A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Resumo

Estudos de desenvolvimento no rato são dificultados pela inacessibilidade do embrião durante a gestação. Para promover a cultura de longo prazo do coração embrionário em fases tardias da gestação, foi desenvolvido um protocolo no qual o coração excisado é cultivada num Matrigel semi-sólido, diluída.

Resumo

Estudos de desenvolvimento no rato são dificultados pela inacessibilidade do embrião durante a gestação. Assim, os protocolos de cultura e para isolar os órgãos individuais de interesse são essenciais para proporcionar um método de visualização de ambas as alterações no desenvolvimento e permitindo que novas estratégias de tratamento. Para promover a cultura de longo prazo do coração embrionário em fases tardias da gestação, foi desenvolvido um protocolo no qual o coração excisado é cultivada num Matrigel semi-sólido, diluída. Este substrato proporciona suporte suficiente para manter a estrutura tridimensional, mas é suficientemente flexível para permitir a contracção continuada. Em resumo, os corações são cortados a partir do embrião e colocado numa mistura de Matrigel frio diluído 1:1 com meio de crescimento. Após o Matrigel diluída solidifica, meio de crescimento é adicionado à placa de cultura. Corações excisadas tão tarde como dia embrionário 16,5 eram viáveis ​​por quatro dias após a dissecação. A análise do plexo coronária mostra que este método não fazperturbar o desenvolvimento vascular coronária. Assim, apresenta-se um novo método para a cultura de longo prazo de corações embrionárias.

Introdução

Nos últimos anos, o ratinho transgénico tem sido o sistema modelo para o estudo predominante de desenvolvimento de defeitos cardíacos. No entanto, outros organismos modelo, tal como o peixe-zebra, provaram ter vantagens significativas sobre o rato. Três importantes vantagens do peixe-zebra são a colocação externa de ovos, para facilidade de acesso para os embriões, a transparência óptica dos embriões, o que permite a fácil visualização do desenvolvimento cardíaco e a facilidade de aplicação de pequenas tratamentos moleculares para modular o desenvolvimento do embrião ^1. Assim, o desenvolvimento de uma técnica de cultura que permitiu o crescimento ex utero de um dos órgãos embrionários seria ignorar, pelo menos em parte, as limitações actualmente experimentado por investigadores que estudam processos de desenvolvimento de ratinhos transgénicos.

Sistemas de cultura ex vivo cardíacos foram desenvolvidos tanto em embrião do pinto e do rato que permitem que o tratamento com pequenas moléculas e análise de como differentes regiões do coração comunicar ^2-6. Para a cultura do coração de rato inteiro, corações feita a partir de embriões até embrionária (E), 12,5 de idade podem ser colocados em meio de cultura com ou sem balançar ^2,3,5. Usando esta técnica, os corações embrionários foram incubadas com êxito para a equivalência de E13.5, e os corações foram cultivadas com agitação foi mantida enquanto três dias (a partir de E10.5) ^3. No entanto, não existem estudos têm relatado a cultura de sucesso de corações de embriões mais velhos. Da mesma forma, as experiências de resgate foram limitadas a aplicação do agente terapêutico a nível mundial para o meio de cultura ^2.

Um sistema de cultura fatia, em que corações são excisadas, incorporado, e seccionados usando um vibratome, também tem sido utilizada para ambos os corações mais jovens, como E12.5 corações de rato e Hamburger-Hamilton estágio 36 (cerca de E16 no mouse) bico corações ^2,4,6, ou mais corações, como o pós-natal e do rato adulto hearts e corações humanos adultos ^7,8. Enquanto as análises embrionárias têm tipicamente utilizado de espessura 150 mícrons ^2,4, espessura de corte pode ser um grande como 500 mM, sem evidências de privação de oxigênio ^8. Estas culturas foram mantidas de fatia, enquanto dois meses em cultura, com a maioria das fatias mantendo contractilidade ao longo deste período de ^9. Em comparação com estudos em cardiomiócitos isoladas, estas culturas fatia permitir a co-cultura de cardiomiócitos com os seus tipos de células vizinhas e fornecem um método útil para a análise ex vivo. Contudo, estas culturas requerem mais elaborada configurar do que simplesmente colocar o coração no meio de cultura (por exemplo, incorporando o coração vivo para o seccionamento num vibratome), e qualquer análise é, obviamente, limitada a parte do coração no interior da secção.

Dadas as limitações descritas acima para a cultura de coração de rato embrionárias ea riqueza de camundongos transgênicos available para o estudo, foi desenvolvido um sistema de cultura do coração de rato ex vivo semelhante a um sistema de cultura ex vivo de pulmão desenvolvidas por Weaver, et al ¹⁰ O nosso sistema de cultura. permite a cultura a longo prazo e a visualização da circulação coronária remodelação corações inteiros dentro embrionárias de ratinho. Além disso, a utilização de grânulos de Matrigel permite ser mantido no lugar perto do coração, proporcionando assim um tratamento localizado de agentes terapêuticos. Estas experiências podem ser realizadas em momentos diferentes de desenvolvimento para comparar o efeito de um determinado tratamento com um processo tal como a formação da artéria coronária. Porque as moléculas pequenas podem difundir através de Matrigel, este sistema de cultura pode também ser utilizada para a cultura regiões dissecadas do coração perto uns dos outros para determinar se os contactos célula-célula específicos são necessários para certos processos do desenvolvimento ou se parácrinos sinalização de uma região para a outra é necessário.

Este sistema de culturaé relativamente simples e, ao contrário do sistema de cultura fatia, faz uso de reagentes básicos da cultura e set-ups que estão disponíveis na maioria dos laboratórios. Em resumo, os corações são excisados ​​de embriões cultivados em Matrigel diluído, o qual proporciona um suporte semi-sólido. Este apoio é suficiente para manter a morfologia tridimensional do coração, ao mesmo tempo, permitindo que o coração contrato. Usando este sistema, corações inteiros de embriões de ratos mais velhos (E14.5, E16.5) podem ser mantidas em cultura durante quatro dias. Todo o plexo coronário é mantido, ao contrário das culturas de fatia, de modo quaisquer sinais de sinalização que ocorrem a partir de diferentes regiões do coração continuar presente. Além disso, corantes fluorescentes em células vivas, podem permear o Matrigel para permitir a visualização do coração, ao vivo, e os grânulos de proteína conjugada pode ser colocado perto do coração para proporcionar uma fonte de sinalização localizada. Juntos, esses benefícios fazem desta técnica um método ideal para o estudo de processos de desenvolvimento no embryoncoração do mouse ic.

Protocolo

1. Extirpando os corações embrionárias

1. Sacrificá um rato timed-grávida no dia embrionário desejado usando uma técnica de eutanásia aprovado. Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.
2. Liberalmente pulverizar a fêmea com etanol 70% antes da dissecação. Abra cavidade abdominal da fêmea para recuperar e impostos especiais de consumo do corno uterino.
3. Coloque a trompa uterina de uma placa de Petri contendo a frio 1x salina tamponada com fosfato (PBS) e lavagem conforme necessário. Cortar abrir o corno uterino através da linha média para expor os sacos embrionários em anexo.
4. Cortar abrir um saco embrionário e recuperar um embrião. Coloque o embrião de uma segunda placa de Petri com o frio PBS. Retorne a placa de Petri com o corno uterino em gelo.
5. Decapitar o embrião para melhorar o acesso à parede torácica. Se a genotipagem é necessário, remover e guardar a cauda num tubo Eppendorf colocada em gelo.
6. Com oembrião em suas costas, cortou a parede torácica para visualizar o coração e os pulmões. Dependendo da fase, a parede torácica pode ser transparente.
7. Levante cuidadosamente o coração usando uma pinça e cortar os vasos abaixo. Em seguida, corte acima dos grandes vasos para libertar o coração. Se necessário, remover os tecidos estranhos.
8. Colocar o coração num poço de um prato de 24 poços cheios com PBS frio e colocar o prato em gelo.
9. Repita os passos anteriores até que os corações foram retirados de todos os embriões.

2. Cultura Set-up

1. Num capuz laminar, combinar Matrigel frio e o meio de cultura desejada (por exemplo, 10% de soro fetal bovino (FBS) em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)) numa proporção de 1:1. Não pré-aquecer o meio de cultura.
2. Mantendo o Matrigel diluído em gelo, pipeta 500-1.000 ul da solução diluída para um poço de uma placa de cultura de 24 poços que também é mantido em gelo.
3. Na capa, escolha com cuidado e coloque o excisadascoração num poço da placa de cultura de Matrigel contendo mantendo a placa de cultura em gelo.
4. Se a orientação do coração encaixado é crucial: Liberalmente pulverizar um microscópio invertido e o espaço circundante com etanol a 70%. Na capa, colocar o coração retirado de uma cavidade da placa de cultura de Matrigel contendo, enquanto ainda no gelo. Em seguida, coloca a placa em um microscópio e orientar rapidamente o coração excisado como o Matrigel começa a solidificar.
5. Colocar a placa de cultura de 37 ° C humidificado incubadora (5% de CO ₂₎ e permitir que o Matrigel para solidificar durante aproximadamente 30 min.
6. Adicionar 1 ml de meio de cultura pré-aquecido a cada poço contendo um coração.
7. Corações podem permanecer em cultura durante pelo menos quatro dias. A alteração do meio de cultura de dois em dois dias é recomendado.

3. Fixação e Visualização

1. Se se desejar, adicionar um corante fluorescente em células vivas (por exemplo, Syto-16) para visualizar o coração vivo. Fotografia serálimitado ao lado do coração, que é visível com base na posição em que foi incorporado.
2. Se as análises pós-cultura (por exemplo, toda a imagem de montagem ou o corte) será realizada, remova o meio de cultura e substituir com frio formaldeído 4%. Coloque o prato no gelo por 30 min.
3. Após o formaldeído frio e gelo promover a dissolução do Matrigel, substituir o fixador (e Matrigel) com formaldeído fresco e corrigir corações durante a noite a 4 ° C.
4. Lave os corações com tampão (eg PBS ou Tris) e armazenar a 4 ° C até as análises.

Resultados

Utilizando esta técnica, o coração mantém a sua morfologia tridimensional permanece viável e, como indicado por contracções contínuas filme (1). Essas contrações são consistentemente mais proeminente nos átrios do que nos ventrículos. Após a cultura, os corações podem ser fixadas e processadas para histologia e imuno-histoquímica ou para examinar a expressão do marcador específico ou estruturas. Figura 1A mostra a base dos ventrículos e grandes artérias do coração...

Discussão

O atual sistema de cultura apresenta vantagens significativas para os estudos cardíacas embrionárias de camundongos. Este sistema de cultura preserva a contractilidade do miocárdio e do plexo coronária, com sinais limitadas de necrose, mesmo após quatro dias de cultura. Além disso, a matriz semi-sólida proporciona suporte suficiente para manter a morfologia tridimensional do coração em desenvolvimento, permitindo flexibilidade de contrato e também para segurar esferas revestidas no lugar durante a cultura. Ape...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110