A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Resumen

Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido.

Resumen

Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Por lo tanto, los protocolos para aislar y cultivo de órganos individuales de interés son esenciales para proporcionar un método de visualización de los dos cambios en el desarrollo y permitiendo nuevas estrategias de tratamiento. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido. Este sustrato proporciona apoyo suficiente para mantener la estructura tridimensional, pero es lo suficientemente flexible para permitir la contracción continua. En breve, los corazones se escinden a partir del embrión y se colocaron en una mezcla de Matrigel frío diluido 1:1 con medio de crecimiento. Después de la Matrigel diluido se solidifica, se añade medio de cultivo a la placa de cultivo. Corazones extirpados tan tarde como el día embrionario 16,5 eran viables durante cuatro días después de la disección. Análisis del plexo coronaria demuestra que este método no haceinterrumpir el desarrollo vascular coronaria. Por lo tanto, se presenta un nuevo método para el cultivo a largo plazo de los corazones embrionarias.

Introducción

En los últimos años, el ratón transgénico ha sido el sistema de modelo predominante para el estudio de defectos cardíacos de desarrollo. Sin embargo, otros organismos modelo, tales como el pez cebra, han demostrado tener ventajas significativas sobre el ratón. Tres principales ventajas de la pez cebra son la colocación externa de los huevos, para la facilidad de acceso a los embriones; la transparencia óptica de los embriones, lo que permite una fácil visualización del desarrollo cardíaco, y la facilidad de la aplicación de tratamientos moleculares pequeños para modular el desarrollo del embrión ^1. Por lo tanto, el desarrollo de una técnica de cultivo que permitió el crecimiento ex útero de un órgano embrionario pasaría por alto, al menos en parte, las limitaciones actualmente experimentadas por los investigadores que estudian los procesos de desarrollo en ratones transgénicos.

Sistemas de cultivo cardíacos ex vivo se han desarrollado en tanto que el polluelo y embrión de ratón que permiten el tratamiento con pequeñas moléculas y análisis de cómo las diferentesrentes regiones del corazón comunican ^2-6. Para el conjunto de la cultura corazón de ratón, corazones tomadas de embriones hasta embrionario (E) 12,5 de edad se puede colocar en medio de cultivo con o sin balanceo ^2,3,5. Usando esta técnica, corazones embrionarias se han incubado con éxito a la equivalencia de E13.5, y corazones cultivadas con balanceo se han mantenido tanto tiempo como tres días (a partir de E10.5) ^3. Sin embargo, no hay estudios han informado de la cultura éxito de los corazones de los embriones más viejos. Del mismo modo, los experimentos de rescate se han limitado a la aplicación del agente terapéutico a nivel mundial para el medio de cultivo ^2.

Un sistema de cultivo de cortes, en el que se extirparon los corazones, incrustados, y se seccionaron utilizando un vibratomo, también se ha utilizado para ambos corazones más pequeños, tales como corazones de ratón E12.5 y Hamburger-Hamilton etapa 36 (aproximadamente E16 en el ratón) de pollo corazones ^2,4,6, y más corazones, como postnatal y adulto del ratón hearts y corazones humanos adultos ^7,8. Si bien los análisis embrionarias han utilizado típicamente secciones gruesas de 150 micras ^2,4, espesor de corte puede ser un gran hasta 500 micras, sin evidencia de la falta de oxígeno ^8. Estos cultivos de corte se han mantenido hasta dos meses en la cultura, con la mayoría de las rebanadas mantener la contractilidad durante todo este período ^9. En comparación con estudios en cardiomiocitos aislados, estos cultivos de cortes permiten que el co-cultivo de cardiomiocitos con sus tipos de células vecinas y proporcionan un método útil para el análisis ex vivo. Sin embargo, estos cultivos requieren más elaborado configuración que simplemente colocar un corazón en el medio de cultivo (por ejemplo, incrustar el corazón vivo para seccionar en un vibratome), y cualquier análisis es, obviamente, limitado a la porción del corazón dentro de la sección.

Dadas las limitaciones descritas anteriormente para el cultivo de embriones de ratón de los corazones y la riqueza de los ratones transgénicos available para estudio, hemos desarrollado un ratón sistema de cultivo ex vivo de corazón similar a un sistema de cultivo ex vivo de pulmón desarrollado por Weaver, et al. ¹⁰ Nuestro sistema de cultivo permite cultivo a largo plazo y la visualización de la circulación coronaria remodelación dentro de corazones enteros embrionarias de ratón. Además, el uso de perlas de Matrigel permite que se mantienen en su lugar cerca del corazón, proporcionando de este modo un tratamiento localizado con agentes terapéuticos. Estos experimentos se pueden realizar en diferentes puntos de tiempo de desarrollo para comparar el efecto de un tratamiento dado en un proceso tal como la formación de la arteria coronaria. Debido a que las pequeñas moléculas pueden difundir a través de Matrigel, este sistema de cultivo también se puede utilizar para cultivo de regiones disecadas del corazón cerca unos de otros para determinar si los contactos célula-célula específicos son necesarios para ciertos procesos de desarrollo o si la señalización paracrina de una región a la otra es necesario.

Este sistema de cultivoes relativamente simple y, a diferencia del sistema de cultivo de cortes, hace uso de los reactivos de cultivo básicas y configuraciones que son fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. En breve, los corazones embrionarios extirpados se cultivan en Matrigel diluido, que proporciona un soporte semisólido. Este apoyo es suficiente para mantener la morfología tridimensional del corazón mientras que también permite la contracción del corazón. El uso de este sistema, corazones enteros de embriones de ratón E14.5 (mayores-E16.5) se pueden mantener en cultivo durante hasta cuatro días. El plexo coronaria entera se mantiene, a diferencia de los cultivos de cortes, por lo que cualquier señales de señalización que se producen a partir de diferentes regiones del corazón siguen presentes. Además, los tintes fluorescentes de células en vivo pueden permear el Matrigel para permitir la visualización del corazón vivo, y perlas de proteína-conjugados se pueden colocar cerca del corazón para proporcionar una fuente localizada de señalización. En conjunto, estas ventajas hacen de esta técnica un método ideal para el estudio de los procesos de desarrollo en el embriónic corazón de ratón.

Protocolo

1. Escisión los corazones embrionarias

1. La eutanasia a un ratón de disolución-embarazada en el día embrionario deseado usando una técnica de eutanasia aprobada. Todos los experimentos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.
2. Rocíe la hembra con etanol al 70% antes de la disección. Abra la cavidad abdominal de la hembra para recuperar y extirpar la trompa uterina.
3. Coloque el cuerno uterino en una placa de Petri que contiene frío 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y enjuague según sea necesario. Cortar el cuello uterino a través de la línea media para exponer los sacos embrionarios adjuntos.
4. Cortar un saco embrionario y recuperar un embrión. Coloque el embrión en una segunda placa de Petri con PBS frío. Devuelva la placa de Petri con el cuerno uterino en hielo.
5. Decapita el embrión para mejorar el acceso a la pared torácica. Si genotipado es necesario, retire y guarde la cola en un tubo Eppendorf se coloca en hielo.
6. Con elembrión en su parte posterior, cortada abrir la pared torácica para visualizar el corazón y los pulmones. Dependiendo de la etapa, la pared torácica puede ser transparente.
7. Levante con cuidado el corazón con las pinzas y cortar los vasos a continuación. Luego, corte por encima de los grandes vasos para liberar el corazón. Si es necesario, eliminar los tejidos extraños.
8. Coloque el corazón en un pocillo de una placa de 24 pocillos llena con PBS frío y colocar el plato en hielo.
9. Repita los pasos anteriores hasta que los corazones han sido extirpados de los embriones.

2. Cultura Set-up

1. En una campana laminar, combinar Matrigel frío y el medio de cultivo deseado (por ejemplo, 10% de suero bovino fetal (FBS) en Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)) en una proporción de 1:1. No te pre-calentar el medio de cultivo.
2. Mantener el Matrigel diluido en hielo, pipeta 500-1.000 l de la solución diluida en un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos que también se mantiene en hielo.
3. En la capilla, elige con cuidado y coloque la extirpadocorazón en un pocillo de la placa de cultivo que contiene Matrigel mientras se mantiene la placa de cultivo en hielo.
4. Si la orientación del corazón incrustado es crucial: rociar generosamente un microscopio invertido y el espacio circundante con etanol al 70%. En la campana, colocar el corazón extirpado en un pocillo de la placa de cultivo que contiene Matrigel mientras que todavía en el hielo. Luego, coloque la placa en un microscopio y orientar rápidamente el corazón extirpado como Matrigel comienza a solidificarse.
5. Coloque la placa de cultivo en un 37 ° C humidificado incubadora (5% CO ₂₎ y permitir que el Matrigel se solidifique durante aproximadamente 30 min.
6. Añadir 1 medio de cultivo pre-calentado ml a cada pocillo que contiene un corazón.
7. Los corazones pueden mantenerse en cultivo durante al menos cuatro días. Se recomienda cambiar el medio de cultivo cada dos días.

3. La fijación y visualización

1. Si lo desea, agregue un colorante fluorescente de células vivas (por ejemplo Syto-16) para visualizar el corazón vivo. Fotografía estarálimitado a la parte del corazón que es visible sobre la base de la posición en la que se ha incrustado.
2. Si se realizaron análisis post-cultivo (por ejemplo, formación de imágenes de todo el montaje o seccionar), eliminar el medio de cultivo y reemplazar con formaldehído 4% frío. Coloque el plato en hielo durante 30 min.
3. Después de que el formaldehído frío y el hielo promover la disolución de la Matrigel, reemplazar el fijador (Matrigel) con formaldehído fresco y fijar corazones durante la noche a 4 ° C.
4. Lavar los corazones con tampón (por ejemplo, PBS o Tris) y se almacena a 4 ° C hasta su posterior análisis.

Resultados

Usando esta técnica, el corazón mantiene su morfología tridimensional y sigue siendo viable, como se indica por las contracciones continuas (Película 1). Estas contracciones son consistentemente más prominente en las aurículas que en los ventrículos. Después del cultivo, los corazones pueden ser fijadas y procesadas para la histología o inmunohistoquímica ya sea para examinar la expresión o estructuras marcador específico. Figura 1A muestra la base de los ventrículos y las ...

Discusión

El sistema de cultivo actual plantea importantes ventajas para estudios cardíacos embrionarios de ratón. Este sistema de cultivo conserva la contractilidad miocárdica y el plexo coronaria, con signos de necrosis limitadas, incluso después de cuatro días en cultivo. Además, la matriz semisólida proporciona el apoyo suficiente para mantener la morfología tridimensional del corazón en desarrollo al tiempo que permite flexibilidad para contrato y también para mantener perlas recubiertas en su lugar durante el cult...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110