A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Verfahren zur embryonalen Maus Herz

Zusammenfassung

Developmental Studien in der Maus durch die Unzugänglichkeit des Embryos während der Schwangerschaft behindert. Um die langfristige Kultur der embryonalen Herzen im späten Stadien der Schwangerschaft zu fördern, haben wir ein Protokoll, in dem die ausgeschnittene Herz in einem semi-solid, verdünnter Matrigel kultiviert wird.

Zusammenfassung

Developmental Studien in der Maus durch die Unzugänglichkeit des Embryos während der Schwangerschaft behindert. So, um Protokolle zu isolieren und Kultur einzelner Organe von Interesse sind unerlässlich, um ein Verfahren zur Visualisierung von Veränderungen sowohl in der Entwicklung und ermöglicht neuartige Behandlungsstrategien bieten. Um die langfristige Kultur der embryonalen Herzen im späten Stadien der Schwangerschaft zu fördern, haben wir ein Protokoll, in dem die ausgeschnittene Herz in einem semi-solid, verdünnter Matrigel kultiviert wird. Dieses Substrat bietet genug Unterstützung, um die dreidimensionale Struktur zu erhalten, ist aber flexibel genug, um anhaltende Kontraktion zu ermöglichen. Kurz Herzen sind aus dem Embryo herausgeschnitten und in einem Gemisch aus kaltem Matrigel 1:1 mit Wachstumsmedium. Nach dem verdünnten Matrigel erstarrt, wird das Wachstum mittel-bis der Kulturschale gegeben. Herzen so spät wie embryonalen Tag 16,5 herausgeschnitten lebensfähig waren für vier Tage nach der Präparation. Analyse der koronaren Plexus zeigt, dass dieses Verfahren nicht der Fall iststören koronaren vaskulären Entwicklung. So stellen wir eine neue Methode für die langfristige Kultur von embryonalen Herzen.

Einleitung

In den letzten Jahren hat sich die transgene Maus die vorherrschende Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung Herzfehler. Aber auch andere Modell Organismen, wie zum Beispiel dem Zebrafisch, erwiesen erhebliche Vorteile gegenüber der Maus haben. Drei wichtige Vorteile der Zebrafisch sind die externen Eiablage zur Erleichterung des Zugangs zu den Embryonen, die optische Transparenz der Embryonen, die einen einfachen Visualisierung der kardialen Entwicklung ermöglicht, und die Leichtigkeit der Anwendung niedermolekulare Behandlungen zu modulieren Entwicklung des Embryos ^1. Somit würde die Entwicklung einer Technik, die ex utero Wachstum eines embryonalen Organ erlaubt umgehen, wenigstens teilweise die Grenzen forschungsaktuell Studium Entwicklungsprozesse in transgenen Mäusen erfahren.

Ex vivo kardialen Kultur-Systeme sowohl in der Küken und Maus-Embryo entwickelt, ermöglichen die Behandlung mit kleinen Molekülen und Analyse der verschiedenen Regionen des Herzens kommunizieren ^2-6. Für ganze Maus Herz kultur, herzen von Embryonen bis zu embryonalen genommen (E) 12.5 Alter kann in Kulturmedium mit oder ohne rocking ^2,3,5 platziert werden. Mit dieser Technik haben embryonalen Herzen erfolgreich auf die Gleichwertigkeit der E13.5 inkubiert und Herzen mit rocking kultiviert wurden so lange wie drei Tage (ab E10.5) ³ erhalten. Es wurden jedoch keine Studien die erfolgreiche Kultur der Herzen von älteren Embryonen berichtet. Ebenso wurden Experimente rescue dem Aufbringen des therapeutischen Mittels global zu dem Kulturmedium ² begrenzt.

Ein Stück Kultur, bei dem Herzen ausgeschnitten, eingebettet sind, und im Schnitt mit einem Vibratom hat auch für jüngere Herzen wie E12.5 Maus Herzen und Hamburger-Hamilton Stufe 36 (etwa E16 in der Maus) Küken Herzen ausgenutzt ^2,4,6 und ältere Herzen, wie postnatalen und adulten Maus heARTS und erwachsenen menschlichen Herzen ^7,8. Während die embryonalen Analysen typischerweise 150 um dicke Abschnitte ^2,4 genutzt haben, können eine große Schnittdicke als 500 um betragen ohne Nachweis von Sauerstoffmangel ^8. Diese Scheibe Kulturen haben so lange wie zwei Monate in Kultur gehalten wurden, mit den meisten Scheiben Aufrechterhaltung Kontraktilität während dieser Zeit ^9. Im Vergleich zu Studien in isolierten Herzmuskelzellen, erlauben diese Scheibe Kulturen der Co-Kultur von Herzmuskelzellen mit ihren benachbarten Zelltypen und eine nützliche Methode zur ex vivo Analyse. Jedoch erfordern diese Kulturen aufwendiger Satzes als einfach dadurch ein Herz in Kulturmedium (zB Einbetten des lebenden Herzen zum Schneiden auf einem Vibratom), und eine Analyse ist offensichtlich auf den Teil des Herzens innerhalb des Abschnitts begrenzt.

Angesichts der oben beschriebenen Einschränkungen für die Kultivierung embryonaler Maus Herzen und der Fülle von transgenen Mäusen available für Studie haben wir eine Ex-vivo-Maus Herz Kultur-System ähnlich wie ein ex vivo Lungen-Kultur-System von Weaver entwickelt zu werden, ermöglicht et al. Unsere Kultur ¹⁰ System langfristig Kultur und Visualisierung der Umbau Koronarzirkulation innerhalb ganzen embryonalen Maus Herzen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Matrigel Perlen in in der Nähe des Herzens gehalten werden, wodurch eine lokalisierte Behandlung mit therapeutischen Mitteln. Diese Versuche können in verschiedenen Entwicklungsstadien Zeitpunkten durchgeführt werden, um die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf ein Verfahren wie koronare Bildung zu vergleichen. Da kleine Moleküle durch Matrigel diffundieren kann, kann dieses Kultursystem auch zur Kultur präpariert Regionen des Herzens in der Nähe zueinander, um zu bestimmen, ob bestimmte Zell-Zell-Kontakte, die für bestimmte Entwicklungsprozesse oder ob parakrine Signalisierung von einem Bereich zum anderen ist es verwendet werden erforderlich.

Diese Kultur-Systemist relativ einfach und im Gegensatz zur Scheibe Kultur-System, nutzt grundlegende Kultur Reagenzien und Set-ups, die leicht verfügbar in den meisten Labors sind. Kurz gesagt, werden herausgeschnitten embryonalen Herzen in verdünnter Matrigel, das eine semi-festen Träger enthält, kultiviert. Diese Unterstützung ausreichend ist, um die dreidimensionale Morphologie des Herzens befindet und ermöglicht gleichzeitig das Herz kontrahiert. Mit diesem System können ganze Herzen von älteren Maus-Embryonen (E14.5-E16.5) in Kultur für bis zu vier Tage gehalten werden. Die gesamte koronare Plexus aufrechterhalten wird, anders als in den Schnittkulturen, so dass alle Signal-Signale, die von verschiedenen Regionen des Herzens auftreten vorhanden bleiben. Darüber hinaus können in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe durchdringen die Matrigel bis zur Visualisierung der Live-Herzen zu ermöglichen, und Protein-konjugierten Perlen können in der Nähe des Herzens platziert werden, um eine lokalisierte Signalisierung Quelle bereitzustellen. Zusammen machen diese Vorteile diese Technik eine ideale Methode zur Untersuchung Entwicklungsprozesse im Embryoic Maus Herz.

Protokoll

1. Herausschneiden der embryonalen Herzen

1. Euthanize eine Zeitfahr-schwangeren Maus an der gewünschten embryonalen Tag mit einem zugelassenen Euthanasie Technik. Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt.
2. Liberally sprühen die weiblichen mit 70% Ethanol vor Dissektion. Öffnen Sie den weiblichen Bauchhöhle abzurufen und Verbrauchsteuern die Uterushorns.
3. Legen Sie die Uterushorns in eine Petrischale mit kaltem 1x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und spülen Sie nach Bedarf. Schneiden Sie die Uterushorns über der Mittellinie, um die angeschlossenen embryonalen Säcke freizulegen.
4. Schneiden Sie einen Fruchtblase und Abrufen eines Embryos. Setzen Sie den Embryo in einer zweiten Petrischale mit kaltem PBS. Bringen Sie die Petrischale mit dem Uterushorn zu Eis.
5. Enthaupte des Embryos, um den Zugriff auf die Brustwand zu verbessern. Wenn Genotypisierung notwendig ist, zu entfernen und speichern den Schwanz in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gelegt.
6. Mit demEmbryo auf dem Rücken, schnitt den Brustwand auf das Herz und die Lunge zu visualisieren. Je nach Stadium kann die Brustwand transparent sein.
7. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie die Schiffe unten. Dann, vor den großen Gefäßen geschnitten, um das Herz zu befreien. Wenn nötig, entfernen Sie überflüssige Gewebe.
8. Legen Sie das Herz in eine Vertiefung einer 24-Well-Schale mit kaltem PBS gefüllt und die Schale auf Eis.
9. Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis alle Herzen von Embryonen herausgeschnitten haben.

2. Kultur Set-up

1. In einer laminaren Haube verbinden kaltem Matrigel und die gewünschte Kulturmedium (z. B. 10% fötalem Rinderserum (FBS) in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM)) im Verhältnis 1:1. Nicht vorwärmen das Kulturmedium.
2. Keeping the verdünnter Matrigel auf Eis, Pipette 500-1000 ul der verdünnten Lösung in eine Vertiefung einer 24-Well-Kulturschale, die auch auf Eis gehalten.
3. In der Haube, sorgfältig abholen und legen Sie den ausgeschnittenenHerz in einer Vertiefung der Matrigel enthaltenden Kulturschale während die Kulturschale auf Eis.
4. Wenn Ausrichtung des eingebetteten Herz ist entscheidend: Großzügig sprühen einem inversen Mikroskop und den umgebenden Raum mit 70% Ethanol. In der Haube, legen Sie das ausgeschnittene Herz in einer Vertiefung der Matrigel-haltigen Kultur Platte, während immer noch auf Eis. Legen Sie dann die Platte auf einem Mikroskop und schnell orientieren die ausgeschnitten Herz als das Matrigel zu verfestigen beginnt.
5. Legen Sie die Kulturschale in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator (5% CO ₂₎ und lassen Sie das Matrigel für ca. 30 min zu festigen.
6. 1 ml vorgewärmten Kulturmedium in jede Vertiefung, die ein Herz.
7. Herzen können in Kultur für mindestens vier Tage bleiben. Ändern das Kulturmedium alle zwei Tage wird empfohlen.

3. Fixierung und Visualisierung

1. Falls gewünscht, einen fluoreszierenden Farbstoff lebenden Zellen (zB Syto-16), um die Live-Herz visualisieren. Fotografie wirdbegrenzt auf die Seite des Herzens, die sichtbar ist, basierend auf der Position, in der sie eingebettet ist.
2. Wenn Post-Kultivierung Analysen (z. B. ganze Berg Bildgebung oder Schneiden) durchgeführt werden, entfernen Sie das Kulturmedium und ersetzen mit kaltem 4% Formaldehyd. Die Schale auf Eis für 30 min.
3. Nach dem kalten Eis Formaldehyd und fördern Auflösung des Matrigel, ersetzen Sie das Fixativ (und Matrigel) mit frischem Formaldehyd und beheben Herzen über Nacht bei 4 ° C.
4. Waschen Sie die Herzen mit Puffer (zB PBS oder Tris) und bei 4 ° C bis zur weiteren Analyse.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieser Technik das Herz seine dreidimensionale Morphologie erhält und lebensfähig bleibt, wie durch fortgesetzte Kontraktionen (Movie 1). Diese Kontraktionen sind durchweg mehr im Vordergrund als in den Vorhöfen in die Herzkammern. Nach Kultur, kann Herzen fixiert und entweder für Immunohistochemie oder Histologie Marker-Expression oder Strukturen untersuchen verarbeitet werden. 1A zeigt den Boden der Kammern und der großen Arterien eines embryonalen Maus Herz, das...

Diskussion

Die aktuelle Kultur-System stellt erhebliche Vorteile für die embryonale Maus Herz Studien. Diese Kultur-System bewahrt Kontraktilität und die koronare Plexus, mit begrenzten Zeichen der Nekrose, auch nach vier Tagen in Kultur. Ferner stellt die halbfeste Matrix genug Unterstützung, um die dreidimensionale Morphologie der Entwicklung von Herz zu halten, während eine Flexibilität bis zum Vertragsabschluss und auch beschichtete Kügelchen in Position zu halten, während der Kultur. Trotz dieser Unterstützung ist die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110