تحليل الكمي متعددة الأطياف وبعد زرع الأنسجة نيون لتصور أصول الخليوي، وأنواع، والتفاعلات

Summary

الجماهير الأنسجة المعقدة، من الأجهزة للأورام، وتتكون من العناصر الخلوية المختلفة. نحن توضيح مساهمة الظواهر الخلوية داخل الأنسجة باستخدام المسمى متعدد الفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت في تركيبة مع multiparameter تلوين مناعي تليها unmixing الطيفية فك الأصل المحمولة، فضلا عن خصائص الخلايا استنادا البروتين التعبير.

Abstract

مع الرغبة في فهم إسهامات العناصر الخلوية متعددة لتطوير الأنسجة المعقدة؛ مثل العديد من أنواع الخلايا التي تشارك في تجديد الأنسجة، وتشكيل الورم، أو تكون الأوعية، ونحن وضعت نموذجا زرع الخلوية متعددة الألوان التنمية الورم في والتي تنشأ من السكان الخلية المختلفة الملونة مراسل الفئران الجينات fluorescently ويتم زرع، أو حقن المغروسة في وحول وجود ورم النامية. ثم يتم تجنيد هذه الخلايا الملونة ودمجها في سدى الورم. من أجل إجراء تقييم كمي لنخاع العظام المستمدة خلايا انسجة الورم، ونحن زرع GFP معربا المعدلة وراثيا نخاع العظم كله في طلب تقديم العروض المشع قاتل معربا عن الفئران التي وافقت عليها IACUC. تم رفعه الأورام 0ovarian التي تم حقنها في الفئران orthotopically زرعها آخر 6-8 أسابيع engraftment وتحليلها لنخاع العظم علامة من أصل (GFP)، وكذلك الأجسام المضادة للكشف عن علامات الورم المرتبطةسدى باستخدام تقنيات التصوير متعدد الأطياف. نحن بعد ذلك تكييفها منهجية نسميه MIMicc-المتعددة الأطياف الاستجواب من تعدد التراكيب الخلوية، وذلك باستخدام unmixing متعددة الأطياف من fluoroprobes إجراء تقييم كمي والتي وصفت جاء خلية من السكان والتي تبدأ (على أساس تسميات الجين مراسل الأصلي)، وكما قدرتنا على unmix 4، 5 ، 6 أو أكثر لكل أطياف زيادات الشرائح، واضاف لدينا المناعية الإضافية المرتبطة الأنساب الخلية أو التمايز لزيادة الدقة. استخدام برامج للكشف عن إشارات المضاعفة الفلورسنت المترجمة المشترك، ويمكن إرجاع السكان انسجة الورم، وتتميز المذكورة على أساس علامة تلطيخ. ¹

Introduction

فهم التنمية الأنسجة وإصلاح مهم لتوضيح المكونات الخلوية المشاركة في التئام الجروح، ^2،3 الطب التجديدي، والبيولوجيا التطورية والبيولوجيا الورم. في ظل ظروف من إصلاح، والعديد من أنواع الخلايا التسلل المكروية المحيطة للمساعدة في الأوعية الدموية، ترسب ECM، وانتشار وإعادة هيكلة الأنسجة. ويمكن تحديد العوامل الخلوية والظواهر على أساس multiparameter، علامات المضاعفة التي يمكن أن تحدد توطين، وحالة التمايز والتفاعل بين المكونات الخلوية داخل المكروية التحقيق. هنا، نحن تصف تطور الورم كمثال تنميط لهذا النموذج زرع متعدد الألوان المتعددة الخلايا تليها التصوير متعدد الأطياف ومنهجية unmixing الطيفية.

ورم تطور هو عملية متعددة الخطوات التي تم وضع علامة من قبل العديد من القدرات المكتسبة التي تشمل تعزيز الانتشار، وntiapoptotic، الغازية وعائية الخصائص. مما يسهل ⁴ التنمية الورم عن طريق الخلايا غير الورمية التي يتم تجنيدهم في بيئة المحيطة بها لتوفير عوامل النمو، المصفوفات الهيكلية، وشبكات الأوعية الدموية والتعديل المناعي. يتكون ^1،5،6 هذا موئل دقيق من الخلايا المشتقة من والأنسجة المحلية المجاورة مثل الدهنية، والأوعية الدموية ومصادر بعيدة مثل نخاع العظم الخلايا المشتقة ^1. مدى دمج الخلايا غير الورمية يعتمد على الطلب من الورم، والتي تتطابق في كثير من الأحيان مع المرحلة / الصف من الورم. لفهم دور الورم المكروية داعمة، لا بد من فهم منشأ وإمكانية التفريق بين السكان الخلية غير الورمية.

وقد تم تصميم هذا البروتوكول للمساعدة في تفسير تطور الورم من خلال التصور كل من نخاع العظام المكونات الخلوية المشتقة، والاوعية الأنسجة المحليةإد الخلايا. استخدام الفلورسنت، معربا عن الجين مراسل الفئران المعدلة وراثيا، ونحن زرع نخاع GFP (الخضراء بروتين فلوري) العظام في طلب تقديم العروض المشع القاتلة (بروتين أحمر فلوري) الماوس. بعد نجاح نخاع العظم engraftment، يتم حقن الورم خط الخلية مسانج orthotopically وسمح لتدبر لمدة 4-8 أسابيع. يتم رفعه الورم الناتج عن الماوس ومعالجتها لمناعي (IF) تلطيخ لتصور مكونات اللحمية. مضاعفة IF علامات هي تقنية شائعة الاستخدام التي ينطوي كبيرة الأمثل ^7-9، ومع ذلك باستخدام منصة التصوير / unmixing متعددة الأطياف يحسن القدرة على تركيبات علامة فلوري التي تمتلك التداخل الطيفي. هنا نقدم تقنية نسميه الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد في وصمة عار وتحليل ما يصل إلى ثمانية علامات داخل قسم الورم على شريحة واحدة من أجل تحليل أصول الخلوية، وتمايز الخلايا الحادي وآتوس والتفاعلات خلية خلية من المكونات داخل المكروية الورم. هذا مثال مبسط لديه القدرة على أن توسع عليها في أجل تحليل خمسة، ستة، أو أكثر علامات استخدام الأجسام المضادة أو الخلايا يحركها المروج التعبير الفلورسنت. الجدول 1 قوائم الفلورسنت تركيبات تلوين الأجسام المضادة المحتملة مع الأنواع المناسبة تؤخذ بعين الاعتبار.

Protocol

مسانج الفئران زرع النخاع (BMT) كما أقرتها المؤسسية بروتوكولات IACUC (ملاحظة: النجاح من هذا البروتوكول يتطلب استخدام أي نوع من الخلايا المسمى (ق) كهدف للتحليل المتعدد الأطياف، وتسهيل تحليل المصب، يمكن للمرء أن يستغل أي الوراثية أو وضع العلامات الخلوية مستقرة. ونقترح أن أي خلية، الأنسجة، أو يمكن تطبيق الجهاز ليكون نموذجا لزرع ويمكن أن تحتوي على زرع العديد من السكان وصفت بأنها فريدة من نوعها يراها البحوث المفيدة. بالإضافة إلى ذلك، متعددة المسمى الأنظمة الخلوية ، مثل تلك التي وجدت في الفئران المعدلة وراثيا تحتوي على نسب متعددة مقيد fluorescently المسمى يمكن أن تكون مصممة السكان للقضاء على مضاعفات زرع لدراسة بعض الحالات المرضية.

1. قاتل أشرق الفئران المتلقية BMT مع جرعة واحدة من 9.5 غراي أربع ساعات قبل إعادة نخاع العظام مع الجهات المانحة. (يجب أن يكون متلقي BMT GFP 6-10 أسابيع من العمر).
2. تبلل قذف الفأر مع الايثانول 70٪ قبل لقطة وتقشير مرة أخرى لفضح الأطراف الخلفية مع مقص جراحي معقم. إزالة الساق بأكملها بما في ذلك قمة الحرقفي في المفصل العجزي الحرقفي. تجاهل القدم عن طريق قطع فقط فوق الكاحل ومن ثم إزالة شاملة في جميع العضلات والأربطة والأنسجة الزائدة من العظام. نخاع دافق من الساق، fibia وعرف الحرقفة مع إبرة 23 G باستخدام العقيمة FBS 2٪ في برنامج تلفزيوني (PBS-2). (يجب التضحية المانحين RFP BMT وفقا للمعايير المؤسسية.)
3. شريحة وبلطف سحق العظام المتبقية إلى أجزاء باستخدام مشرط وملقط ثم وضع في أنبوب 50 مل المخروطية مع 3 ميكروغرام / مل كولاجيناز أنا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في 300 دورة في الدقيقة.
4. أعلى قبالة الأنبوب مع برنامج تلفزيوني-2 وجمع طاف في أنبوب جديد وتتحد مع خلايا مسح. تدور باستمرار في 250rpm لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
5. الخلايا resuspend في برنامج تلفزيوني-2 وتصفية من خلال 40 نانومتر تصفية الخلية. عند هذه النقطة، فإن الخلايا يمكن أن توصف لfluorescenر تنشيط الخلايا الفرز (FACS) إذا كان أحد يريد التعامل مع فئات معينة من السكان لBMT.
6. في resuspend 2 × 10 ⁶ خلايا في 100 ميكرولتر PBS، في الماوس. استخدام 29 G إبرة لحقن النظامية في الفئران GFP المتلقي المشع من قبل الذيل أو الرجعية المدارية الوريد-شطبة جانب المتابعة. حقن فأرة واحدة مع 100 ميكرولتر PBS فقط عن التحكم engraftment. استخدام مصباح الحرارة إلى تمدد الأوعية قبل الحقن واستخدام حقن الوريد الذيل ضبط النفس عند الحقن. لديك شاش معقم المتاحة لتطبيق الضغط الخفيف إلى حقن آخر الذيل.
7. ثلاثة أسابيع بعد BMT، وجمع الدم الرجعية orbitally وتحليل التدفق الخلوي لتأكيد وجود خلايا GFP تعميم وعدم وجود خلايا RFP المنتشرة. سيكون قد مات الماوس التحكم عند هذه النقطة.

2. الورم Engraftment وفقا لمبادئ توجيهية IACUC المؤسسية

1. تنمو الخلايا السرطانية ID8 الفئران المبيض في المختبر قبل حقن في الجسم الحي (1 × 10 ⁶ جأذرع في الماوس). يوم من الحقن، ويعرض للتريبسين الخلايا، ويغسل مع برنامج تلفزيوني و resuspend في برنامج تلفزيوني في 1 × 10 ⁶ خلايا في 100 ميكرولتر.
2. حقن الخلايا السرطانية في تجويف intaperitoneal من الفأرة، وينبغي أن تكون إبرة الجانب شطبة المتابعة. تعقيم الحقن الأفق مع الايثانول 70٪. تحقن أسفل اليسار أو الربع السفلي الأيمن من البطن (الجمجمة وسطي قليلا إلى مجموعة أقل شأنا من الحلمات البطن من الماوس الإناث)، وتجنب ضرب الأجهزة. كبح الماوس عن طريق الاستيلاء من القفا وعقد الذيل مع الخنصر أو البنصر. يمكن تخدير الفئران مع isoflurane وعن هذا الإجراء.
3. التضحية الفئران عندما علامات الورم engraftment، مثل الانتفاخ في البطن طفيف، واضحة. وهذا يحدث أكثر من 4-12 أسابيع.
4. الأورام المكوس من تجويف IP. سوف الأورام داخل تجويف تبدو وكأنها عقيدات بيضاء على السطح وحول الأجهزة. مع مشرط، وإزالة الأورام ووضع في أنبوب / جرة من 10٪ من الفورمالين لمدة 24 ساعة التثبيت. ع النسيجيةالتعويض يمكن أن يكون مصدرها التدريجي لعلم الأمراض / علم الأنسجة الأساسية إذا الكواشف والمواد ليست متاحة بسهولة لتضمين البارافين وإعداد الشرائح. قسم الأنسجة إلى 5-8 ميكرون شرائح على الشرائح الزجاجية لتلطيخ الاجراءات اللاحقة.

3. متعدد المعلمة مناعي تلطيخ

1. إعداد الشرائح تحكم لون واحد لكل التحقيق الفلورسنت المستخدمة في التجربة. في هذا السيناريو، يتم استخدام أربعة ألوان. وبالتالي، أربعة شرائح لكل لون الفردية وكذلك شريحة واحدة للسيطرة على الضوضاء في الخلفية، وأخيرا شريحة واحدة لمزيج تلطيخ الكامل. (عدد الشرائح = 6) وسيتم تجهيز جميع الشرائح جنبا إلى جنب بطريقة مماثلة للحد من التباين التجريبية.
2. خبز أقسام البارافين عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
3. تغسل شرائح 3x أخرى 10 دقيقة في الزيلين.
4. غسل 2X 5 دقائق الإيثانول بنسبة 100٪.
5. يغسل 1X 3 دقيقة 95٪ من الإيثانول
6. يغسل 1X 2 min90٪ من الإيثانول.
7. يغسل 1X 2 min70٪ من الإيثانول.
غسل 1X 2 دقيقة في الماء. تزج ببطء رف تلطيخ ويخرجون من 10X المياه.
8. خلال سلسلة غسل الماضي، قبل الغليان العازلة سيترات الصوديوم لمدة 2 دقيقة (الميكروويف على ارتفاع). (يمكن استبدال مع العازلة تريس، EDTA اعتمادا على الأجسام المضادة في الاستخدام)
9. تغلي الشرائح لمدة 20 دقيقة في سترات الصوديوم العازلة (الميكروويف على السلطة 10٪ أو في طنجرة الضغط). إذا الدمامل العازلة، إيقاف الميكروويف وترك الجلوس.
10. إزالة من مصدر الحرارة، والسماح للبقية الشرائح لمدة 30 دقيقة في المخزن المؤقت سترات الصوديوم حتى يبرد.
11. شطف الشرائح في الماء لمدة 5 دقائق.
12. علامة حول أقسام الورم مع الرحم القلم ووضع 2٪ BSA / 1٪ FBS حمض الماليك عرقلة العازلة لمدة 1 ساعة. إعداد الشرائح بشكل فردي حتى لا نسمح لهم تجف خلال هذه الخطوة.
13. إعداد الأجسام المضادة الأولية في التخفيف الأمثل في عرقلة العازلة. (إذا كانت الأجسام المضادة في استخدام كل من الأنواع المختلفة (أو مفتش سلسلة الاختلاف السابقين: IgG1 IgG2a مقابل من نفس النوع) أنها يمكن أن تستخدم في تركيبة أثناء كمافترة الحضانة إنجل. إذا أنواع الأجسام المضادة تتداخل، ثم يجب أن يتم حضانات بها بالتتابع للحد من الأجسام المضادة عبر التفاعل.)
14. عند هذه النقطة، وترك شريحتين مع عازلة تمنع فقط. وهذه الشرائح اثنين بمثابة السيطرة غير ملوثين والسيطرة وصمة عار النووية. سيتم المحتضنة الضوابط لون واحد مع غيرها من الأجسام المضادة الأولية الفردية. وليس هذا فقط الشريحة تحليل لديها مزيج من الأجسام المضادة الأولية.
15. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية في مربع غرفة الرطوبة على شاكر الدورية بطيئة في 4 درجة بين عشية وضحاها (~ 16-20 ساعة) (ملاحظة: عند العمل مع 4 + fluorophores، وتلطيخ متتابعة أو الاقتران المباشر قد يكون ضروريا للحد من الأجسام المضادة عبر التفاعل . وفي ظل هذه الظروف كرر الخطوات 1،16-1،21 حتى يتم تطبيق كافة الأجسام المضادة على الشرائح.)
16. تغسل الشرائح لمدة 10 دقيقة في PBST (2X) بلطف على شاكر
17. في حين يجري غسل، وإعداد Alexafluor 488، 594 647 والأجسام المضادة الثانوية لتخفيف النهائيمن 1:1،000 في عرقلة العازلة. (تأكد من يتم الاحتفاظ هذه الأجسام المضادة والتخفيفات في 4 درجات مئوية في الظلام وفي جميع الأوقات للحفاظ على مضان عبر دفعات، وعلى مر الزمن.)
18. على الشرائح سيطرة لون واحد، ومكان واحد التخفيفات Alexafluor مطابقة الأنواع من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. سيتم وضع جميع الأجسام المضادة الثانوية على الشريحة التحليل. ستبقى الشرائح السيطرة غير ملوثين والنووية ملطخة عرقلة العازلة طوال هذه الخطوة.
19. احتضان في مربع غرفة الرطوبة (مغطاة بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء) على بطء شاكر الدورية على RT لمدة 2 ساعة.
20. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في PBST (2X) بلطف على شاكر. تغطية بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
21. إضافة دابي (1:10،000) لمدة 1 دقيقة إلى الشريحة-دابي فقط والشريحة التحليل. تغطية بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. قد يكون غادر الشرائح الأخرى المشمولة في حاويات غسيل.
22. غسل اثنين دابي المحتضنة-الشرائح في وعاء منفصل لأول 5 دقائق يغسل حتى لا تلوث الشرائح الأخرى مع دابي وصمة عار. للمرة الثانية 5 دقائق يغسل، ويمكن الجمع بين الشرائح في PBST (ينبغي إجراء جميع يغسل على شاكر). تغطية بورق الألمنيوم للحماية من الضوء.
23. الشرائح لفترة وجيزة وتراجع في الماء قبل (1.5 سمك مع وسائل الاعلام تصاعد المائية للحفاظ على مضان) للانزلاق الغطاء
24. اسمحوا الجافة ساعة 3 في الظلام في RT.
25. ختم حواف الغطاء زلة مع مقوي للاظافر. (لا تستخدم طلاء الأظافر مثل الأسيتون يشفي إشارة الفلورسنت).
26. تحليل الشرائح مباشرة أو تخزينها في 4 درجات مئوية لتحليل المستقبل.

4. التصوير المتعدد الأطياف

1. جمع صور متعددة الأطياف باستخدام كاميرا فارق بسيط EX (التي تحتوي على الكريستال السائل تصفية الانضباطي) على أوليمبوس X-63 المجهر تستقيم مع فارق بسيط برنامج لجمع البيانات.
2. جمع الصور باستخدام هدفا النفط لزيادة دقة.
3. أن مبادرةوتشمل مجموعة المتابعة ل تعيين النطاق الطيفي لكل fluorophore في الاستخدام.
   1. لمدة 4 اللون:
      1. دابي: 420-480nm
      2. AF488: 490-580m الطوق
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. تأخذ صورة من الشريحة الأولي تحليل للحصول على أضعاف التعرض المناسب لكل من نطاقات طيفية.
5. إنشاء "مكتبة الطيفية" أن البرنامج سوف تستخدم لتحديد وفصل نسبة الإشارة إلى الضوضاء من fluorophores من بعضها البعض، وإشارة الخلفية. (ملاحظة: يجب أن يكون لكل واحد تألقي الخاصة الشريحة تحكم لونه من أجل تجميع مكتبة الطيفية مع منحنيات الطول الموجي المناسب لضمان تحليل سليم من مجموعة البيانات على سبيل المثال: 3 fluorophores = 4 شرائح السيطرة؛ fluorophores 5 = 6 شرائح مراقبة).
   1. صورة الشريحة الأولى غير ملوثين. وسيتم تعيين هذه الشريحة داخل المكتبه الطيفيةذ كخلفية.>
   2. صورة الشريحة دابي فقط الثاني. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين نوى دابي الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما دابي>.
   3. صورة AF488 فقط الشريحة الثالثة. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين المناطق AF488 الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما AF488>.
   4. صورة الشريحة AF594 فقط الرابع. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين المناطق AF594 الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما AF594>.
   5. صورة الشريحة AF647 فقط الخامسة. وسوف تستخدم هذه الشريحة لتعيين المناطق AF647 الملون مع "رسم" أداة وسيتم حفظ داخل المكتبة الطيفية كما AF647>.
   6. بعد جمع كل مكون الطيفي الفردية،حفظ المكتبة الطيفية والبروتوكول.>
6. مرة واحدة في المكتبة الطيفية كاملة، تجد مناطق الفائدة على الشريحة على المجهر تحليل وجمع / حفظ الصور>

5. التحليل الكمي للصور المتعددة الأطياف

1. استيراد تشكيلة ممثل الصور نيوانس الحصول عليها باستخدام برمجيات إعلام.
2. فتح مكتبة الطيفية حفظها وفقا لتوجيهات من قبل البرنامج
3. تحديد مناطق الأنسجة من الاهتمام ليتم تحليلها. (مثل ورم الأنسجة مقابل الأنسجة الدهنية).
4. تحديد الخلايا الفردية على أساس دابي وصمة عار. وسيتم تحديد السيتوبلازم تلقائيا استنادا إلى شكل النواة.
5. اختيار كثافة الفلورية للقراءة من خيار لكل معلمة الفلورسنت (على سبيل المثال يعني، الانحراف المعياري)
6. دفعة من الحصول على الصور، والسماح للعملية البرمجيات باستخدام خوارزمية المقترحة.
7. عند الانتهاء من معالجة الصور، دمجالملفات نتيجة.
8. فتح النتائج في Excel (أو أي مجموعة من البرامج التحليلية الأخرى) ورسم اثنين من شدة الفلورسنت ضد بعضها البعض على محور XY. يتم إعطاء كل شدة الفلورسنت لكل خلية. سوف تظهر الخلايا إيجابية مزدوجة في الربع العلوي الأيمن. يجب تعريف المستخدم شدة الفلورسنت خط الأساس.

النتائج

باستخدام تقنية التصوير متعدد الأطياف لتحليل الأورام المغروسة في نموذج الفأر وراثيا لدينا BMT، ونحن قادرون على تمييز مكونات الورم اللحمية التي هي من نخاع العظام المنشأ. تم تأكيد BMT الأولية ثلاثة أسابيع بعد الزرع بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 1). حقن Orthotopically أورا?...

Discussion

هنا وصفنا تطبيق التصوير متعدد الأطياف وصفنا كما الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد، لتحليل نخاع العظام المستمدة من مكونات انسجة المكروية الورم، ولكن هذه المنهجية ومفهوم يمكن تطبيقها على فك رموز العناصر الخلوية الأخرى التي يتكون مجمع الأنسجة مثل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml