رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Summary

ويعوق الدراسات التنموية في الماوس عن طريق عدم إمكانية الوصول إلى الجنين أثناء الحمل. لتعزيز ثقافة طويلة الأمد من القلب الجنينية في المراحل المتأخرة من الحمل، وضعنا بروتوكولا التي يتم تربيتها قلب رفعه في شبه صلبة، Matrigel المخفف.

Abstract

ويعوق الدراسات التنموية في الماوس عن طريق عدم إمكانية الوصول إلى الجنين أثناء الحمل. وهكذا، وبروتوكولات لعزل والثقافة الأجهزة الفردية للمصلحة ضرورية لتوفير وسيلة لكلا تصور التغييرات في التنمية والسماح استراتيجيات العلاج الرواية. لتعزيز ثقافة طويلة الأمد من القلب الجنينية في المراحل المتأخرة من الحمل، وضعنا بروتوكولا التي يتم تربيتها قلب رفعه في شبه صلبة، Matrigel المخفف. يوفر هذا الركيزة ما يكفي من الدعم للحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد ولكن هو مرنة بما فيه الكفاية للسماح استمرار الانكماش. باختصار، يتم رفعه قلوب من الجنين وضعت في خليط من Matrigel الباردة المخفف 1:1 متوسطة النمو. بعد يتصلب Matrigel المخفف، يضاف متوسطة النمو إلى الطبق الثقافة. كانت قلوب رفعه في وقت متأخر من يوم الجنينية 16.5 قابلة للحياة لمدة أربعة أيام بعد تشريح. ويبين تحليل الضفيرة التاجية أن هذا الأسلوب لاتعطيل التنمية الأوعية الدموية التاجية. وبالتالي، فإننا نقدم وسيلة جديدة لثقافة طويلة الأمد من قلوب الجنينية.

Introduction

خلال السنوات الأخيرة، كان الماوس المعدلة وراثيا في النظام النموذجي السائد لدراسة عيوب القلب التنمية. ومع ذلك، فقد ثبت الكائنات نموذج آخر، مثل الزرد، لديك مزايا هامة على الماوس. ثلاث مزايا رئيسية من الزرد هي زرع الخارجية للبيض، لسهولة الوصول إلى الأجنة، والشفافية البصرية من الأجنة، والذي يسمح التصور سهل للتنمية القلب؛ وسهولة تطبيق العلاجات الجزيئية صغيرة لتعديل وضع الجنين ^1. وبالتالي، فإن تطوير تقنية الثقافة التي سمحت نمو الرحم السابقين من جهاز الجنينية الالتفافية، على الأقل في جزء، والقيود من ذوي الخبرة حاليا من قبل الباحثين الذين يدرسون العمليات التنموية في الفئران المعدلة وراثيا.

وقد وضعت خارج الحي نظم الاستزراع القلب في كل من جنين فأر كتكوت والتي تسمح للعلاج مع جزيئات صغيرة وتحليل لكيفية DIFالمناطق مختلفتين من القلب التواصل ^2-6. للماوس كلها ثقافة قلب، قلوب المأخوذة من الأجنة تصل إلى الجنينية (E) 12.5 من العمر يمكن وضعها في مستنبت مع أو بدون هزاز ^2،3،5. باستخدام هذه التقنية، وقلوب الجنينية وقد حضنت بنجاح إلى معادلة من E13.5، ولقد تم الحفاظ على قلوب تربيتها مع هزاز لطالما ثلاثة أيام (ابتداء من الساعة E10.5) ^3. ومع ذلك، فقد الإبلاغ عن أي دراسات ثقافة الناجح للقلوب من الأجنة في السن. وبالمثل، فقد التجارب الإنقاذ اقتصرت على تطبيق كيل العلاجية على الصعيد العالمي لثقافة المتوسط ^​​2.

كما تم استخدام نظام ثقافة شريحة، الذي يتم رفعه قلوب، جزءا لا يتجزأ، ومقطوع باستخدام vibratome، سواء بالنسبة لقلوب الشباب، مثل E12.5 قلوب الماوس وهمبرغر هاملتون المرحلة 36 (ما يقرب من E16 في الماوس) قلوب كتكوت ^2،4،6، وكبار السن القلوب، مثل ح الماوس بعد الولادة وتعليم الكبارearts وقلوب الإنسان البالغ ^7،8. في حين أن التحليلات الجنينية قد تستخدم عادة أبواب سميكة 150 ميكرون ^2،4، ويمكن أن يكون سمك الباب الكبير الى 500 ميكرون من دون دليل على الحرمان من الأكسجين ^8. وقد تم الحفاظ على هذه الثقافات شريحة طالما شهرين في الثقافة، مع معظم شرائح الحفاظ على انقباض طوال هذه الفترة ^9. مقارنة دراسات في العضلية معزولة، هذه الثقافات شريحة تسمح الرئيسين ثقافة العضلية مع أنواعها الخلية المجاورة وتوفير وسيلة مفيدة لتحليل فيفو السابقين. ومع ذلك، هذه الثقافات يتطلب أكثر تفصيلا انشاء من مجرد وضع القلب في مستنبت (مثل تضمين قلب حي لباجتزاء على vibratome)، وأي تحليل محدود من الواضح إلى جزء من القلب داخل القسم.

ونظرا للقيود المذكورة أعلاه لزراعة قلوب الماوس الجنينية وثروة المعدلة وراثيا الفئران افاilable للدراسة، وضعنا في الجسم الحي الماوس قلب نظام الثقافة السابقين مشابه لنظام الثقافة الرئة فيفو السابقين التي وضعتها ويفر، وآخرون. ¹⁰ نظام ثقافتنا ثقافة يسمح على المدى الطويل والتخيل من الدورة التاجية إعادة عرض ضمن كله قلوب الماوس الجنينية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام Matrigel يسمح الخرز الذي سيعقد في مكان بالقرب من القلب، وبالتالي توفير العلاج الموضعي مع العوامل العلاجية. هذه التجارب لا يمكن أن يؤديها في مختلف نقاط زمنية التنموية للمقارنة بين تأثير العلاج معين على عملية تشكيل مثل الشريان التاجي. لأن جزيئات صغيرة يمكن نشرها من خلال Matrigel، يمكن لهذا النظام ثقافة أن تستخدم أيضا لثقافة المناطق تشريح من القلب بالقرب من بعضها البعض لتحديد ما إذا اتصالات خلية خلية محددة ضرورية للعمليات التنموية معينة أو ما إذا كان يشير نظير الصماوي من منطقة إلى أخرى هو اللازمة.

هذا النظام ثقافةهو بسيط نسبيا، وعلى عكس نظام ثقافة شريحة، يجعل من استخدام الكواشف الثقافة الأساسية ومجموعة عمليات التي تتوافر بسهولة في معظم المختبرات. باختصار، يتم تربيتها قلوب الجنينية رفعه في Matrigel المخفف، الذي يوفر دعما شبه صلبة. هذا الدعم كافيا للحفاظ على مورفولوجيا ثلاثي الأبعاد للقلب مع السماح أيضا القلب إلى العقد. باستخدام هذا النظام، يمكن الحفاظ على قلوب كامل من أجنة الفئران الأكبر سنا (E14.5-E16.5) في الثقافة لمدة تصل إلى أربعة أيام. يتم الحفاظ على الضفيرة التاجية بأكمله، خلافا لما حدث في الثقافات شريحة، لذلك تبقى أي العظة مما يشير إلى أن تحدث من مناطق مختلفة من قلب الحاضر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الأصباغ الفلورية الخلية الحية تتخلل Matrigel للسماح التصور من قلب حي، والخرز البروتين، مترافق يمكن وضعها بالقرب من القلب إلى توفير مصدر إشارات المترجمة. معا، وهذه المزايا تجعل هذه التقنية وسيلة مثالية لدراسة العمليات التنموية في embryonIC قلب فأر.

Protocol

1. استئصال قلوب الجنينية

1. الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل في اليوم الجنينية المطلوب باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل.
2. رش تحرري الأنثى مع الايثانول 70٪ قبل تشريح. فتح تجويف البطن الأنثى لاسترداد واستئصال قرن الرحم.
3. ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وشطف حسب الحاجة. خفض فتح قرن الرحم عن طريق خط الوسط لفضح الحويصلات الجنينية المرفقة.
4. خفض فتح الكيس الجنيني واسترجاع الجنين. وضع الجنين في طبق بيتري الثانية مع برنامج تلفزيوني الباردة. العودة طبق بيتري مع قرن الرحم إلى جليد.
5. قطع رأس الجنين لتحسين الوصول إلى جدار الصدر. إذا التنميط الجيني هو ضروري، وإزالة وحفظ الذيل في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
6. معالجنين على ظهرها، وقطع فتح جدار الصدر لتصور القلب والرئتين. اعتمادا على المسرح، قد يكون جدار الصدر شفافة.
7. رفع بعناية القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ثم، وقطع فوق سفن كبيرة للافراج عن القلب. إذا لزم الأمر، وإزالة الأنسجة الدخيلة.
8. وضع القلب في بئر واحدة من طبق 24 أيضا مليئة الباردة برنامج تلفزيوني ووضع الطبق على الجليد.
9. كرر الخطوات السابقة حتى يتم استئصاله من قلوب جميع الأجنة.

2. ثقافة مجموعة المتابعة

1. في الصفحي هود، والجمع بين Matrigel الباردة والمتوسطة الثقافة المطلوبة (على سبيل المثال 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) في Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM)) في نسبة 1:1. لا قبل دافئ ثقافة المتوسط.
2. الحفاظ على Matrigel المخفف على الجليد، ماصة 500-1،000 ميكرولتر من محلول مخفف في بئر من صحن الثقافة 24 أيضا أن يتم الحفاظ أيضا على الجليد.
3. في غطاء محرك السيارة، واختيار بعناية ووضع رفعهالقلب في بئر من صحن الثقافة التي تحتوي على على Matrigel مع الحفاظ على صحن الثقافة على الجليد.
4. إذا التوجه للقلب جزءا لا يتجزأ من الأهمية بمكان: رذاذ متحررا مجهر مقلوب والمساحة المحيطة بها مع الايثانول 70٪. في غطاء محرك السيارة، ضع قلب رفعه في بئر من لوحة الثقافة التي تحتوي على على Matrigel في حين لا يزال على الجليد. ثم، وضع لوحة على المجهر وبسرعة المشرق قلب رفعه كما يبدأ Matrigel لترسيخ.
5. مكان الطبق الثقافة في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية (5٪ CO ₂₎ والسماح للMatrigel ليصلب لمدة حوالي 30 دقيقة.
6. إضافة 1 مل مستنبت قبل تحسنت إلى كل تحتوي أيضا على القلب.
7. يمكن أن تبقى القلوب في الثقافة لمدة أربعة أيام على الأقل. ينصح بتغيير ثقافة المتوسط ​​كل يومين.

3. تثبيت والتخيل

1. إذا رغبت في ذلك، إضافة صبغة الفلورسنت الخلية الحية (على سبيل المثال Syto-16) لتصور قلب حي. وسوف يكون التصويرتقتصر على جانب القلب الذي مرئيا استنادا إلى الموقف الذي كان جزءا لا يتجزأ منه.
2. إذا كان سيتم إجراء تحليلات ما بعد زراعة (على سبيل المثال كله التصوير جبل أو باجتزاء)، وإزالة ثقافة المتوسط ​​واستبدالها مع البرد 4٪ الفورمالديهايد. وضع الطبق على الجليد لمدة 30 دقيقة.
3. بعد الفورمالديهايد الباردة والجليد تعزيز حل Matrigel، استبدال تثبيتي (وMatrigel) مع الفورمالديهايد الطازجة وإصلاح القلوب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. غسل قلوب مع العازلة (مثل برنامج تلفزيوني أو تريس) وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى إجراء المزيد من التحليلات.

النتائج

باستخدام هذه التقنية، ويحافظ على القلب التشكل لها ثلاثي الأبعاد وتبقى قابلة للحياة، كما يتبين من استمرار انكماش (فيلم 1). هذه الانقباضات هي دائما أكثر وضوحا في الأذينين مما كانت عليه في البطينين. بعد الثقافة، وقلوب يمكن ان تكون ثابتة ومعالجتها إما المناعية أ...

Discussion

النظام الحالي يشكل ثقافة مزايا هامة لدراسات القلب الماوس الجنينية. هذا النظام يحافظ على ثقافة انقباض عضلة القلب والضفيرة التاجية، مع وجود علامات محدودة من النخر، حتى بعد أربعة أيام في الثقافة. علاوة على ذلك، يوفر مصفوفة شبه صلبة بما فيه الكفاية دعم للحفاظ على مورفول...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110