Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Özet

Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir.

Özet

Fare gelişim çalışmaları gebelik sırasında embriyonun erişilememesi tarafından engellenmektedir. Bu nedenle, protokoller izole etmek ve ilgi kültürü, tek tek organların hem de geliştirme değişiklikler ve görselleştirmek sağlayan yeni tedavi stratejileri için bir yöntem sağlamak üzere gereklidir. Gebeliğin son aşamalarında embriyonik kalbin uzun vadeli bir kültür teşvik etmek için, eksize kalp, yarı-katı, seyreltik Matrigel kültüre edildiği bir protokolü geliştirilmiştir. Bu yüzey üç boyutlu yapısını korumak için yeterli destek sağlar, ancak devam eden daralma izin verecek kadar esnektir. Kısaca, kalpler embriyo çıkarıldı ve soğuk Matrigel karışımı yerleştirilir büyüme ortamı ile 1:01 seyreltilmiştir. Seyreltilmiş Matrigel katılaşmasından sonra, büyüme ortamı kültür tabağına ilave edilir. Embriyonik gün 16,5 gibi geç çıkarıldı Kalpler dört gün sonrası diseksiyon için geçerli idi. Koroner pleksus Analiz Bu yöntem, etmediğini göstermektedirkoroner damar gelişimi bozabilir. Böylece, embriyonik kalplerin uzun dönemli kültür için yeni bir yöntem sunmaktadır.

Giriş

Son yıllarda, transgenik fare gelişimi kalp kusurları eğitim için baskın model sistem olmuştur. Ancak, Zebra balığı gibi diğer model organizmalar, fare üzerinde önemli avantajlara sahip kanıtlanmıştır. Zebra balığı üç ana avantajları embriyoların erişim kolaylığı için, yumurta dış döşeme olan, kalp gelişim kolay görüntüleme sağlayan embriyoların optik şeffaflık, ve küçük moleküler tedaviler uygulama kolaylığı embriyo gelişimi modüle ^1. Böylece, bir embriyonik organı eski rahimde büyüme izin veren bir kültür tekniği gelişimi, en azından kısmen, sınırlama anda transgenik farenin gelişim süreçleri çalışan araştırmacılar tarafından yaşanan, etkisiz hale getirebilir.

Ex vivo kültür sistemleri kardiyak dif ne kadar küçük moleküller ve analiz ile muamele izin piliç ve fare embriyo hem de geliştirilmiştirKalbin lara bölgelerinde ^2-6 iletişim. Bütün fare kalbinde bir kültür için, kalpler embriyonik için embriyolarından alınmış (E) yaş 12.5 sallanan ^2,3,5 olan veya olmayan kültür ortamı içinde yerleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, embriyonik kalpleri başarıyla E13.5 en denklik için inkübe edilmiş ve sallanan ile kültür kalpleri sürece üç gün (E10.5 başlayarak) ³ olarak muhafaza edilmiş. Ancak, hiçbir çalışma eski embriyolardan kalplerin başarılı kültür bildirdin. Aynı şekilde, kurtarma deneyler, kültür ortamı ² ile genel olarak terapötik ajanı uygulayarak sınırlı olmuştur.

Kalpler, eksize gömülü ve bir vibratome kullanarak kesitli edildiği bir dilim kültür sistemi, aynı zamanda E12.5 fare kalpleri ve Hamburger-Hamilton aşamasında 36 (yaklaşık E16 fare) civciv kalpleri her iki genç kalpler, için kullanılmıştır Bu doğum sonrası ve yetişkin fare saat olarak ^2,4,6, ve eski kalpler,earts ve yetişkin insan kalpleri ^7,8. Embriyonik analizleri genellikle 150 mikron kalınlığında kesitler ^2,4 kullanılan olsa da, kesit kalınlığı oksijen yoksunluğu ⁸ kanıtı olmadan büyük 500 olarak mikron olabilir. Bu dilim kültürleri en dilimleri bu dönemde ⁹ boyunca kasılma bakımı ile, kültür iki ay sürece devam edilmiştir. Izole kardiyomiyositlerde çalışmalar ile karşılaştırıldığında, bu dilim kültürler komşu hücre tipleri ile kardiyomiyositlerinin ko-kültür izin ve ex vivo analizi için yararlı bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu kültürler sadece kültür ortamı içinde bir kalp (örneğin, bir vibratome üzerinde kesit için canlı kalp gömme) yerleştirerek daha ayrıntılı bir set-up gerektirir ve herhangi bir analiz açıkça bölüm içindeki kalbin kısmı ile sınırlıdır.

Sınırlamaları kültür embriyonik fare kalpleri ve transgenik farelerin ava zenginliği için yukarıda açıklanan verilençalışma için ilable, biz Weaver tarafından geliştirilen bir ex vivo akciğer kültür sistemi benzer bir ex vivo fare kalp kültür sistemi geliştirdi, ve ark. ^10. Bizim kültür sistemi bütün embriyonik fare kalplerinde yeniden koroner dolaşım uzun süreli kültür ve görselleştirme izin verir. Buna ek olarak, Matrigel kullanımı, böylece terapötik maddeler ile bir lokal tedavi sağlayan, boncuk kalp yakın bir yerde tutulabilir sağlar. Bu deneyler, örneğin koroner arter oluşumu gibi bir proses ile ilgili belirli bir tedavinin etkisini karşılaştırmak için farklı gelişimsel zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. Küçük moleküllerin Matrigel difüzyonuna olduğundan, bu kültür sistemi, aynı zamanda belirli bir hücre-hücre temas bazı gelişim süreçleri için gerekli ya da başka bir bölgeden parakrin sinyal olup olmadığını olup olmadığını belirlemek için birbirlerine yakın kalp kültürü parçalara bölgeleri için kullanılabilir gerekli değildir.

Bu kültür sisteminispeten basit ve kesit kültürü sisteminden farklı olarak, temel kültür çoğu laboratuar reaktifler ve hazır olan set-up kullanır. Kısaca, kalpler kesilen embriyonik bir yarı-katı bir destek içerir, seyreltik Matrigel kültürlenmiştir. Bu destek, kalbin büzülmesine izin verirken, kalbin üç boyutlu morfolojisi korumak için yeterlidir. Bu sistemi kullanarak, eski bir fare embriyoları (E14.5-E16.5) gelen bütün kalpleri dört gün için kültür korunabilir. Tüm koroner pleksus dilim kültürlerde farklı, tutulan, bu nedenle kalbin farklı bölgelerinden meydana gelen sinyal ipuçları mevcut kalır. Ayrıca, canlı hücre floresan boyalar canlı kalbin görüntülenmesi izin vermek için, Matrigel nüfuz edebilir, ve protein ile konjüge boncuk lokalize bir sinyal kaynağı sağlamak için kalp yakın yerleştirilebilir. Birlikte, bu avantajları bu teknik embriyo gelişim süreçlerini incelemek için ideal bir yöntem yapmakic fare kalp.

Protokol

1. Embriyonik Kalpler eksize

1. Onaylanmış bir ötenazi tekniği kullanarak istenen embriyonik gün bir zamanlı hamile fare Euthanize. Tüm deneyler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
2. Liberal diseksiyon önce% 70 etanol ile kadın sprey. Uterin boynuz almak ve tüketim için dişinin karın boşluğuna açın.
3. Soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ve gerektiğinde durulama içeren bir Petri kabındaki uterin horn yerleştirin. Ekli embriyonik kesesi ortaya çıkarmak için orta hat üzerinden uterin horn açın kesin.
4. Bir embriyonik kese açık kesin ve bir embriyo almak. Soğuk PBS ile ikinci bir Petri tabağına yerleştirin embriyo. Buz rahim boynuz ile Petri kabı dönün.
5. Göğüs duvarı erişimi artırmak için embriyo başını kesmek. Genotiplendirme gerekli ise, çıkarın ve buz üzerinde yerleştirilen bir Eppendorf tüp kuyruk kaydedin.
6. Ilesırtında embriyo, kalp ve akciğer görselleştirmek için göğüs duvarı açın kesti. Sahne bağlı olarak, göğüs duvarı şeffaf olabilir.
7. Dikkatlice forseps kullanarak kalp kaldırın ve aşağıdaki damarları kesti. Daha sonra, kalp boşaltmak için büyük damarların üzerinde kesti. Gerekirse, yabancı dokuları çıkarın.
8. Soğuk PBS ile doldurulmuş, 24 kuyulu bir çanak iyi birinin kalp koyun ve buz üzerine kabı yerleştirin.
9. Kalpleri tüm embriyolardan eksize edilmiştir kadar önceki adımları tekrarlayın.

2. Kültür Kurulum

1. Laminar bir başlık olarak, 1:1 oranında soğuk Matrigel ve istenen kültür ortamı (Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM), örneğin,% 10 fetal sığır serumu (FBS)) birleştirir. Ön ısıtma kültür ortamı yok.
2. Buz, aynı zamanda buz üzerinde muhafaza edilir ve bir 24-çukurlu kültür çanağı bir kuyuya seyreltilmiş bir çözelti pipetle 500-1.000 ul seyreltilmiş Matrigel üzerinde tutulması.
3. Kaputu, dikkatli almak ve eksize yerMatrigel içeren kültür çanak bir de kalp buz üzerinde kültür çanak tutarken.
4. Gömülü kalp yönü önemli ise: Liberal% 70 etanol ile ters bir mikroskop ve çevresindeki alan sprey. Kaputu, ise hala buz üzerinde Matrigel içeren kültür plaka bir kuyuda eksize kalp yerleştirin. Daha sonra, bir mikroskop plaka yerleştirin ve hızlı bir şekilde yönlendirmek eksize kalp Matrigel katılaşmaya başlar.
5. Bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 _CO2) içinde kültür tabağına yerleştirin ve Matrigel yaklaşık 30 dakika boyunca katılaşmasını sağlar.
6. Iyi bir kalp içeren her 1 ml önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.
7. Kalpler en az dört gün boyunca kültür kalabilir. Kültür ortamı her iki günde bir değiştirilmesi tavsiye edilir.

3. Tespit ve Görselleştirme

1. Arzu edildiği takdirde, canlı kalp görselleştirmek için (örneğin SYTO-16), bir floresan boya canlı hücre ekleyin. Fotoğraf olacakbu gömülü edildiği konumuna dayalı görünür kalbin tarafına sınırlı.
2. Sonrası kültür analizleri (örneğin tüm montaj görüntüleme veya kesit) yapılacak ise, kültür ortamı çıkarın ve soğuk% 4 formaldehit ile değiştirin. 30 dakika boyunca buz üzerinde tabağına yerleştirin.
3. Soğuk formaldehit ve buz Matrigel dağılması teşvik sonra, taze formaldehit ile (ve Matrigel) fiksatif yerine ve 4 gece kalpleri ° C düzeltmek
4. 4 ° C kadar daha analizler de tampon (örneğin PBS veya Tris) ve mağaza ile kalpleri yıkayın.

Sonuçlar

Bu tekniği kullanarak, kalp üç boyutlu morfoloji korur ve canlı kalır, olarak devam kasılmalar (Film 1) ile gösterilir. Bu kasılmalar ventrikül daha kulakçıklar sürekli olarak daha belirgindir. Kültür ardından, kupa sabit ve işlenmiş özel işaretleyici ifade veya yapıları incelemek için immünhistokimya veya histoloji biri için. Şekil 1A sabit, 24 saat süre ile kültüre olan bir embriyonik fare kalp ventriküller ve büyük arterlerin taban gösterir ve için i?...

Tartışmalar

Mevcut kültür sistemi embriyonik fare kalp çalışmalar için önemli avantajlar teşkil etmektedir. Bu kültür sistemi bile kültüründe dört gün sonra, nekroz sınırlı işaretleri ile miyokardiyal kasılma ve koroner pleksus, korur. Bundan başka, yan-katı matris kültürü sırasında yerinde kaplanmış boncuklar tutmak için, aynı zamanda sözleşmesi esneklik sağlayan ve geliştirme sırasında kalbin üç boyutlu morfolojisi korumak için yeterli destek sağlar. Bu destek rağmen, bu matris, canlı ka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110