Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Özet

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Özet

Karmaşık doku gelişimine çoklu hücresel elemanların katkıları anlamak için arzusu ile, bu tür doku, tümör oluşumu veya vaskülojenez yenileyici katılmak çok sayıda hücre türleri olarak biz tümör gelişme çok renkli bir hücre transplant modeli geliştirmiştir hücre popülasyonlarının farklı renkli flüoresan raportör gen farelerden kaynaklanan ve transplant engrafted veya gelişmekte olan bir tümör içinde ve çevresinde enjekte edilmektedir. Bu renkli hücreler daha sonra alınmış ve tümör stromasında dahil edilmiştir. Nicel olarak, kemik iliği kaynaklı tümör stromal hücreleri değerlendirmek amacıyla, IACUC onaylı olarak farenin ifade ölümcül ışınlanmış RFP transgenik bütün kemik iliği nakli GFP sentezleyen. Orthotopically nakledilen farelere enjekte edilmiştir 0ovarian tümörler 6-8 hafta sonra bütünleşmesini kesilmiş ve ilgili tespit etmek için tümör kaynaklı kemik iliği işaretleyici (GFP) yanı sıra, antikor belirteçler için analiz edildibantlı görüntüleme teknikleri kullanılarak stroma. Biz o zaman nicel hücre hangi (orijinal raportör gen etiketlere dayalı) başlayan nüfus, ve 4, 5 unmix bizim yeteneği gibi geldi etiketlenmiş hangi değerlendirmek için fluoroprobes multispektral Karışmama kullanarak, biz Çoklanmış hücresel kompozisyonlar MIMicc-Çokspektrumlu Sorgulama dediğimiz bir metodoloji adapte , slayt artar başına 6 ya da daha fazla spektrumları, biz hücre soyları ya da hassasiyeti arttırmak için farklılaşma ile ilişkili ek immunhistokimya ekledik. Ko-lokalize multipleksli-floresan sinyalleri, tümör stromal nüfus, takip numaralandırılmış ve işaretleyici boyama dayalı karakterize edilebilir algılamak için yazılım kullanmak. ¹

Giriş

Doku gelişimini ve onarımını anlama yara iyileşmesi, ^2,3 rejeneratif tıp, gelişim biyolojisi ve tümör biyolojisi katılan hücresel bileşenlerini anlamak önemlidir. Tamir şartlar altında, çok sayıda hücre türleri vaskülarizasyon, ECM birikimi, proliferasyon ve doku yeniden yardımcı olmak için çevreleyen mikro sızmak. Hücresel faktörler ve fenotipleri multiparametre, yerelleştirme belirleyebilir multiplexed belirteçler, farklılaşma durumu ve incelenen mikro içindeki hücresel bileşenleri arasındaki etkileşime dayalı tespit edilebilir. Bu yazıda, çok bantlı görüntüleme ve spektral Karışmama metodoloji ardından bu renkli-hücreli nakli model için bir prototip örnek olarak tümör gelişimini betimler.

Tümör ilerlemesi gelişmiş çoğalması, a dahil birçok edinilen yetenekleri ile işaretlenir çok aşamalı bir süreçtir, ntiapoptotic, istilacı ve anjiyojenik özellikleri. ⁴ tümör gelişimi büyüme faktörleri, yapısal matrisler, vaskular ağlar ve bağışıklık modülasyon sağlamak için çevreye alınırlar neoplastik olmayan hücreler tarafından kolaylaştırılır. ^1,5,6 Bu microhabitat türetilen hücrelerden oluşur yerel, komşu gibi adipoz gibi dokular ve kan damarları ve kemik iliği kökenli hücreler ¹ olarak uzak kaynakları. Neoplastik olmayan hücre katılımı bir şekilde, genellikle, tümörün sahne / türü ile karşılık gelen tümör, gelen talebe bağlıdır. Tümör destekleyici mikroçevresinin rolünü kavramak için, bir non-neoplastik hücre popülasyonlarının kökeni ve farklılaşma potansiyelini anlamak gerekir.

Bu protokol, lokal doku Türe de kemik iliğinden elde edilen hücre bileşenlerinin görselleştirme yoluyla tümör progresyonu yorumuna yardımcı olmak için tasarlanmıştır ve edilmiştirhücreler ed. Flüoresan raportör geni ifade eden transgenik fareler kullanarak, bir ölümcül ışınlanmış RFP (kırmızı flüoresan protein) fare içine, GFP (yeşil floresan protein), kemik iliği nakli. Başarılı kemik iliği engraftment ardından, sinjenik tümör hücre çizgisi orthotopically enjekte edilmiş ve 4-8 hafta boyunca sokmak bırakılır. Elde edilen tümör fareden çıkarıldı ve stromal bileşenleri görselleştirmek için boyama immunofloresans (IF) için işlenir. Çoklayıcı belirteçler ancak spektral örtüşme sahip floresan işaretleyici kombinasyonları için potansiyelini artırır bir çok bantlı görüntüleme / Karışmama platformunu kullanarak, anlamlı optimizasyon ^7-9 içeren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir IF. Bu yazıda biz hücresel kökeni, hücresel farklılaşma st analiz etmek için leke ve tek bir slayt üzerinde bir tümör bölüm içinde sekiz belirteçleri kadar analiz Çoklanmış hücresel kompozisyonlar MIMicc-çokbantlı sorgulama dediğimiz bir teknik mevcutATUS ve tümörün mikro-ortamı içinde parçalar, hücre-hücre etkileşimleri. Bu, basit bir örnek, antikorların kullanıldığı beş, altı veya daha fazla hücre içi işaretleri ya da promotör-tahrikli floresan ifadesi. Tablo 1, dikkate alınan uygun türleri, potansiyel bir floresan antikor boyama kombinasyonu analiz etmek amacıyla, üzerine genişletilmiş potansiyeline sahiptir.

Protokol

Singeneik Fare Kemik İliği Transplantasyon (KİT) kurumsal IACUC protokolleri tarafından onaylanan (Not: Bu protokolün Başarı bantlı analizi için hedef olarak etiketli bir hücre tipi (ler) kullanımını gerektirir ve aşağı analizini kolaylaştırmak için, bir herhangi bir genetik yararlanabiliriz veya sabit hücresel etiketleme. Biz herhangi bir hücre, doku veya organ-to-be, bir transplant model ve araştırma yararlı gördüğü nakli gibi birçok etiketlenmiş popülasyonları içerebilir uygulanabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, hücresel sistemler multi-etiketli , bu tür birden fazla soy ihtiva eden transgenik farelerde bulunanlar gibi kısıtlı floresan popülasyonları-olabilir bazı patolojik durumların çalışma için transplant komplikasyonları ortadan kaldırmak için tasarlanabilir etiketli.

1. Öldürücü seviyede verici kemik iliği ile yeniden önce 9.5 Gy dört saatlik tek bir doz ile BMT alıcı fareler ışın. (BMT GFP alıcılar yaşı 6-10 hafta olmalıdır.)
2. Kırpma ve steril cerrahi makas ile arka bacaklarda ortaya çıkarmak için geri soyma önce% 70 etanol ile fare postu ıslatın. Sakroiliak eklem iliak dahil tüm bacak kaldırın. Sadece ayak bileği üzerinde ve sonra iyice kemikten tüm kas, bağ ve aşırı dokuyu keserek ayağını atın. PBS (PBS-2)% 2 steril FBS kullanarak bir 23 G iğne ile tibia, fibia ve iliak floş iliği. (BMT RFP vericiler kurumsal standartlara göre feda edilmesi gerekmektedir.)
3. Yavaşça Dilim ve bir neşter ve forsepsler kullanılarak fragmanlara kalan kemik ezmek ve daha sonra 300 rpm'de 37 ° C'de bir 1 saat boyunca 3 ug / ml kollajenaz ile 50 ml konik tüp yerleştirin.
4. PBS-2 ile tüp kapalı üst ve yeni bir tüp içine supernatant toplamak ve boşaltılan hücre ile birleştirir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 rpm'de aşağı Spin
5. PBS-2 hücreleri tekrar süspansiyon ve 40 nm hücre filtresi aracılığıyla filtre. Bu noktada, hücreler flüoresan için etiketlenebilirt bir BMT için özel popülasyonları işlemek istiyorsa (FACS) hücre aktive.
6. Fare başına 100 ul PBS başına 2 x 10 ⁶ hücre, tekrar. Sistemik kuyruk veya retro-orbital ven-konik-side-up ile ışınlanmış GFP alıcı farelere enjekte 29 G iğne kullanın. Sadece engraftmınt kontrol olarak 100 ul PBS ile bir fare enjekte edilir. Enjeksiyondan önce damarları açmak ve enjeksiyon üzerine bir kuyruk damarı enjeksiyonu kısıtlama kullanmak için bir ısı lambası kullanın. Kuyruk sonrası enjeksiyon hafif bir basınç uygulamak için kullanılabilir, steril gazlı bez var.
7. Üç hafta sonra, kemik iliği nakli sonrası kan retro orbital toplar ve GFP dolaşan hücrelerin varlığı ve RFP dolaşan hücrelerin olmadığını teyit etmek için akış sitometrisi ile analiz. Kontrolü fare bu noktada ölmüş olacak.

2. Tümör Aşı Kurumsal IACUC Kılavuzu'na göre

1. ID8 önce in vivo enjeksiyonu ile (1 x 10 ⁶ ° C ile, in vitro olarak yumurtalık kemirgen tümör hücrelerin büyümesinefare başına arşın). Enjeksiyon Day, trypsinize hücre, 100 ul başına 1 x 10 ⁶ hücre PBS içinde PBS ile yıkayın ve tekrar süspansiyon.
2. Fare intaperitoneal boşluğuna tümör hücrelerini enjekte iğne konik tarafı-up olmalıdır. % 70 etanol ile enjeksiyon görüş sterilize edin. Sol alt veya karnın sağ alt kadranda içine enjekte edilir (kranial ve biraz dişi fare abdominal meme alt kümesine medial), organları çarpmamak. Berduş tarafından kapma ve serçe ve yüzük parmağı ile kuyruk tutarak fare kısıtlamaktadır. Fareler Bu prosedür için izofluran ile anestezi edilebilir.
3. Bu tür hafif abdominal şişkinlik gibi tümör engraftment belirtileri, belirgin olduğunda fareler kurban. Bu 4-12 hafta boyunca haftada meydana gelecektir.
4. IP boşluğundan Tüketim tümörler. Boşluğu içinde Tümörleri organların yüzeyinde ve çevresinde beyaz nodüller gibi görünecektir. Bir neşter ile, tümörler çıkarın ve 24 saat tespiti için% 10 formalin içinde bir boru / kavanoza yerleştirin. Histolojik ponarım patoloji / histoloji çekirdek dışarı kaynaklı olabilir reaktifler ve malzemeler parafine ve slayt hazırlama için hazır değilse. Sonraki boyama işlemleri için cam slaytlar 5-8 mikron dilimlere Bölüm doku.

3. Multi-parametre Immunofluorescent Boyama

1. Deneyde kullanılan her floresan prob için tek renk kontrolü slaytlar hazırlayın. Bu senaryoda, dört renk kullanılır. Bu nedenle, her renk için dört slaytlar yanı sıra arka plan gürültü kontrolü ve tam kombinasyon boyama için nihayet bir slayt için bir slayt. (Toplam slaytlar = 6) tüm slaytlar deney varyasyonu en aza indirmek için benzer bir şekilde yan yana işlenir.
2. 1 saat boyunca 56 ° C'de pişirin parafin kesitleri.
3. Yıkama slaytlar ksilen içinde 10 dk 3x.
4. 2x 5 min% 100 etanol ile yıkayın.
5. 1x 3 min% 95 etanol ile yıkayın
6. 1x 2 min90% etanol yıkayın.
7. 1x 2 min70% etanol yıkayın.
yıkayın 1x 2 dk. Yavaş yavaş su 10x içinde ve dışında boyama raf batırmayın.
8. Son yıkama serisi sırasında, 2 dakika (yüksek mikrodalga) için önceden kaynatın sodyum sitrat tamponu. (Kullanılan antikorlar bağlı olarak, tris-EDTA tampon maddesi ile yerini alabilir)
9. Sodyum sitrat tampon maddesi (% 10 gücü veya bir düdüklü tencere içinde mikrodalga) içinde 20 dakika için slaytlar kaynatın. Tampon kaynar ise, mikrodalga kapatın ve bekletin.
10. Isı kaynağından alın ve slaytlar soğutmak için sodyum sitrat tampon maddesi içinde 30 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
11. 5 dakika boyunca su içinde slaytlar durulayın.
12. Pap kalem ile tümör bölümler etrafında Mark ve 1 saat süre ile blokaj tamponu% 2 BSA /% 1 FBS, maleik asit koydu. Onları bu adım sırasında kurumasına izin vermeyin için bireysel olarak slaytlar hazırlayın.
13. Bloke edici tampon içinde uygun seyreltide birincil antikor hazırlayın. (Kullanılan antikorlar, farklı türlerin tüm (veya IgG zincir varyasyon-ex olursa: Aynı türün IgG2a vs IgG1) onlar sırasında kombinasyon halinde kullanılabilirleringle kuluçka dönemi. Antikor türleri çakışırsa, o inkübasyonlar antikor çapraz reaksiyon en aza indirmek için ardışık olarak gerçekleştirilmelidir.)
14. Bu noktada, sadece bloke edici tampon ile iki slayt bırakın. Bu iki slaytlar lekesiz kontrolü ve nükleer leke kontrolü olarak hizmet edecektir. Diğer bir renk kontrolü ayrı primer antikorlar ile inkübe edilir. Sadece analiz slayt birincil antikorlar bir arada olacak.
15. Yavaş dönen bir karıştırıcı üzerinde bir nem odacık kutusu içindeki birincil antikor ile kuluçkaya bırakın 4 ° gece boyunca (~ 16-20 saat) (Not: 4 + fluoroforlar, ardışık lekeleme ya da doğrudan konjügasyon ile çalışırken antikor çapraz reaksiyonu minimize etmek için gerekli olabilir . tüm antikorlar slaytlara uygulanır kadar bu şartlar adımları 1,16-1,21 tekrarlayın altında.)
16. Hafifçe karıştırma cihazı üzerinde, PBST içinde 10 dakika boyunca (2x) için slaytlar yıkayın
17. Yıkama devam ederken, son bir seyreltme için AlexaFluor 488, 594 ve 647 ikincil antikorlar hazırlamakbloklama tamponu içinde 1:1,000. (Bu antikorlar sulandırmalar gruplar üzerinde ve zaman boyunca flöresandaki korumak için, her zaman, 4 ° C'de ve karanlıkta tutulur emin olun.)
18. Tek bir renk kontrol slaytlar üzerinde, kullanılan birincil antikor türleri eşleşen bir AlexaFluor dilüsyonları yerleştirin. Tüm ikincil antikorlar analiz slayt üzerine yerleştirilecektir. Lekesiz ve nükleer lekeli kontrol slaytlar bu adımı boyunca tampon engelleme ile kalacaktır.
19. 2 saat boyunca oda sıcaklığında yavaş dönen bir karıştırıcı üzerinde (ışık maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile kaplı) bir nem odacık kutusu içinde inkübe edin.
20. Hafifçe karıştırma cihazı üzerinde, PBST içinde 5 dakika (2x) için slaytlar yıkayın. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
21. 1 DAPI sadece slayta dakika ve analiz slayt için DAPI (1:10000) ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün. Diğer slaytlar yıkama kapalı kaplarda bırakılabilir.
22. İki DAPI-kuluçkaya yıkayınDAPI leke ile diğer slaytlar kontamine olarak ilk 5 dakika yıkama için ayrı bir kap içinde kayar. İkinci yıkama 5 dakika için, slaytlar (her yıkama ile bir çalkalama düzenine yapılmalıdır) PBST içinde birleştirilebilir. Işıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
23. Suda kısaca dip slaytlar önce kapak kayma (floresan korumak için sulu montaj medya ile 1.5 kalınlığı)
24. Oda sıcaklığında, karanlıkta 3 saat kuru olsun.
25. Tırnak sertleştirici ile kapak kayma kenarları mühür. (Aseton floresan sinyal gidermek olabilir oje kullanmayın).
26. Hemen slaytlar analiz veya gelecekteki analiz için 4 ° C'de saklayın.

4. Çokspektrumlu Görüntüleme

1. Veri toplama için Nuance yazılımı ile Olympus X-63 dik mikroskop üzerinde (bir sıvı kristal ayarlanabilir filtresi içeren) bir Nuance EX kamera kullanılarak çok bantlı görüntüleri toplayın.
2. Çözünürlüğünü artırmak için bir yağ objektif kullanarak görüntüleri toplayın.
3. Inisiyatifil set-up kullanımı her floroforla için spektral aralığı ayarlarını içerir.
   1. 4 rengi için:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Spektral aralıklarının her biri için uygun bir maruz bırakma sürelerinin elde edilmesi için analiz sürgünün bir ilk görüntü al.
5. Yazılım birbirinden Flüoroforlann sinyal-gürültü oranı ve arka plan sinyalini tanımlamak ve ayırmak için kullanacağı "spektral kütüphane" oluşturun. (Not: 3 flüoroforlar = 4 kontrol slaytlar; 5 flüoroforlar = 6 kontrol slaytlar: Her florokromla veri setinin doğru analiz Örnek sağlamak için uygun dalga boyu eğrileri ile bir spektral kütüphane monte etmek için kendi tek renk kontrolü slayt olmalıdır.).
   1. İlk görüntü, boyanmamış slayt. Bu slayt spektral kütüphaneleri içinde tayin edilecektirarka plan olarak y.>
   2. Görüntü DAPI sadece ikinci kaydırın. Bu slayt "çizmek" aracı ile DAPI-lekeli çekirdekleri belirtmek için kullanılır ve DAPI gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.>
   3. Görüntü AF488-sadece üçte kaydırın. Bu slayt "çizmek" aracı ile AF488-lekeli bölgeleri belirlemek için kullanılacak ve AF488 gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.>
   4. Görüntü AF594-sadece dördüncü kaydırın. Bu slayt "çizmek" aracı ile AF594-lekeli bölgeleri belirlemek için kullanılacak ve AF594 gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.>
   5. Görüntü AF647-sadece beşinci kaydırın. Bu slayt "çizmek" aracı ile AF647-lekeli bölgeleri belirlemek için kullanılacak ve AF647 gibi spektral kütüphane içinde kaydedilir.>
   6. Her bir spektral bileşenin toplanmasını takiben,spektral kütüphane ve protokolü kaydedin.>
6. Spektral kütüphane tamamlandığında, görüntüleri kaydetmek / mikroskop analiz slaytta ilgi alanları bulmak ve toplamak.>

5. Çokspektrumlu Görüntüler Kantitatif Analiz

1. Software bilgilendirmek kullanılarak elde Nuance görüntülerin temsili ürün yelpazesine ithalat.
2. Program tarafından belirtildiği kaydedilen spektral kitaplığını açmak
3. Analiz edilecek ilgi doku bölgeleri tanımlamak. (Adipoz doku versus örneğin tümör dokusu).
4. DAPI-leke dayanan bireysel hücreleri belirlemek. Sitoplazma çekirdeğin şekline göre otomatik olarak belirlenecektir.
5. Her floresan parametresi için tercih floresan yoğunluğu Okuması seçin (örneğin ortalama, standart sapma)
6. Toplu görüntüleri elde ve önerilen algoritmasını kullanarak yazılım süreci sağlar.
7. Görüntü işleme tamamlandığında, birleştirmesonuç dosyaları.
8. Excel (veya başka bir analitik yazılım paketi) sonuçları açın ve XY eksen üzerinde birbirine karşı iki floresan şiddetleri arsa. Her bir flüoresan yoğunluğu hücre başına verilir. Çift pozitif hücreler sağ üst kadranda görünecektir. Kullanıcı başlangıç ​​floresan şiddetlerini tanımlamanız gerekir.

Sonuçlar

Bizim transgenik fare modelinde BMT engrafted tümörleri analiz etmek için bir çok bantlı görüntüleme tekniği kullanarak, kemik iliği kökenli stromal tümör bileşenleri ayırt edebiliyoruz. İlk BMT akış sitometri ile üç hafta post-transplant (Şekil 1) doğrulandı. Ortotopikal BMT melezleme teyit İlk tümör enjeksiyonunu takip eden kesilmiş ve formalin 6 hafta sabitlendi aşağıdaki etiketlenmemiş yumurtalık tümörleri enjekte edilir. Parafin tümör bölümleri <8 mikron dil...

Tartışmalar

Burada biz tümör mikro-ortamınm kemik iliğinden elde edilen stromal bileşenleri analiz için, Çoklanmış hücresel bileşimlerin MIMicc-bantlı sorgulama olarak tanımlamak multispektral görüntüleme uygulanmasını açıklar, ancak bu yöntem ve kavram bir kompleks oluşturmak için diğer hücre öğeleri deşifre uygulanabilir Bu tür yara iyileşme reaksiyonlar sırasında veya rejeneratif doku gözlenenlere gibi dokuların. Bu deneylerde, floresan bir engrafted tümör mikro içinde konakçı hücrelerden ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml