소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

요약

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다.

초록

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 따라서, 프로토콜은 분리하고 그 문화를 개별 기관이 모두 발달의 변화를 시각화하고 있도록 새로운 치료 전략의 방법을 제공하는 것이 필수적이다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다. 이 기판은 3 차원 구조를 유지하기 위해 충분한 지원 제공하지만 지속적인 수축을 허용 할만큼 충분히 유연합니다. 간단히 말해서 마음이 배아에서 절제와 추위 마트 리젤의 혼합물에 배치 성장 매체로 1:1 희석. 희석 마트 리젤이 굳은 후 성장 배지 배양 접시에 추가됩니다. 배아 일 16.5로 늦게 절제의 마음 나흘 후 해부 가능한 하였다. 관상 동맥 신경 얼기의 분석이 방법은하지 않는 것을 보여줍니다관상 동맥 혈관 발달을 방해. 따라서, 우리는 배아 마음의 장기적인 문화의 새로운 방법을 제시한다.

서문

최근 몇 년 동안, 형질 전환 마우스의 개발 심장 결함을 공부 지배적 인 모델 시스템이다. 그러나, 제브라 피쉬와 같은 다른 모델 생물은 마우스에 비해 상당한 장점을 가지고 입증했다. 제브라 피쉬의 세 가지 주요 장점은 배아에 대한 접근의 용이성을 위해, 계란의 외부 누워있다, 심장 개발을 쉽게 시각화 할 수 배아의 광학 투명성, 그리고에 작은 분자 치료를 적용의 용이성은 배아의 발달을 조절 ^1. 따라서, 배아 기관의 전직 자궁 내 성장을 허용하는 문화 기술의 발전은 적어도 부분적으로 제한 현재 형질 전환 생쥐의 발달 과정을 공부하는 연구자에 의해 경험 우회 것이다.

생체 심장 배양 시스템은 DIF 방법 작은 분자 및 분석 치료를 허용하는 병아리와 마우스 배아 모두에서 개발 된마음의 ferent 지역은 ^2-6 통신합니다. 전체 마우스 심장 문화, 마음 배아로 배아에서 채택 (E) 연령 12.5 흔들 ^2,3,5의 유무에 관계없이 배지에 배치 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 배아 마음은 성공적 E13.5의 동등성을 배양하고 있고, 흔들 배양 마음은 오랫동안 3 일 (5 E10.5에서 시작) ^3로 유지되고있다. 그러나, 연구는 이전 배아에서 마음의 성공적인 문화를보고있다. 마찬가지로, 구조 실험은 배양 배지 ² 전 세계적으로 치료제를 적용 제한되었습니다.

마음은 절제 내장하고 vibratome를 사용하여 절편되는 슬라이스 문화 시스템은, 또한 E12.5 마우스 마음과​​ 햄버거 - 해밀턴 단계 36 (약 E16 마우스) 병아리 마음으로 두 어린 마음에 활용 된 이러한 출생 후 성인 마우스를 H로 ^2,4,6, 세 마음,earts 성인 인간의 마음 ^7,8. 배아 분석은 일반적으로 150 μm의 두께 섹션 ^2.4을 활용하고 있지만, 단면의 두께는 산소 부족 ⁸ 증거도없이 큰 500로 μm의 수 있습니다. 이러한 슬라이스 문화는 대부분 조각이 기간 ⁹ 내내 수축성 유지 보수와 문화 2 개월만큼 유지되고있다. 고립 된 심근의 연구에 비해, 이러한 슬라이스 문화는 이웃 세포 ​​유형과 심근의 공동 문화를 허용하고 생체 분석을위한 유용한 방법을 제공합니다. 그러나, 이러한 문화는 단순히 문화 매체의 마음을 (예 : vibratome에서 단면의 살아있는 심장을 포함) 배치보다 더 정교한 셋업이 필요하며 모든 분석은 분명 섹션에서 마음의 부분으로 제한됩니다.

제한 배양 배아 마우스 마음과​​ 형질 전환 생쥐 AVA의 재산에 대해 위에서 설명한 주어연구 ilable, 우리는 위버에 의해 개발 된 생체 폐 배양 시스템과 유사한 생체 마우스 심장 배양 시스템을 개발 하였다. ¹⁰ 우리의 문화 시스템은 전체 배아 마우스 마음에서 리모델링 관상 동맥 순환의 장기 문화와 시각화를 허용합니다. 또한, 마트 리젤의 사용에 따라서 치료 에이전트와 지역화 된 치료를 제공, 구슬이 심장에 가까운 장소에서 개최 할 수 있습니다. 이 실험은 관상 동맥 형성 등의 과정에서 주어진 치료의 효과를 비교하기 위해 다른 개발 시점에서 수행 할 수 있습니다. 작은 분자는 리겔을 통해 확산 할 수 있기 때문에,이 문화 시스템은 또한 특정 세포 - 세포 연락처가 특정 개발 프로세스에 필요하거나 다른 한 지역에서 paracrine 신호가 있는지 여부를 확인하는 서로 가까이 심장의 문화를 해부 지역에 사용할 수 있습니다 필요.

이 배양 시스템비교적 간단하고, 슬라이스 문화 시스템과는 달리, 기본적인 문화 시약 및 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 셋업을 사용합니다. 간단히, 절개 배아의 마음은 반 고체 지원을 제공 희석 리겔에 배양한다. 이 지원은 계약의 마음을 허용하면서 심장의 3 차원 형태를 유지하기에 충분합니다. 이 시스템을 사용하여, 이전 마우스 배아 (E14.5-E16.5)의 전체 마음은 최대 네 개의 일을위한 문화 유지 될 수 있습니다. 전체 관상 동맥 혈관 따위는 슬라이스 문화 달리, 유지, 그래서 마음의 다른 지역에서 발생하는 신호 단서가 존재 남아있다. 또한, 살아있는 세포 형광 염료는 살아있는 마음의 시각화를 허용하도록 마트 리젤을 침투 할 수 있고, 단백질 복합 구슬 지역화 된 신호 소스를 제공하기 위해 심장 근처에 배치 할 수 있습니다. 함께, 이러한 장점은이 기술에게 embryon의 발달 과정을 연구하기위한 이상적인 방법을IC 마우스 마음입니다.

프로토콜

1. 배아의 마음을 절개

1. 승인 안락사 기술을 사용하여 원하는 배아 일에 시간 초과 임신 마우스를 안락사. 모든 실험은 채플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
2. 대충 해부하기 전에 70 % 에탄올로 여성 스프레이. 자궁을 검색하고 소비세하는 여성의 복강을 엽니 다.
3. 차가운 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)와 필요에 린스를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 놓습니다. 첨부 된 배아 주머니를 노출 정중선을 통해 자궁을 열고 잘라.
4. 배아 주머니를 열고 잘라 배아를 검색 할 수 있습니다. 차가운 PBS로 두 번째 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 얼음 자궁 경적 페트리 접시를 돌려줍니다.
5. 가슴 벽에 대한 액세스를 개선하기 위해 태아의 목을 베십시오. 유전자형이 필요한 경우, 제거하고 얼음에 배치 에펜 도르프 튜브에 꼬리를 저장합니다.
6. 와그것의 뒤에 태아는 심장과 폐를 시각화하는 가슴 벽을 열고 잘라. 단계에 따라 가슴 벽이 투명 할 수 있습니다.
7. 조심스럽게 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라. 그런 마음을 해방하는 큰 그릇 위에 잘라. 필요한 경우, 불필요한 조직을 제거합니다.
8. 차가운 PBS로 가득 찬 24 잘 접시의 잘 하나에 마음을 놓고 얼음에 접시를 놓습니다.
9. 마음은 모든 배아에서 적출 될 때까지 이전 단계를 반복합니다.

2. 문화 셋업

1. 층류 후드에 1:1 비율로 차가운 리겔하고 원하는 문화 매체 (Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) 예를 들면 10 % 태아 소 혈청 (FBS)) 결합. 미리 따뜻한 문화 매체하지 않습니다.
2. 얼음도 얼음에 유지되는 24 잘 배양 접시의 잘으로 희석 용액의 피펫 500 ~ 1,000 μL의 희석 마트 리젤을 유지.
3. 후드에서 신중하게 픽업과 절제를 배치마트 리젤 함유 배양 접시의 잘 심장 얼음에 문화 접시를 유지하면서.
4. 임베디드 마음의 방향이 매우 중요합니다 경우 대충 70 % 에탄올로 거꾸로 현미경과 주변 공간을 스프레이. 후드 반면, 여전히 얼음 마트 리젤 함유 문화 판의 잘 절제의 마음을 놓으십시오. 그런 다음, 현미경 플레이트를 배치하고 신속하게 방향을 절제 마음을 마트 리젤이 응고하기 시작.
5. 가습 37 ° C 배양기 (5 % CO _2)에 배양 접시를 놓고 마트 리젤 약 30 분 동안 응고 할 수 있습니다.
6. 잘 마음을 포함하는 각에 1 ML 미리 예열 문화 매체를 추가합니다.
7. 마음은 적어도 나흘 문화에 남아있을 수 있습니다. 배지 2 일마다 변경하는 것이 좋습니다.

3. 고정 및 시각화

1. 원하는 경우, 살아있는 마음을 시각화하기 위해 (예를 들어 SYTO-16) 형광 라이브 세포 염료를 추가합니다. 사진이 될 것입니다이 포함되었을 때의 위치에 따라 볼 수있는 마음의 측면에 제한됩니다.
2. 후 배양 분석 (예 : 전체 마운트 영상 또는 단면)을 수행 할 경우, 배양액을 제거하고 차가운 4 % 포름 알데히드로 교체합니다. 30 분 동안 얼음에 접시를 놓습니다.
3. 차가운 포름 알데히드와 얼음 마트 리젤의 용해를 촉진 한 후, 신선한 포름 알데히드와 (과 마트 리젤) 정착액을 교체하고 4에서 하룻밤 마음 ° C.를 해결
4. 4 ° C까지 추가 분석에서 버퍼 (예 : PBS 또는 트리스) 및 저장과 마음을 씻으십시오.

결과

이 기술을 사용하여, 마음은 3 차원의 형태를 유지하고 가능한 유지 등의 지속적인 수축 (동영상 1)로 표시. 이러한 수축은 심실에 비해 심방에서 지속적으로 더 유명하다. 문화에 따라, 마음은 고정 및 처리 특정 마커 식 또는 구조를 검사하는 면역 또는 조직학도합니다. 그림 1A는 고정, 24 시간 동안 배양 한 배아 마우스 심장의 심실과 대 혈관의 기초를 보여줍니다 대해 ?...

토론

현재 문화권 시스템은 마우스 배아 심장 연구에 상당한 이점을 포즈. 이 문화 시스템도 문화 사일 후 괴사의 제한 징후와 심근 수축력과 관상 동맥 신경총을 보존합니다. 또한, 반 고체 매트릭스 문화 동안 자리에 코팅 구슬을 보유하는 것이 계약의 유연성을 허용하면서 개발 중심의 3 차원 형태를 유지하기 위해 충분한 지원합니다. 이러한 지원에도 불구하고,이 행렬은 살아있는 마음의 형광 분?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110