunmuş gelişim süreçleri için gerekli molekülleri için özellikle çok, bu deneysel tractability, homoloji yüksek, insan ve Zebra balığı proteinler arasındaki fonksiyonunun korunması yararlanmak burada açıklanan. Şekil 1 çeşitli alel etkileri için test ve kimlik stratejisi özetliyor. Her iki fonksiyon kaybı (LOF) ve baskın deneyleri yapılabilir. LOF için, deney bir morfolino demonte ile ilgi gen baskılanması ve soruşturma altında klinik fenotip ile ilgili olabilir fenotipleri için Assaying ile başlar. Ya da genellikle bir ya dahil uyararak, bir bağlantı kavşağı üzerinde MO koyarak yapıştırma ile müdahale ederek, bastırma ya da yakın Zebra balığı odağı (tbMO çeviri engelleyici morfolino) ve öteleme başlangıç ​​site MO hedefleyerek çeviri engelleyerek ya elde edilebilir intron veya anormal ekson (; SBMO ekleme engelleme morfolino) atlama.

Daha sonra, orthologous insan transkript milli mRNA tanıtıldı ve fenotip ölçülebilir kurtarma ölçülür. Tahlil kurulduktan sonra, insan mesajında ​​aday Mütasyonların ve WT insan mRNA ile aynı verimle MO-kaynaklı fenotip kurtarmak için kabiliyeti açısından tahlil edilebilir. Tersine, aday için dominant alel, insan mRNA (ancak MO) introduc olduğubaskın bir etkiye sahip testi mutasyonların giriş insan klinik durumda gözlenen benzer fenotipleri neden olacaktır ise WT insan mRNA fena halde, Zebra balığı anatomi ve fizyoloji etkilemez bir beklenti ile ed. Bu deney baskın etkisi fonksiyonunun bir kazanç (GOF) veya WT ve mutant insan mRNA harmanlayarak bir dominant-negatif mekanizma ile oluşup oluşmadığını incelemek için ince taneli daha olabilir; GOF etkinlikler için, WT insan mRNA ek olması bekleniyor alakasız, WT ve mutant mRNA karıştırma dominant-negatif aleller için ise mutant mesaj tarafından uyarılan fenotip şiddetini değiştirmek gerekir. Her durumda, öneririz enjeksiyon tüm kombinasyonları (MO mutant insan mRNA vb morfolino vs WT insan mRNA ile tercihen embriyoların aynı kavrama (bkz. Şekil 1) içinde yapılabilir şöyle yorumlanması olduğunu.:

LOF testleri için:

• Eğer demontemutant ve WT mRNA tarafından eşdeğer kurtarıldı edilebilir bir fenotip üreten, alel olasılıkla iyi huylu.
• Demonte fenotip mutant kurtarma demonte fenotip kendisinden ayırt edilemez ise, alel olası bir fonksiyonel null. Deney gerçek boş değerlere (hiçbir fonksiyonel protein) ve hiçbir kurtarma kapasitesine sahip ultra protein aktivite düzeyleri arasında ayrım olamaz.
• Demonte fenotip mutant kurtarma istatistiksel MO daha iyi, ancak WT daha kötü ise bu sonuç fonksiyonun kısmi kaybı gösterdiği gibi, alel olasılıkla bir hypomorph olduğunu.

Baskın testleri için:

• Hiçbir demonte fenotip, ancak WT mRNA enjeksiyon bir fenotip üretir deney (bkz. aşağıda) devam etmek ise, bir acil durum planı kullanılmalıdır.
• WT mRNA hiçbir demonte fenotip ve enjeksiyon yok ise fenotip üreten, deney her zamanki gibi devam eder.
• Eğer enjeksiyonmutant mRNA yabani tip mRNA eşdeğerdir arasında alel iyi huylu ya da fonksiyon kaybı ya olabilir veya test başarısız olabilir. Bu da deney bu seçenekleri arasında ayrım gerektirir.
• Mutant mRNA enjeksiyon MO demonte ayırt edilemez ise, gen ürününün işlevi muhtemel bir şekilde değişir. Işlev değişikliği ayırt etmek için, vahşi tip mRNA mutant mRNA titrasyon yapılmalıdır.
• Bu titrasyon sonucu tek başına yabani tip mRNA ayırt edilemez ise, bu etkisi titrasyon miktarı ile farklılaştığı gibi mutant protein ürünü, bir alt-tabaka olarak yaban-tip protein kullanır gösterilmiştir. Bu, bir baskın negatif fenotipi gösterir.
• Bu titrasyon sonucu tek başına mutant mRNA ayırt edilemez ise, mutant protein ürünü artık, vahşi tip ile aynı işleve sahip olduğu gösterilmiştir ve bu nedenle vahşi-tip protein ürün ön miktarı etkilenmezgönderdi. Bu alel fonksiyon olası artışı olduğunu göstermektedir.

Acil durum planı:

• Hiçbir fenotip MO demonte gelen sunar, ancak WT mRNA ile mevcut olursa bu durum ideal olmadığını vurgulamak rağmen, daha fazla deney, oluşabilir. WT insan mRNA fenotip en aza indirmek için titre edilmelidir, ve aynı zamanda, yeni bir set noktası olarak kullanılabilir. WT ve mutant insan mRNA ayrıntılı gösteren plasmaidlerin birlikte enjeksiyonu mutantının tahlisiye yeteneğine dayalı olarak değerlendirilebilir.

Protokol

1. Biyoinformatik Analizi

1. Ilgi, insan geni bir Zebra balığı ortolog'un olup olmadığını, ve eğer öyleyse, kaç kopya. Biz karşılıklı BLAST (tavsiye http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Zebra balığı genom karşı insan protein) ve insan genomu karşı vurmak en iyi Zebra balığı sonraki ŞOK. Gerçek anlatımının her durumda en iyi hit olacaktır.
2. Insan geninin açık okuma çerçevesi (ORF) boyutunu belirler. 6 kb daha uzun ise, bu model için uzun şablonlar in vitro transkripsiyon kaliteli sınırlamaları şu anda dirençli olduğunu.
3. PCS2 olarak insan ORF + vektör omurgası (ya da 5 'transkripsiyon SP6 sitesi ve 3' poli A sinyali ile eş vektörü) içeren bir yapı elde edilir ya da oluşturur.
4. Hedeflenen Zebra balığı genin ekleme veya çeviri engellemek için bir MO tasarlayın. Birden çok kopya Zebra balığı genom, orada bulunmuyorsae iki seçenek vardır: Ek katille bir) tasarımı, veya b) tam kopyaları arasında korunmuş bir splice site belirlenmesi tek MO etkili olabilir hangi karşı. Bazı yayınlanan MO dizileri mevcuttur www.zfin.org .

2. Gelişmekte Zebra balığı Embriyo İfade Analizi

1. Zebra balığı ortolog'un fenotipik okuma ile ilgili bir uzaysal bağlamda ifade olup olmadığını belirleyin. Hiçbir ifade veri ilgi gen için varsa, bütün Zebra balığı embriyolarının veya in situ hibridizasyon cDNA kullanarak (RT)-PCR ters transkripsiyon yapmak. ^(2,3 bakınız).

3. Site-directed mutagenesis

1. Merkezinde arzu edilen mutasyonu ile uzunlukta tasarım mutagenez primerler 25-45 bazlar,. Astar erime sıcaklığından daha yüksek veya 78 ° C 'ye eşit olmalıdır Tersi tavlama için bir ileri ve geri mutasyon astar Tasarımplazmid iplikçikleri.
2. ORF sonrası mutagenez dizisi onay için astar elde, bu tüm ORF kapsayacak şekilde ~ 300 baz çifti bölümleri üzerinde kiremit olmalıdır.
3. 95 ° C de 30 saniye, 2: 95 ° C 30 sn, 3: (1 aşağıdaki gibi, bir hi-fi polimeraz döngüsü ve Mutagenez reaksiyonu monte 55 ° C 1 dakika, 4: 68 ° C'de 6 dakika, 5: Go 2 18x, 6: 4 ° C sonsuza kadar, 7: sonu).
4. 2 saat 37 ° C'de inkübe; baraj metil şablonu kaldırmak için reaksiyon başına 1 ul DPNI kısıtlama endonükleaz ekleyin.
5. Standart protokollere göre 20 ul yeterli hücrelerini içerisine yerleştirilebilir mutagenez reaksiyonunun 2 ul dönüşümü.
6. 3-4 koloniler almak ve uygun antibiyotik içeren LB medya 5 ml aşılamak. 225 rpm 37 ° C gecede çalkalayın.
7. Miniprep DNA ve konsantrasyonunun belirlenmesi.
8. Dizi mutasyon sitenin ilgi mutasyon varlığını doğrulamak için.
9. Dizisi bütünlüğünü onaylamak için dizisi tüm ORF.

4.. In vitro mRNA transkripsiyonunu

1. Bir Lineerleştirilmiş pCS2 + şablon kullanarak, mMessage mMachine SP6 kiti (Ambion) kullanarak kaplı mRNA oluşturur. Biz reaksiyon bileşeni miktarda yarısı kullanmanızı öneririz.
2. Kit kılavuzunda açıklandığı gibi LiCl yağış veya fenol kloroform ile RNA örnek arındırın.
3. Absorbans kullanarak mRNA konsantrasyonu belirleyin, jel elektroforezi kullanarak mRNA bütünlüğünü sağlamak, ve kullanıma hazır olana kadar -80 ° C de üç veya daha fazla hacimde örnek saklayın. Biz mRNA hacimde birden fazla donma-çözülme döngüleri önermiyoruz.

5. Fonksiyon Varyant kaybı in vivo Tahlil

1. Doğal Zebra balığı çiftleşmelerin Zebra balığı embriyolarının elde ve ° C embriyo suda 6 veya 10 cm yemekleri 28 de onları korumak.
2. Fenotip özgüllük, MO verimlilik ve MO toksisite değerlendirmek için bir morfolino doz yanıt eğrisi Davranış. De bir doz eğrisi enjekte50-100 (1-4 hücreli aşamasında) Zebra balığı embriyolarının / toplu içine 1-10 ng MO arasında en üç farklı konsantrasyonları. Verimli Mos toplu etkilenen embriyo oranında doza bağımlı bir artışa neden olmalıdır.
3. Uygun gelişim aşamasında fenotip embriyo ilgi ve ilgili bir fenotip görülecektir hangi sahne hedeflenen Zebra balığı gen ifadesi dayalı. Bu da (standart fenotipik kriterlere göre) kantitatif (örneğin anatomik yapılar arasında bir ölçüm olarak) veya nitel olabilir. Tüm enjeksiyonlar> 24 skorlu HPF: melanosit embriyo oluşumu fazla azalma ile 24 hpf propiltiyourasil'in (0.003% 1-fenil-2-tioüre embriyo ortam içinde) ile muamele edilmelidir.
4. Bütün embriyo elde edilen toplam RNA ayıklayarak bağlayıcı engelleme MOS testi MO verim fenotipik puanlama zaman noktasında lizatları için, cDNA 'sı jenere ve MO hedef site komşu tetikleyiciler kullanılarak hedef genin RT-PCR yürütmek.
5. Bastırılması effic doğrulamak içinBir tb-MO, hasat bütün embriyo protein lizatlarının iency ve hedeflenen protein karşı kontrol düzeylerini karşılaştırmaktır immün yapmak. Zebrabalıkları proteinler için birçok ticari antikorlar için çapraz-reaktivite sınırlı olduğundan Ancak, bu yaklaşım, her hedef gen için uygun değildir. MO spesifite gösteren iki dolaylı yöntem, aşağıdakileri içerir: a) fenotipi üzerinde doza bağımlı bir etkisi olduğunu gösteren ve b) TB-MO ile vahşi tip mRNA birlikte-enjeksiyon verimli bir fenotip gösteren kurtarır. Mümkün verimliliği doğrudan izlenebilir, çünkü bu nedenlerden dolayı, biz bir ekleme engelleyici tavsiye ederiz.
6. Bir fenotip 5.7 adıma geçin gözlenirse hiçbir fenotip görülmektedir ise, 6.1 adıma geçin.
7. Nitel fenotip için embriyolar,% 50-75 etkilendiği bir MO doz seçmek; kantitatif fenotip için, fenotipik ölçümü (p <0.001), vahşi tip önemli ölçüde farklı olduğu bir MO doz seçin. Zebra balığı emb yeni gruplar enjekteMO "test" doz ve insan WT mRNA (10-200 pg mRNA kadar bir doz eğrisi içeren bir kokteyl ile; ryos (n = 50-100/batch 1-4 hücreli aşamasında); bu doz yukarıda önemli aşırı sağlamak bir Zebra balığı embriyo toplam poliA mRNA 0.25-0.5% temsil eden tek bir transkript taban çizgisi,). ⁴
8. Enjeksiyon gruplar arasında maskeli puanlama yapması; MO yalnız ile karşılaştırıldığında en önemli kurtarma ile WT mRNA doz seçmek ve bu mRNA'nın "test" dozdur.
9. MO test dozu ve mutant insan mRNA test dozu ile, yeni gruplar (n = 50-100/batch 1-4 hücreli aşamasında) enjekte edilir. Fenotip uygun aşamasında embriyo ve uygun bir istatistik testi (t-testi veya ki-kare) kullanarak WT insan mRNA kurtarmaya karşılaştırın. Sonuçlar için Bkz: Şekil 1 ve 7. adıma geçin. Tahlil WT doz ve mRNA zehirlenme etkileri kontrol etmek için tek başına mutant mRNA enjekte edilir.

6.. Varyant Dom, in vivo analizFonksiyon Etkilerinin kalemdir Negatif veya Kazanç

1. Fonksiyonu fenotip kaybı gözlendi (Adım 5.5) veya mutant mRNA MO tek başına (Adım 5.7) önemli ölçüde farklı değil fenotipleri yol verirse, 10-200 pg WT insan mRNA arasında değişen bir doz eğrisi enjekte ise (biz 25, 50 tavsiye ve embriyo toplu içine bir ilk test olarak 100 pg) (1-4 hücre aşamasında; 50-100 embriyo / toplu).
2. Uygun bir aşamada (yukarıda 5.3 'e bakınız), fenotipik puanlama yapmak ve Uninjected kontrollere kıyasla ölü ve / veya etkilenen embriyoların istatistiksel olarak anlamlı sayıda olmadığı en yüksek dozu belirleyecektir. Bu "deneyi" dozdur.
3. Mutant insan mRNA (; 50-100 embriyo / toplu 1-4 hücreli aşamasında) bir tahlil doz enjekte edilir. Fenotip embriyolar ve WT insan mRNA enjeksiyon ya da tahlil, MO konsantrasyon tahlil doz skorlama karşılaştırın. Sonuçlar için Şekil 1'e bakınız.
4. Sonuçları MO ayırt edilemez ise, WT mRNA ile insan mutant mRNA titreve insan WT ve mutant mRNA enjeksiyon karşılaştırın. Mutant artı WT mRNA enjeksiyonlu toplu ile fenotipleri geliştirilmesi bir dominant negatif gösterir. Resim iyileştirme fonksiyonu bir kazanç gösterir.

7. In vivo Test Sonuçları yılında yeniden

1. In vivo deneyler üç kez en az tekrarlayın.

8. Kanıt Diğer Hatları ile in vivo Patojenite Veri Zebra balığı entegre

1. In vitro çalışmalar genetik bir soyağacı içinde veri (varsa), kontrol nüfus frekans veri, (hücre bazlı protein istikrar deneyleri, hücresel yerleşimi, sinyal çıkışı, ya da enzimatik aktivite): Zebra balığı için deneylerden elde patojenite verileri karşılaştırmak.

Sonuçlar

Resesif ve Pseudorecessive Bozuklukları

Toplu olarak adlandırılan İlköğretim kirpikler. Çoğalması, kutup, farklılaşma ve doku bakım dahil olmak üzere birden fazla hücre kaderi, hücresel sinyal rol oynar omurgalı vücut planı üzerinde yakın yerde yapılardır bu organellerin ⁵ Disfonksiyon insan genetik bozukluklar geniş bir yol açar ciliopathies. ^6,7 Böyle bir klinik tablo Bardet-Biedl sendromu (BBS), retinal dejenerasyon, obezite, hipogonadizm, polidaktili ve böbrek fonksiyon bozukluğu ile karakterize bir multisistemik pediatrik bir hastalıktır. ⁷ alel patojenite in vivo deneylerde gelişimi için gerekli olduğunu BBS, çünkü a) en az 17 gen ^7-10 meydana gelen esas olarak özel nonsynonymous değişikliklerin neden olduğu bir genetik bozukluk olan ve BBS ailelerin>% 25 b) oligogenik kalıtım, ikinci bir heterozigot değişikliklerin varlığı buradaBBS geni (resesif birincil nedensel mutasyon ek olarak) klinik penetrans ve ekspressivite modüle edebilir. Tipik olarak, bu üçüncü alel böylece protein fonksiyonu üzerindeki biyolojik etkileri doğru yorumlanması gerektiren bir genetik açıdan, belli patojenik potansiyelinden bir nonsynonymous heterozigot değişiklikler, vardır. ^11-13

BBS14 - BBS mutasyon yük katkıda mutasyonların patojenik potansiyeli araştırmak için, başlangıçta BBS1 yer alan tüm yanlış anlamlı değişiklikleri test. Biz ve diğerleri hem bazal vücut protein kaybı düzlemsel hücre polarite düzensizliği (PCP, kanonik olmayan Wnt sinyal) yol açar göstermiştir. Orta somitic Zebra balığı embriyolarının yakınsak uzantısı kusurları olarak tezahür ¹⁴ Bu fizyolojik ilgili fenotipik okuma kullanarak, BBS genlerin bastırılmasını kısaltılmış vücut ekseni, daha geniş ve daha ince Somitlerin, ve geniş, bükülmüş notochords sonuçlandı bulduk. ^{15 <}/ (Şekil 2), MO-kaynaklı baskılama Gastrulasyon kusurlar> sup ve in vivo yöntemler üç farklı insan tarafından kaydedildi mRNA ile birlikte-enjeksiyon (ve tekrarlanabilir) önemli ölçüde bu fenotipleri kurtarıldı. İlk olarak, embriyo nitel fenotipik kriterleri (Normal, Sınıf I ve Sınıf II, fenotipik sınıfların ayrıntılı tanımları için ¹⁵⁾ göre canlı skorlandı. Sonra, epiboly sırasında hücre göçü quantitated (ile karakterize erken gelişim aşamasında incelmesi ve sarısı hücre ¹⁶ üzerinde hücre tabakaları yayılmasını) göç hücreleri görselleştirmek için bir floresan izleyici kullanılarak. Son olarak, bir krox20 bir kokteyl, PAX2 ve düz morfolojik analiz için monte edildi myod riboprobes, ile melez yerinde dokuz hücre gruplarının embriyolarda hücre gruplarının gövde uzunluğu ölçüldü.

Bu metodoloji, siliyer mutasyon alanı 500 alel aşan test etmek için kullanılmıştır. BirindeTek başına çalışma,> 130 alel in vivo test fenotipik puanları bir dizi üretti; olarak tam benign olarak sınıflandırıldı (Şekil 1) bizim protokol tarafından kurtarır belirtilen (WT kurtarma önemli ölçüde farklı değil), kısmi (önemli ölçüde geliştirilmiş hypomorphs olarak sınıflandırıldı kurtarır ) WT kurtarma daha MO gelen, ancak daha şiddetli, kurtarma başarısızlık fonksiyonel boş (MO önemli ölçüde farklı değil), ve baskın negatif olarak sınıflandırıldı MO göre tek başına mutant mRNA tarafından uyarılan fenotipleri olarak sınıflandırıldı.

Ayrıca Zebra balığı in vivo tamamlama tayininde duyarlılık ve özgünlüğü değerlendirdik. Özgünlük tarafından doğrulandı ortak enjekte ortak SNP (sağlıklı kontrol popülasyonlarda>% 5 minör allel sıklığı); bu 14/17 test (>% 82) benign fenotipleri vermek bulundu ve belirtilen duyarlılık% 98 olduğu gösterilmiştir in vivo veri ve genetik argümanlar yeterli t arasında uyum tarafındano bir BBS soyağacında nedensel olarak bir alel bağlıyor. ^17. Buna ek olarak, fenotipik etkileri immunoblotting ve hücresel lokalizasyon çalışmaları kullanarak in vivo önlemler (canlı skor, epiboly izleme ve ISH morfometrik) in vitro valide edildi üç kullanarak görülmektedir. Bu sonuçların yorumlanması hastalığın patogenezinde en az bir mekanizması ön bilgi gerekli ise, bu örnek bizim protokol yarar ve sağlamlığı kanıtlamak için kanıt sağlar. Biz bu yana tarafsız bir mutasyon tarama deneysel kanıt birden fazla diğer hatları ve TTC21B fonksiyonel analiz çalışması, bir retrograd intraflagellar taşıyıcı protein in vivo puanlama bizim doğrulanmıştır var. ¹⁸

Baskın Bozuklukları

Ekstremite kuşak müsküler distrofi (LGMD) kalça ve omuz yavaş ilerleyen kas güçsüzlüğü neden, müsküler distrofi otozomal sınıfıdır. Bu genetik ve banabozuklukların chanistically heterojen dominant ve resesif sarkomerik birden sarkolemmal arasında mutasyonlar, sitoplazmik ve nükleer proteinlerin her ikisi de neden olur. Klinik fenotipleri ve manyetik rezonans görüntülemede kas tutulumunun delillerin ibrazı dayanarak, Fince, ABD ve İtalyan aileleri ¹⁹ bulunan bir baskın LGMD nedeni araştırıldı. Eşlenen odağı olan pozisyonel aday dizilemesi DNAJB6 mutasyonları ortaya, HSP70 ailesinin bir ko-hastabakıcı kodlayan bir gen, insanlarda en az iki bağlantı izoformlarının (nükleer ve sitoplazmik) olarak ifade edilir. DNAJB6 fonksiyonu ve LGMD ile ilişkisi içine daha fazla bilgiler edinmek için, Zebra balığı kas bütünlüğü rolünü inceledi. Zebra balığı ortolog'un (dnajb6b) RT-PCR bir bağlayıcı engelleme morfolino ile embriyoların enjeksiyonu izledi beş hücre gruplarının sahne, gibi erken ifade tespit. 48 saat sonra döllenme de, maskeli puanlama yavaş dekolmanı gösterdikendi ekleme noktalarından lifler. Bu fenotip spesifikliği daha sonra ikinci bir örtüşmeyen MO ile test edilmiş ve WT insan DNAJB6 mRNA sonradan kurtarıldı.

DNAJB6 fonksiyon kaybı kas bütünlüğü hatalarına yol açar nasıl sorgulamak için, her iki izoformu insan transkript içine hastada mutasyondan tanıttı ve Zebra balığı embriyolarının içine enjekte. WT insan mRNA enjeksiyon kayda değer fenotip üretirken, bu değişiklikler sitoplazmik içinde mühendislik MO fonksiyonu etkileri kaybı phenocopied, ama nükleer değil izoformu. Bu baskın bir etkiye işaret kas fenotip geliştirilmiş şiddeti gösterdi mutant ve WT mRNA'sının eşit molar miktarlarda plasmaidlerin birlikte enjeksiyonu izlemiştir. Bu kavramı test etmek için, daha fazla enjeksiyon mutant ve WT mRNA mol oranları değiştiren ile gerçekleştirilmiştir. Tahmini ile uyumlu olarak, mutasyona uğramış mRNA aşırı, embriyolar indüklenen öldürücülüğü WT ile karşılaştırıldığında bir süreWT n fazla bir giderek artan kurtarma üretti. Bu oligimerization özelliklere ve protein etkileşimleri belirlemek için in vitro deneyler izledi. Bu mutasyonlar sitoplazmik DNAJB6 en antiagregan etkinliği bozabilir ve mutant ve WT hem ciro, hem de LOF BAG3 bir çocuk biçimi neden bu yana gibi, aynı zamanda LGMD en patomekanizmadır ile ilgili başka bir molekülü, BAG3, etkileşim müdahale gösterdi müsküler distrofi ^20. Daha sonra BAG3 zebrafish mutant DNAJB6b tarafından uyarılan fenotip modüle olabilir olup olmadığını sordu. WT BAG3 enjeksiyon başına DNAJB6 mutantlar ile bir fenotip gösteren plasmaidlerin birlikte enjeksiyonu üretilen da önemli ölçüde BAG3 mütantları ¹⁹ arasında patojenite aracılık bir rol oynadığını düşündürmektedir, fenotipik şiddeti artmıştır.

	Geçici Zebra balığı Model	Mutant Zebra balığı Hattı	Transgenik Fare Hattı
Soruşturma altında insan fenotip başlangıç ​​yaşı	doğum öncesi neonatal pediatrik	doğum öncesi neonatal pediatrik	doğum öncesi neonatal pediatrik yetişkin
Uygulanabilir fenotipleri	kraniofasial kas sinyal kardiyak böbrek damar	kraniofasial kas sinyal kardiyak böbrek damar	kraniofasial kas sinyal kardiyak böbrek damar duyusal iskelet iç organlara ait davranış solunum üreme endokrin metabolik
Kullanıma kadar zaman (doğumdan)	1-7 gün	> 3 ay	> 6 ay
Çıktı	orta-yüksek	düşük	düşük
Avantajları	Özel mutasyonlar test etmek için yeteneği Knock-modelleri oluşturmak için yeteneği Morfolino hakemin kullanma becerisi Düşük maliyetli bakım	Daha az deneysel değişkenliği	Yakın evrimsel bir ilişki Organ yapıların korunması Gen yeteneğioranı knock-modelleri

Tablo 1. In vivo modellerde karşılaştırılması.

Tablo 2'de. Insan dysmorphologies in vivo modelleme örnekleri. Çeşitli fenotipleri sunulan protokol kapsamında test. Fenotipik okuma ve görselleştirme teknikleri bir dizi hastalığın türüne göre istihdam edilebilir. daha büyük bir tablo görmek için buraya tıklayın.

Şekil 1. Nonsynonymous türevleri in vivo fonksiyonel test olarak. Tüm fonksiyonel test için sistematik bir yaklaşımbilinmeyen ya da hipotez önemi eles. Morfolino mikroenjeksiyon yoluyla gen demonte WT ve mutant insan mRNA hem de (ko) bir dizi enjeksiyon ile takip edilir. Fenotipik sonuçlarının istatistiksel analizler alel patojenite ve moleküler fonksiyonu bilgi. Kısaca, fonksiyon testleri kaybı için: demonte mutant ve WT mRNA tarafından eşdeğer kurtarıldı edilebilir bir fenotip üretir, alel (yeşil kutu) büyük olasılıkla iyi huylu. Demonte fenotip kurtarma mutantı demonte fenotipi ayırt edilemez ise, aleli olası işlevsel boş (sarı kutu). Demonte fenotip kurtarma mutantı istatistiksel MO daha iyi, ancak WT daha kötü ise, büyük olasılıkla bir alel hypomorph (yeşil kutu) baskın bir test için:. Mutant mRNA enjeksiyon yabani tip mRNA buna eşdeğer ise , alel iyi veya fonksiyon kaybı ya olabilir, ya da tahlil (yeşil kutu) başarısız olmuş olabilir. Mutant mRNA enjeksiyon indis ise MO demonte ikinci tinguishable, gen ürününün işlevi muhtemel bir şekilde değişir. Işlev değişikliği ayırt etmek için, vahşi tip mRNA mutant mRNA titre. Bu titrasyon sonucu tek başına yabani tip mRNA ayırt edilemez ise, mutasyona uğramış protein ürünü ve böylece bir baskın negatif fenotip (kutu mavi) gösteren, bir alt-tabaka olarak yaban-tip protein kullanır. Bu titrasyon sonucu tek başına mutant mRNA ayırt edilemez ise, mutasyona uğramış protein ürünü artık, vahşi tip ile aynı işleve sahiptir ve bu nedenle büyük olasılıkla fonksiyon (mavi kutu) bir kazançtır. Herhangi bir fenotip MO demonte ikinci sunar, ama WT mRNA mevcut yok, diğer deney oluşabilir, WT insan mRNA fenotip en aza indirmek için titre edilmelidir, ve aynı zamanda, yeni bir set noktası olarak kullanılabilir. WT ve mutant insan mRNA daha coinjection mutant kurtarıcı yeteneği (pembe kutu) dayalı değerlendirilebilir.et = "_blank"> büyük rakam görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. MKS1 mutasyonların nicel ve nitel değerlendirme insanlarda tespit. Gelişim kusurları MKS1 morphant embriyolarda. Şiddetine göre, fenotipleri üç gruba ayrıldı. Her sınıf örnekleri (a) gösterilir, ve embriyo kohort içindeki yaygınlığı (n = 100-160 embriyo) (gösterilmemiştir) tablo oldu. MO aynı somitic yaşta enjekte edilen embriyolar (8-9 Somitlerin) kontrole göre sarısı aşırı embriyonik doku, ben fenotipleri fena halde normal morfoloji vardı ama kısaydı Sınıfı embriyolar enjekte. Sınıf II morphants inceltilmiş edildi, kısa ve kötü baş ve kuyruk yapıları gelişen ve ayrıca somitic tanımı yoksunve simetri. Sınıf III embriyo ciddi az gelişmiş ve şekilsiz Somitlerin ile ertelendi, notochords dalgalı ve genellikle 10-hücre gruplarının aşamasında geçmiş hayatta değildi. Insan MKS1 mRNA ko-enjeksiyon MKS1 bastırma için fenotipleri özgüllüğü gösteren, bu kusurları her kurtardı. Krox20, PAX2 ve myod riboprobes ile boyanmış 11-hücre gruplarının sahne (± 1 hücre gruplarının) de embriyo situ hibridizasyon (b, c .) Fenotipleri ilk gelen c miktarı her embriyo (oklar), son kayda değer hücre gruplarının için ölçümleri ile ölçüldü. Şekil ¹⁵ izni ile uyarlanmıştır.

Şekil 3,. İnsan Dismorfoloji in vivo modelleme örnekleri. (A) Kraniyofasiyal Dismorfoloji. Kontrol mRNA embriyo enjekte (solda) ve mutant enjekte embriyo (sağ) 5 dpf'e Alsiyan mavisi ile boyandı. Mutantlar mRNA-enjekte edilen embriyolar da dahil olmak üzere kıkırdak kraniyofasiyal iskeletin genel bir düzensizlik ile özellikle küçük ve şekilsiz başkanları görüntülemek brankial kemerler ve eksik veya bozuk yapıları yayvan. (B) Mikro / makrosefalisi. Kontrol 5 dpf'e embriyo (solda) ve kctd13 MO-enjekte embriyo (sağda) uninjected. Gözler arasında boşluk görüldüğü gibi Morphants, başın genişleme gösterir. ²¹ (c) İndirimli damar bütünlüğü. Kontrol embriyo uninjected (üstte) ve eng MO-enjekte embriyo (alt) bir FLI1 2 dpf'e floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi: eGFP transgenik muhabiri hattı. Intersegmental damarları ve diğer vasküler yapıların çimlenme engelli Morphants görüntüler. ⁴¹ (d) Altered kalp döngü. Tek in situ hibridizasyonccdc39 morphant embriyolar (gösterilmemiştir) ikili gösterdi (sağ) ya da, çoğu durumda, belirlenemeyen spaw ifade ederken njected vahşi tip embriyolar (sol), sol lateral plaka mezoderm içinde spaw ifade göstermektedir. ⁴³ (e) Böbrek kistleri. Uninjected WT embriyo (üstte) ve ift80 morphant (alt). Morphants büyük böbrek kistleri (ok), perikardiyal ödem (ok başı) ve kıvrılmış kuyruk görüntülenir. ⁴⁴ (f) İndirimli glomerüler filtrasyon. Kalbine rodamin dekstran enjeksiyonundan sonra embriyo (üstte) ve ift80 morphant (alt) 24 saat enjekte bir denetimin Floresan görselleştirme. Kontrol floresans yokluğu görüldüğü gibi floresan damar sistemi boyunca dağılır ve neredeyse tamamen böbrek tarafından tahliye edilir. Morphant glomerüler filtrasyon düşündüren, kalıcı floresan dekstran gösterir. ⁴⁶ (g) Müsküler distrofi. WT DNAJB6 mRNA enjekte edilen embriyolar (üst) anti-yavaş miyozin antikor kullanarak immün tarafından belirlenen bitişik myosepta arasında normal Somitlerin kapsayan Normal yavaş myofibers göstermektedir. Mutant DNAJBb (alt) bir veya birden fazla Somitlerin myosepta gelen myofibers ayrılması tamamlamak için kısmi gösterdi. ¹⁹ (h) hücre gruplarının açısı. Kontrolü uninjected (üst) veya 30 hpf görüntülendi kif7 morphants (alt) canlı yan manzarası büyütülmüş. Morphants Zebra balığı myotome içinde sinyal ektopik Kirpi atfedilen anormal şekilli Somitlerin, görüntüler. ⁴⁷

Tüm rakamlar izni ile uyarlanmıştır.

Tartışmalar

Yöntemleri, insan genetik hastalık fenotipi (Tablo 2, Şekil 3), çeşitli ilişkili nonsynonymous değişikliklerin tahlil için geçerli genel bir protokol temsil tanımlanmıştır. Bizim yaklaşımlar hastalık fenotipleri üzerinde varyasyon potansiyel etkisini değerlendirmek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ve hastalık mekanizmaları (örneğin Bardet-Biedl Sendromu için dominant negatif mutasyon katkısı, bir öncelikle otozomal resesif ¹⁷ gibi) incelemek için. Bugüne kadar, sunulan karar ağacı geliştirilmesi yoluyla, biz 1000 allel bir aşırı, nedensel genetik bozukluklar ile ilişkili 200 gen aşan makul maliyet ve zamanda model var.

Burada ayrıntılı olarak ele değil de, aynı zamanda, bu yöntem bu tür kopya sayısı türevleri (CNV'lerin) yanı sıra ve genetik etkileşimler gibi genetik lezyonun diğer türleri, model için uygun olduğunu göstermiştir. Bu tür olayların analizi kapsamı dışındadırBu yöntem açıklama, onlar temelde klinik olarak-uygun fenotipleri indüksiyon veya alevlenmesi belirlemek için aday genler (birlikte enjekte gen çiftleri dahil) sistematik test aynı ilke güveniyor olsa. Örneğin, 16p11.2 KNV içinde 29 genlerin hangi aydınlatmak için enjekte edildi ve kafa bölümü olan 29 genlerinin her birine karşılık gelen gözlenen bir 660 kb genomik kademeli çakışması olan hastalarda gözlenen mikrosefali, mRNA ile ilgili olabilir, boyutu ölçümleri tek bir transkript, KCTD13 önemli bir katkı ortaya, 2 dpf'e ve 5 dpf'e yapılmıştır. ^21. Ayrıca, Bardet-Biedl sendromu ve Hirschsprung hastalığı birlikte görüldüğü hastalarda, genomik lezyonların test genetik etkileşimleri için bu model kullandık. ²² ayrı olarak ve eşzamanlı olarak iki klinik kimliklerin nedensel genlerin MO bastırma karşılaştırılması, biz bei olarak elde edilen fenotip saptayabildilerng sinerjik bir etkileşim yerine sadece ilave şiddetine bağlıdır.

Yüksek hassasiyet (% 98) ve ciliopathies ¹⁷ katkıda türevleri için özgünlük (>% 82) kurulmuş olmasına rağmen, henüz bu Zebra balığı modellerde tüm fenotipik okuma için genellenebilir olup olmadığını belirlemek için yeterli veri yok. Bunu yapmak için, allel, çok sayıda, her bir fenotipik kategori içinde test edilmesi gerekir, genetik olarak iyi huylu ya da patojen ya da olması beklenmektedir. Bu klinik ortamda bu tür testlerin uygulanması için özellikle önemli olacaktır, VUSs fonksiyonel yorumlanması neyin tanı ve yanlış pozitif ve yanlış negatif sağlam bir anlayış hekim ve hastalar bu tür sonuçların teslim eşlik edebilir sadece yönetimi bilgilendirebilir. Bununla birlikte, bu yöntemler insan genetik hastalığın manzara daha iyi anlaşılmasını doğru önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Biz bu modellerin sadece bir foun olarak hizmet etmeyeceğini tahminKlinik genetik bilginin daha iyi yorumlanması için adaylığını koyduktan değil, aynı zamanda tedavi edici ekranlar yapmak için yararlı model olarak istihdam edilecek. vivo veriler aynı zamanda PolyPhen ²³ gibi kaynaklardan siliko hesaplama tahminleri ile karşılaştırıldığında olabilir, ²⁴ SIFT, SNP ve GO ^25, ya da ²⁶ MutPred uyum göstermek için. Tahmini veritabanları SNP & GO ve MutPred önceki bir çalışmada ise, doğrulukları sadece 0.82 ve 0.81 ulaşan, en doğru olarak bulunmuştur unutmayın. ²⁷

Biz çocuk anatomik defektler (Tablo 2, Şekil 3) bir alt kümesi için bu yöntemlerin sağlamlığı ana hatlarıyla olmasına rağmen, bazı fenotipleri bu yöntemler daha az uysal bulunmaktadır. Bazı istisnalar rağmen, bizim protokole uygun olmayan bozuklukların üç ana sınıf vardır. Erişkin başlangıçlı hastalıklar (örneğin, Parkinson hastalığı gibi) embriyonik bir sistemde modeli için bir sorun teşkil etmektedir. Prog Yavaşdışarı yansıması dejeneratif fenotipleri (örneğin frontotemporal demans gibi) bir fenotip üretmek için MO faaliyet yedi dpf'e pencere daha fazla zaman gerektirebilir. Bu RNAi ve siRNA gibi diğer gen demonte teknolojileri müdahale veya gen hedef aşağılamak için kullanılabilir, ancak bu nedenle de süre sınırlayıcı, hiçbiri, özel stabil, toksik olmayan, veya katille ²⁸ gibi uzun ömürlü olduğu gösterilmiştir fenotipleme için. Üçüncü olarak, bu tür memeli akciğer gibi bazı omurgalı yapılar, Zebra balığı embriyo yeterince orthologous yapı yok. Bu alışılmadık ve istenmeyen bir durumdur dikkatli rağmen Ayrıca, WT insan mRNA enjeksiyon bir fenotip yol açar hangi durumlarda incelenmesi için önerilen bir acil durum planı hazırladık.

Bazı hastalık fenotipleri sonra soyutlama ve taşıyıcı annelik daha büyük bir derecesi gerektirebilir. Bu gen fonksiyonu yeterli modeli ve tr arasındaki fenotipik benzerlik zayıflatmak saptığını mümkündürUE fenotip, ya da bu zebrabalıkları fizyolojisi doğal kaynaklı hastalığın etkilerini zorlaştırmaktadır. Bu tür durumlarda, çıkarma öncesinde üretilen fenotip daha diseksiyon göstermektedir. Bu tahlil için sorunlu fenotipleri Zebra balığı embriyolarının model edildiği bazı başarılı örnekler vermiştir. Örneğin, TCF8 mutasyonlar, Fuchs korneal distrofi (FKH) ilişkili bir genin, erken gelişme bu transkript bilinen rolleri göre bir vekil fenotipik olarak okuma Gastrulasyon kusurlar kullanarak geliştirilen protokol kullanılarak tayin edildi. Diğer durumlarda ²⁹ gibi DNAJB6 mutasyonlar neden erişkin başlangıçlı müsküler distrofi gibi, biz insanların yaşam ilk üç ile dört yıl içinde patoloji kayda değer kas yoksun olmasına rağmen 5dpf embriyolarda myofiber fenotipleri oluşturmak başardık. ¹⁹

Burada yer alan geçici mutant modelleri ek olarak, diğerleri de avan almışvücut sistemlerinin çeşitli insan hastalığı modellemek için bu geçici sisteminin ge. Bir örnekte, retinitis pigmentoza retinal hücre ölümü ile sonuçlanan bir gen RP2 demonte göre zebrabalıkları modellenmiş ve retina laminasyon azalmıştır. Beş mutant mRNA dördü kurtarmak için başarısız ise, insan yabani tip mRNA kurtarma, retina laminasyon her üç kat geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. ^30, insan duyu bozukluğu Bu modeli morfolojik bir fenotip esas olmasına rağmen, aynı zamanda mümkündür Bu akustik irkilme ya da engellenmesi prepulse gibi uyaranlara tahlil yanıt. ⁴⁷

Son zamanlarda, bir Zebra balığı modeli amiloid öncü proteini ile Alzheimer hastalığı patogenezinde araştırmak için kullanılmıştır. ³¹ Yazarlar gen demonte insan mRNA ile kurtarıldı olabilir motor nöronların, düşüklüğüne aksonal akıbet neden gösterdi. Fare modelleri ince phenot görüntülemek gibi bu model, özellikle bilgilendirici olduğu kanıtlanmıştırypes (tek demonte) veya doğum sonrası öldürücülüğü (çift demonte). Gelişimi boyunca in vivo değerlendirmek için zebrabalıkları embriyolar yeteneği azaltılmış amiloid öncü proteini, hem de, proteinin düzgün fonksiyon için bir hücre dışı ve hücre içi etki alanı hem de gerektirir şartıyla doğrudan bir kanıt patojenik bir etki ayırt etmek oldu. Diğer önemli modeller içeren ek müsküler distrofi ^32, Elmas Blackfan anemi ^33, Axenfeld-Reiger sendromu (göz ve kraniofasial geliştirme) ^34, inflamatuvar barsak hastalığı ³⁵ (antibakteriyel aktivite), Parkinson hastalığı ³⁶ (nöron ve hareket kaybı) ve nöbet ³⁷ bu (hidrosefali ve hiperaktivite).

Daha yaygın bir insan hastalığı fenotip özetlemek de gösterilmiştir mutant Zebra balığı çizgilerdir. ^1,38 gözden, modelleri lösemi, melanom, dilate kardiyomiyopati, Duchenne müsküler distrofi, dahilve diğerleri çok.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S, M0530L
DpnI restriction endonuclease	NEB	R0176L, R0176S
Max Efficiency DH5α competent cells	Invitrogen	18258-012
Big Dye Terminator	Applied Biosystems	4337455
mMESSAGE mMACHINE Kit	Invitrogen	AM1340, AM1344, AM1348
Morpholino	Gene-Tools	n/a
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629	Prepare as 0.003% PTU in embryo media
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%
Tricaine methane sulfonate	Western Chemical	N/A	For anesthetization and euthanasia
Equipment
PTC-225 Tetrad Thermal Cycler	BioRad	Any equivalent thermal cycler
Nano Drop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
SMZ 745T Stereomicroscope	Nikon
AZ100 Stereomicroscope	Nikon
DS Fi1 Digital Camera	Nikon	For color/fluorescent imaging
DS QiMC Digital Camera	Nikon	For black/white imaging
Advanced Resarch 3.2 Imaging Software	NIS- Elements