A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metodo di Cultura per il mouse embrionale del cuore

Riepilogo

Studi di sviluppo nel topo sono ostacolati dalla inaccessibilità dell'embrione durante la gestazione. Per promuovere la cultura a lungo termine del cuore embrionale in fase avanzata di gestazione, abbiamo sviluppato un protocollo in cui il cuore asportato è colto in un semi-solido, Matrigel diluito.

Abstract

Studi di sviluppo nel topo sono ostacolati dalla inaccessibilità dell'embrione durante la gestazione. Così, protocolli di isolare e cultura singoli organi di interesse sono essenziali per fornire un metodo di entrambe visualizzando cambiamenti nello sviluppo e consentendo nuove strategie terapeutiche. Per promuovere la cultura a lungo termine del cuore embrionale in fase avanzata di gestazione, abbiamo sviluppato un protocollo in cui il cuore asportato è colto in un semi-solido, Matrigel diluito. Questo substrato fornisce supporto sufficiente per mantenere la struttura tridimensionale, ma è sufficientemente flessibile per consentire una continua contrazione. In breve, i cuori sono tagliate dal embrione e collocate in una miscela di Matrigel freddo diluito 1:1 con terreno di crescita. Dopo la Matrigel diluito solidifica, è aggiunto terreno di crescita al piatto cultura. Cuori asportati il ​​più tardi giorno embrionale 16,5 erano vitali per quattro giorni dopo la dissezione. Analisi del plesso coronarico dimostra che questo metodo noninterrompere lo sviluppo vascolare coronarico. Così, presentiamo un nuovo metodo per coltura a lungo termine di cuori embrionali.

Introduzione

Negli ultimi anni, il topo transgenico è stato il sistema modello per lo studio predominante difetti cardiaci sviluppo. Tuttavia, altri organismi modello, come il pesce zebra, hanno dimostrato di avere vantaggi significativi rispetto al mouse. Tre vantaggi principali del zebrafish sono la posa esterna delle uova, per facilità di accesso alle embrioni; la trasparenza ottica degli embrioni, che permette una facile visualizzazione di sviluppo cardiaco, e la facilità di applicazione piccole trattamenti molecolari per modulare sviluppo dell'embrione ^1. Pertanto, lo sviluppo di una cultura tecnica che ha permesso ex crescita in utero di un organo embrionale sarebbe bypassare, almeno in parte, le limitazioni attualmente sperimentato dai ricercatori che studiano i processi dello sviluppo in topi transgenici.

Sistemi di coltura ex vivo cardiaci sono stati sviluppati sia nella pulcino ed embrione di topo che permettono il trattamento con piccole molecole e analisi di come differenti regioni del cuore comunicano ^2-6. Per tutta la cultura del cuore del mouse, cuori prelevati da embrioni fino a embrionale (E) 12,5 di età può essere posizionato in terreno di coltura con o senza dondolo ^2,3,5. Usando questa tecnica, cuori embrionali sono state incubate con successo per l'equivalenza di E13.5 e cuori coltura con dondolo sono stati mantenuti fino a tre giorni (partendo E10.5) ^3. Tuttavia, nessuno studio ha riportato la cultura di successo di cuori da embrioni anziani. Allo stesso modo, gli esperimenti di salvataggio è stata limitata ad applicare l'agente terapeutico globalmente al mezzo di coltura ^2.

Un sistema di coltura fetta, in cui i cuori sono asportati, incorporati e sezionato con un vibratome, è stato anche utilizzato per entrambi i cuori più giovani, come E12.5 i cuori del mouse e Hamburger-Hamilton stadio 36 (circa E16 nel topo) pulcino cuori ^2,4,6, e più cuori, come il post-natale e di topo adulto hearts e cuori umani adulti ^7,8. Mentre le analisi embrionali sono tipicamente utilizzate sezioni spesse 150 micron ^2,4, spessore della sezione può essere un grande come 500 micron senza evidenza di privazione di ossigeno ^8. Queste culture fetta sono state mantenute fino a due mesi di cultura, con la maggior parte delle fette mantenendo contrattilità in tutto questo periodo ^9. Rispetto agli studi in cardiomiociti isolati questi culture fetta consentono il co-coltura di cardiomiociti con i loro tipi di cellule adiacenti e forniscono un metodo utile per l'analisi ex vivo. Tuttavia, queste colture richiedono più elaborato set-up che semplicemente posizionando un cuore in mezzo di coltura (per es incorporamento cuore vivo per il sezionamento su un vibratome), e ogni analisi è ovviamente limitata alla porzione del cuore all'interno della sezione.

Date le limitazioni sopra descritte per la coltura di embrioni cuori del mouse e la ricchezza di topi transgenici available per lo studio, abbiamo sviluppato un sistema di coltura del mouse cuore ex vivo simile a un sistema di coltura polmone ex vivo sviluppato da Weaver, et ¹⁰ Il nostro sistema di cultura al. permette cultura a lungo termine e la visualizzazione della circolazione coronarica rimodellamento all'interno interi embrionali cuori del mouse. Inoltre, l'utilizzo di Matrigel permette perline per essere tenute in posizione vicina al cuore, fornendo così un trattamento localizzato con agenti terapeutici. Questi esperimenti possono essere eseguiti a differenti tempi di sviluppo per confrontare l'effetto di un dato trattamento su un processo come la formazione di arteria coronaria. Perché le piccole molecole possono diffondere attraverso Matrigel, questo sistema di coltura può essere utilizzato anche per la cultura regioni sezionati del cuore vicino all'altro per determinare se specifici contatti cellula-cellula sono necessarie per alcuni processi di sviluppo o se segnalazione paracrina da una regione all'altra è necessario.

Questo sistema di colturaè relativamente semplice e, a differenza del sistema di coltura fetta, fa uso di reagenti cultura di base e set-up che sono facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori. In breve, cuori embrionali escisse sono coltivate in Matrigel diluito, che fornisce un semi-solido supporto. Questo supporto è sufficiente a mantenere la morfologia tridimensionale del cuore permettendo anche la contrazione del cuore. Utilizzando questo sistema, cuori interi da anziani embrioni di topo (E14.5-E16.5) possono essere mantenute in coltura per un massimo di quattro giorni. L'intero plesso coronario è mantenuto, a differenza delle culture fetta, quindi eventuali spunti di segnalazione che si verificano da diverse regioni del cuore rimangono presenti. Inoltre, coloranti fluorescenti live-cellulari possono permeare la Matrigel per permettere la visualizzazione del cuore in diretta, e perle di proteine ​​coniugate possono essere collocati in prossimità del cuore di fornire una fonte di segnalazione localizzata. Insieme, questi vantaggi fanno di questa tecnica un metodo ideale per lo studio dei processi di sviluppo in embryonic cuore del mouse.

Protocollo

1. Ablazione del Hearts embrionali

1. Eutanasia di un mouse timed-incinta al giorno embrionale desiderato utilizzando una tecnica di eutanasia approvato. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of North Carolina a Chapel Hill.
2. Liberamente spruzzare la femmina con il 70% di etanolo prima di dissezione. Aprire cavità addominale della femmina per recuperare e accise il corno uterino.
3. Collocare il corno uterino in una capsula di Petri contenente freddo 1x tampone fosfato salino (PBS) e sciacquare come necessario. Tagliare il corno uterino attraverso la linea mediana per esporre i sacchi embrionali allegati.
4. Tagliare un sacco embrionale e recuperare un embrione. Posizionare l'embrione in una seconda capsula di Petri con PBS freddo. Riportare la capsula di Petri con il corno uterino di ghiaccio.
5. Decapitare l'embrione per migliorare l'accesso alla parete toracica. Se genotipizzazione è necessario, rimuovere e salvare la coda in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio.
6. Con l'embrione sul dorso, tagliare aprire la parete toracica per visualizzare il cuore e polmoni. A seconda della fase, la parete toracica può essere trasparente.
7. Sollevare delicatamente il cuore con pinze e tagliare i vasi sotto. Quindi, tagliare sopra i grandi vasi di liberare il cuore. Se necessario, rimuovere i tessuti estranei.
8. Mettere il cuore in un pozzetto di un piatto da 24 pozzetti riempiti con PBS freddo e porre il recipiente sul ghiaccio.
9. Ripetere i passaggi precedenti fino a quando i cuori sono stati rimossi da tutti gli embrioni.

2. Cultura Set-up

1. In una cappa laminare, combinare Matrigel freddo e il terreno di coltura desiderato (ad esempio 10% di siero fetale bovino (FBS) in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)) in rapporto 1:1. Non pre-riscaldare il terreno di coltura.
2. Mantenendo la Matrigel diluita in ghiaccio, pipetta 500-1000 microlitri della soluzione diluita in un pozzetto di una piastra da coltura da 24 pozzetti che è inoltre mantenuto in ghiaccio.
3. Nel cofano, accuratamente raccogliere e posizionare il asportatocuore in un pozzetto della piastra da coltura Matrigel contenente mantenendo il piatto cultura su ghiaccio.
4. Se l'orientamento del cuore incorporato è cruciale: Liberamente spruzzare un microscopio invertito e lo spazio circostante con il 70% di etanolo. Nella cappa, posizionare il cuore staccato in un pozzetto della piastra di coltura Matrigel contenente mentre ancora sul ghiaccio. Quindi, posizionare la lastra su un microscopio e di orientarsi velocemente il cuore asportato come Matrigel inizia a solidificare.
5. Posizionare il piatto di coltura in un umidificata 37 ° C incubatore (5% di CO ₂₎ e lasciare il Matrigel a solidificare per circa 30 min.
6. Aggiungere 1 ml di terreno di coltura pre-riscaldato a ciascun pozzetto contenente un cuore.
7. Cuori possono rimanere in coltura per almeno quattro giorni. Cambiare il terreno di coltura ogni due giorni è raccomandato.

3. Fissazione e visualizzazione

1. Eventualmente aggiungere un colorante fluorescente live-cella (ad es Syto-16) per visualizzare il cuore vivo. Fotografia saràlimitata al lato del cuore che è visibile in base alla posizione in cui è stato incorporato.
2. Se saranno eseguite le analisi post-coltura (ad esempio l'imaging monte tutto o sezionamento), rimuovere il terreno di coltura e sostituirlo con il freddo il 4% di formaldeide. Porre la capsula in ghiaccio per 30 min.
3. Dopo la formaldeide fredda e ghiaccio promuovono dissoluzione del Matrigel, sostituire il fissativo (e Matrigel) con formaldeide fresco e fissare cuori notte a 4 ° C.
4. Lavare i cuori con il tampone (ad esempio PBS o Tris) e conservare a 4 ° C fino a quando ulteriori analisi.

Risultati

Usando questa tecnica, il cuore mantiene la sua morfologia tridimensionale e rimane vitale, come indicato dalle continue contrazioni (Film 1). Queste contrazioni sono sempre più prominente negli atri che nei ventricoli. Seguendo cultura, cuori possono essere fissati e trattati per immunoistochimica sia o istologia per esaminare l'espressione marker specifico o strutture. Figura 1A mostra la base dei ventricoli e grandi arterie di un cuore embrionale di topo che è stato coltivato p...

Discussione

Il sistema attuale cultura pone vantaggi significativi per gli studi embrionali cuore del mouse. Questo sistema di coltura preserva contrattilità miocardica e il plesso coronario, con segnali limitati di necrosi, anche dopo quattro giorni di coltura. Inoltre, la matrice semi-solido fornisce supporto sufficiente a mantenere la morfologia tridimensionale del cuore di sviluppo pur consentendo flessibilità per contratto e anche per tenere perline rivestite in posizione durante cultura. Nonostante questo sostegno, questa m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Growth factor-reduced Matrigel	BD Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
24-well culture plate	Fisher Scientific	07-200-84
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110