כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

Summary

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

Abstract

עם הרצון להבין את תרומתם של מרכיבים תאיים רבים להתפתחות של רקמות מורכבות, כגון סוגי תאים רבים המשתתפים בהתחדשות רקמות, היווצרות גידול, או vasculogenesis, אנחנו המצאתי מודל השתלה סלולרית צבעונית של התפתחות גידול ב שאוכלוסיות תאים שמקורם מעכברים שונים fluorescently צבע כתב גן והם מושתלים, engrafted או מוזרק ובסביבת גידול מתפתחת. לאחר מכן תאים צבעוניים אלה גויסו ושולבו בstroma הגידול. על מנת להעריך כמותית תאי סטרומה מח עצם נגזרים גידול, אנו מושתלים GFP להביע מח עצם כולו מהונדס לתוך RFP קטלני מוקרן להביע עכברים כפי שאושר על ידי IACUC. גידולי 0ovarian שהוזרקו orthotopically לעכברים המושתלים היו נכרת לאחר 6-8 שבועות engraftment וניתחו עבור סמן מח עצם ממקור (GFP), כמו גם סמני נוגדנים לזהות גידול קשורstroma תוך שימוש בטכניקות הדמיה multispectral. לאחר מכן, אנו הותאמו המתודולוגיה שאנו מכנים MIMicc-Multispectral חקירה של יצירות סלולריות Multiplexed, באמצעות unmixing multispectral של fluoroprobes להעריך כמותית שכותרתו התא בא ממנה האוכלוסיות מתחילות (המבוססות על תוויות גן כתב מקוריות), וכמו היכולת שלנו unmix 4, 5 , 6 או יותר ספקטרום לעליות שקופיות, הוספנו אימונוהיסטוכימיה נוספת הקשורות לשושלות תאים או בידול כדי להגדיל את הדיוק. ניצול תוכנה כדי לזהות אותות מרובבים-ניאון מקומי משותף, ניתן לייחס אוכלוסיות סטרומה גידול, מנויות ומאופיינות מבוססות על כתמי סמן. ¹

Introduction

הבנת התפתחות ותיקון רקמות היא משמעותית להבהרת מרכיבים תאיים משתתפים בריפוי פצעים, ^2,3 רפואת רגנרטיבית, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של גידול. בנסיבות של תיקון, סוגים רבים של תאים לחדור microenvironment שמסביב כדי לסייע בכלי דם, בתצהיר ECM, שגשוג ובנייה מחדש של רקמות. ניתן לזהות גורמים ופנוטיפים סלולריים המבוססים על פרמטרים מרובים, סמנים מרובבים שיכול לזהות את הלוקליזציה, מצב בידול ויחסי גומלין בין מרכיבים תאיים בתוך microenvironment נחקר. במסמך זה, אנו מתארים את התפתחות גידול כדוגמא טיפוסית למודל השתלה זו ססגוניות-תאית ואחרי ההדמיה multispectral ומתודולוגיה unmixing רפאים.

התקדמות גידול היא תהליך רב שלבי שהתאפיין במספר יכולות שנרכשו הכוללות משופרת התפשטות,מאפייני ntiapoptotic, פולשנית ואנגיוגנזה. התפתחות גידול ⁴ הוא הקלה על ידי תאים שאינם neoplastic כי הם גויסו לסביבה כדי לספק גורמי גדילה, מטריצות מבניות, רשתות כלי דם ואפנון חיסוניים. ^1,5,6 microhabitat זה מורכב מהתאים שמקורם רקמות מקומיות, שכנות כמו שומן, וכלי דם ומקורות רחוקים, כמו תאים שמקורם במח עצם ^1. התאגדות מסוג התאים לא neoplastic מידת ההשפעה תלויה בביקוש מהגידול, אשר לעתים קרובות תואם את השלב / הכיתה של הגידול. כדי להבין את תפקידו של המיקרו תומך הגידול, יש להבין את מקורו ואת פוטנציאל ההתמיינות של אוכלוסיות תאים שאינם neoplastic.

פרוטוקול זה תוכנן כדי לסייע בפרשנות של התקדמות גידול באמצעות ההדמיה של שני מרכיבים התאיים שמקורם במח העצם, וderiv הרקמות המקומיתed תאים. ניצול עכברים להביע גן כתב ניאון מהונדסים, אנחנו מושתלים GFP מח עצם (חלבון ירוק ניאון) לRFP קטלני מוקרן עכבר (חלבון אדום ניאון). בעקבות קליטתם מח עצם מוצלחת, שורת תאים הסרטני syngeneic מוזרקת orthotopically ואפשרה לנקלטת ל4-8 שבועות. הגידול וכתוצאה מכך הוא נכרת מהעכבר ומעובד לimmunofluorescent (IF) מכתים לדמיין את רכיבי סטרומה. ריבוב אם סמנים הוא טכניקה הנפוצה שכרוכה באופטימיזציה משמעותית ^7-9, זאת תוך שימוש בפלטפורמת ההדמיה / unmixing multispectral משפר את הפוטנציאל לשילובי סמן פלואורסצנטי שיש להם חפיפה ספקטרלית. במסמך זה אנו מציגים טכניקה שאנחנו מכנים חקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed להכתים ולנתח עד שמונה סמנים בתוך קטע גידול בשקופית אחת על מנת לנתח את המקורות התאיים, התמיינות תאית status ותאי תאי אינטראקציות של רכיבים בתוך microenvironment הגידול. יש דוגמא פשוטה זו יש הפוטנציאל להיות מורחב על מנת לנתח חמש, שש, או יותר סמני ניצול נוגדנים או ביטוי תאיים מונע אמרגן ניאון. לוח רשימות 1 שילובי מכתים נוגדן ניאון פוטנציאליים עם מינים מתאימים נלקחו בחשבון.

Protocol

Syngeneic Murine להשתלת מח עצם (BMT) כפי שאושרה על ידי פרוטוקולי IACUC מוסדיים (הערה: הצלחה של פרוטוקול זה דורשת ניצול מכל סוג שכותרתו תא (ים) כיעד לניתוח multispectral, וכדי להקל על הניתוח במורד הזרם, אפשר לנצל כל גנטית או תיוג סלולארי יציב. אנו מציעים כי כל תא, רקמה, או יכול להיות מיושם איבר לעתיד למודל השתלה וכי ההשתלה יכולה להכיל אוכלוסיות שכותרתו ייחודיות רבות כמו המחקר ימצא שימושי. בנוסף, שכותרתו רבת מערכות סלולריות , כמו אלה שנמצאו בעכברים מהונדסים המכילים מספר רב של שושלת מוגבלת-fluorescently שכותרת אוכלוסיות יכולות להיות מתוכננות כדי למנוע סיבוכי השתלה לחקר מצבים פתולוגיים מסוימים.

1. קטלני להקרין עכברי נמען BMT עם מנה אחת של ארבע שעות 9.5 Gy לפני הכינון מחדש עם תורם מח עצם. (מקבלי BMT GFP צריכים להיות 6-10 שבועות של גיל).
2. להרטיב את פרוות העכבר עם אתנול 70% לפני גזיר ולקלף אותו כדי לחשוף את הגפיים האחורי עם מספריים כירורגיות סטריליות. הסר את כל הרגל, כולל רכס הכסל במפרק הע"כ. מחק את הרגל על ​​ידי חיתוך שמעל הקרסול, ולאחר מכן ביסודיות להסיר את כל השרירים, רצועות ורקמות עודפות מעצם. מח סומק מפסגת השוקה, fibia וכסל עם מחט 23 G באמצעות FBS סטרילי 2% ב-PBS (PBS-2). (יש להקריב תורמי RFP BMT על פי סטנדרטים מוסדיים.)
3. פורסים בעדינות ולרסק את העצמות שנותרו לרסיסים באמצעות אזמל ומלקחיים ולאחר מכן מקום לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר עם 3 מיקרוגרם / מיליליטר collagenase אני עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ב300 סל"ד.
4. למעלה את הצינור עם PBS-2 ולאסוף supernatant לתוך צינור טרי ולשלב עם תאים סמוקים. ספין למטה ב250rpm במשך 5 דקות ב 4 ° C.
5. Resuspend תאים ב-PBS-2 ולסנן דרך 40 מסנן תא ננומטר. בשלב זה, יכול להיות מתויג התאים לfluorescenלא הופעל מיון תא (FACS) אם רוצה לתפעל אוכלוסיות ספציפיות לBMT.
6. Resuspend 2 x 10 ⁶ תאים לכל 100 μl PBS, לכל עכבר. השתמש 29 מחט G להזריק מערכתית לעכברים נמען GFP מוקרנים על ידי זנב או וריד-פוע בצד למעלה רטרו מסלולית. הזרק עכבר אחד עם 100 μl PBS רק כשליטת engraftment. השתמש במנורת חום להרחבת כולים לפני הזריקה ולהשתמש איפוק הזרקה לוריד זנב על זריקה. יש לי גזה סטרילית זמינה להפעיל לחץ אור לתפקיד זנב הזריקה.
7. שלושה שבועות לפרסם BMT, לאסוף רטרו orbitally דם ולנתח ידי cytometry זרימה כדי לאשר את קיומם של תאים במחזור ה-GFP והיעדר תאי RFP במחזור. עכבר השליטה מת בשלב זה.

2. Engraftment גידול פי הנחיות IACUC המוסדיים

1. לגדול ID8 תאי השחלות עכבריים סרטניים במבחנה לפני in vivo הזרקה (1 x 10 ⁶ גאמות לכל עכבר). יום של הזרקה, trypsinize תאים, לשטוף עם PBS ו resuspend ב PBS ב 1 x 10 ⁶ תאים לכל 100 μl.
2. הזרק תאים סרטניים לתוך חלל intaperitoneal של העכבר, מחט צריכה להיות פוע בצד למעלה. לעקר ראיית הזרקה עם 70% אתנול. הזרק לפינה השמאלית התחתונה או ברבע ימני תחתון של הבטן (גולגולת ומעט המדיאלי לקבוצה הנחותה של פטמות בטן של עכבר נקבה), להימנע מפגיעה באיברים. לרסן את העכבר על ידי גרירה בעורף ומחזיק את הזנב עם הזרת או טבעת. יכולים להיות מורדמים עכברים עם isoflurane להליך זה.
3. להקריב את העכברים כאשר סימנים של engraftment גידול, כגון נפיחות בבטן קלות, הם נראים לעין. זה יתרחש מעל 4-12 שבועות.
4. גידולי בלו מחלל ה-IP. גידולים בתוך החלל ייראו כמו גושים לבנים על ומסביב את פני השטח של האיברים. עם אזמל, להסיר את הגידולים ואת המקום בצינור / צנצנת פורמלין 10% ל24 קיבעון שעה. p היסטולוגיתפיצוי יכול להיות שמקורו מחוץ לליבת פתולוגיה / היסטולוגיה אם חומרים כימיים וחומרים אינם זמינים להטבעת פרפין והכנת שקופיות. רקמות סעיף ל5-8 מיקרומטר פרוסות בשקופיות זכוכית לנהלים מכתים שלאחר מכן.

3. Multi-פרמטר Immunofluorescent מכתים

1. הכן את שקופיות בקרת צבע יחידה עבור כל בדיקה ניאון נוצלה בניסוי. בתרחיש זה, בארבעה צבעים נמצאים בשימוש. לכן, ארבע מגלשות לכל צבע בודד, כמו גם שקופית אחת לבקרת רעשי רקע ולבסוף שקופית אחת לצביעת שילוב המלאה. (סה"כ שקופיות = 6) כל השקופיות תעובד לצד זו באופן זהה כדי למזער וריאציה ניסיונית.
2. אופים סעיפי פרפין ב56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
3. שקופיות לשטוף 3x 10 דקות בקסילן.
4. לשטוף 2x 5 דקות 100% אתנול.
5. לשטוף 1x 3 דקות 95% אתנול
6. לשטוף 1x אתנול 2 min90%.
7. לשטוף 1x אתנול 2 min70%.
לשטוף במים. לאט לטבול את המתלה הצביעה פנימה וחוצה של 10x המים.
8. במהלך הסדרה לשטוף האחרונה, חיץ ציטרט הנתרן מראש רתיחה במשך 2 דקות (במיקרוגל על ​​גבוה). (ניתן להחליף עם חיץ טריס-EDTA בהתאם לנוגדנים בשימוש)
9. מרתיחים את השקופיות עבור 20 דקות בחיץ ציטרט הנתרן (מיקרוגל ב10% כוח או בסיר לחץ). אם חיץ שחין, לכבות את המיקרוגל ולתת לשבת.
10. להסיר ממקור חום ולתת את השקופיות לנוח 30 דקות בחיץ ציטרט הנתרן כדי להתקרר.
11. יש לשטוף את השקופיות במים למשך 5 דקות.
12. מארק סביב סעיפי גידול עם פאפ עט ולשים 2% BSA / 1% חומצת maleic FBS חסימת חיץ במשך שעה 1. הכן את השקופיות בנפרד כדי לא לתת להם להתייבש בשלב זה.
13. הכן נוגדנים עיקריים בדילול אופטימלי בחסימת מאגר. (אם הנוגדנים בשימוש בכל מינים שונים (או וריאציה לשעבר שרשרת IgG הם: IgG1 לעומת IgG2a של אותו מין) הם עשויים להיות בשימוש בשילוב במהלך כתקופת הדגירה ingle. אם מיני נוגדנים חופפים, אז incubations חייב להתבצע ברצף כדי למזער את נוגדן תגובה צולבת.)
14. בשלב זה, ישאיר את שתי שקופיות עם חסימת מאגר בלבד. שתי שקופיות אלה ישמשו שליטה בלא כתם ושליטה כתם גרעיני. פקדי צבע אחד האחרים יהיו הודגרו עם נוגדנים ראשוניים בודדים. רק את שקופית הניתוח תהיה שילוב של נוגדנים ראשוניים.
15. דגירה שקופיות עם נוגדן ראשוני בתיבת תא לחות על שייקר מסתובב באיטיות על 4 מעלות למשך הלילה (~ 16-20 שעה) (הערה: כשעובדים עם 4 fluorophores +, מכתים רציף או נטיה ישירה עשוי להיות נחוץ כדי למזער את נוגדן תגובה צולבת . בנסיבות אלה לחזור על שלבים 1.16-1.21 עד שכל הנוגדנים מוחלים על השקופיות.)
16. לשטוף שקופיות עבור 10 דקות בPBST (2x) בעדינות על שייקר
17. בעוד הוא הולך לשטוף, להכין 488 AlexaFluor, 594 ו647 נוגדנים משני לדילול סופישל 1:1,000 בחסימת מאגר. (ודא נוגדנים ודילולים אלה נשמרים על 4 מעלות צלזיוס ובחושך בכל העת לשמר את הקרינה על פני קבוצות ובמשך זמן.)
18. בשקופיות שליטת צבע אחד, מקום אחד דילולים AlexaFluor המינים של הנוגדן הראשוני משמש התאמה. כל הנוגדנים משני ימוקמו בשקופית הניתוח. שקופיות השליטה המוכתמות בלא כתם והגרעיניים יישארו עם חסימת חיץ לאורך כל שלב זה.
19. דגירה בתיבת תא לחות (מכוסה בנייר אלומיניום, כדי להימנע מחשיפה לאור) על שייקר איטיים מסתובב ב RT במשך שעה 2.
20. לשטוף שקופיות עבור 5 דקות בPBST (2x) בעדינות על שייקר. מכסה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
21. להוסיף DAPI (1:10,000) עבור 1 דקות לשקופית-DAPI בלבד ושקופיות הניתוח. מכסה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. שקופיות האחרות ניתן להשאיר מכוסים במכל השטיפה.
22. שטוף שני מודגרות-DAPIשקופיות במכל נפרד לשטיפת 5 דקות הראשונות שלא לזהם את השקופיות האחרות עם כתם DAPI. לשטיפת דקות השנייה 5, ניתן לשלב את השקופיות בPBST (כל שטיפות צריכה להתנהל על שייקר). מכסה בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
23. שקופיות טבילה קצרה במים לפני (עובי 1.5 עם תקשורת הרכבה מימית לשמר הקרינה) מחליק כיסוי
24. בואו 3 שעות יבשות בחושך ב RT.
25. חותם את הקצוות של הכיסוי להחליק עם מסמר מקשה. (אין להשתמש בלק כמו אצטון יכול להרוות את אות הניאון).
26. נתח את השקופיות באופן מיידי או לאחסן ב 4 ° C לניתוח בעתיד.

4. הדמיה multispectral

1. לאסוף תמונות multispectral ניצול מצלמה Nuance EX (המכילה מסנן מתכונן גביש נוזלי) על ה-X 63 מיקרוסקופ הזקוף אולימפוס עם תוכנת Nuance לאיסוף נתונים.
2. לאסוף תמונות באמצעות אובייקטיבי שמן כדי להגדיל את הרזולוציה.
3. Initial ההגדרה כוללת הגדרת טווח הספקטרום עבור כל fluorophore בשימוש.
   1. ל4 צבע:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. קח את תמונה ראשונית של שקופית הניתוח כדי להשיג זמני חשיפה הנכונים עבור כל אחד מטווחי הרפאים.
5. יצירה "ספריית רפאים" שהתוכנה תהיה להשתמש בו כדי לזהות ולהפריד את יחס אות לרעש של fluorophores אחד מהשני ואות רקע. (הערה: כל fluorochrome חייב להיות שקופית אחת משלה שליטה בצבע כדי להרכיב ספריית רפאים עם עקומות אורך גל מתאימות כדי להבטיח ניתוח נכון של ערכת נתוני דוגמא: 3 fluorophores = 4 מגלשות שליטה; 5 fluorophores = 6 שקופיות שליטה.).
   1. תמונת השקופיות בלא כתם ראשון. שקופית זו תהיה מיועדת בתוך librar הרפאיםy כרקע.>
   2. תמונה להחליק DAPI בלבד שנייה. שקף זה ישמש לייעד גרעינים צבעוניים DAPI עם האפשרות "לצייר" ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כDAPI.>
   3. תמונה להחליק שלישי. AF488 בלבד שקף זה ישמש לייעד את האזורים המוכתמים-AF488 עם האפשרות "לצייר" ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כAF488.>
   4. תמונה להחליק AF594 רק רבע. שקף זה ישמש לייעד את האזורים המוכתמים-AF594 עם האפשרות "לצייר" ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כAF594.>
   5. תמונה להחליק AF647 רק חמישית. שקף זה ישמש לייעד את האזורים המוכתמים-AF647 עם האפשרות "לצייר" ויישמר בתוך הספרייה ספקטרלית כAF647.>
   6. בעקבות האוסף של כל רכיב ספקטרלי בודד,להציל את ספריית הרפאים והפרוטוקול.>
6. ברגע שספריית הרפאים היא מוחלטת, למצוא אזורים של עניין בשקופית הניתוח במיקרוסקופ ולאסוף / לשמור תמונות.>

5. ניתוח כמותי של תמונות Multispectral

1. לייבא מגוון מייצג של תמונות Nuance רכשו באמצעות להודיע ​​תוכנה.
2. פתח את ספריית רפאים נשמרה כבבימויו של התכנית
3. לזהות אזורי רקמות של עניין כדי להיות מנותחים. (רקמה למשל גידול לעומת רקמת שומן).
4. לזהות תאים בודדים המבוססים על DAPI-כתם. ציטופלסמה תוגדר באופן אוטומטי המבוססת על הצורה של הגרעין.
5. לבחור את עוצמת קריאה החוצה ניאון של בחירה עבור כל פרמטר ניאון (למשל אומר סטייה, סטנדרטית)
6. אצווה רכש תמונות ולתת לתהליך התוכנה באמצעות האלגוריתם המוצע.
7. כאשר עיבוד התמונה הוא סיים, למזגקבצי התוצאה.
8. פתח את התוצאות באקסל (או כל חבילת תוכנת אנליטיות אחרת) ואת העלילה שתי עוצמות ניאון אחד נגד השני על XY ציר. כל עוצמת ניאון היא נתון לכל תא. התאים החיוביים כפולים יופיעו ברבע הימני העליון. משתמש צריך להגדיר את עוצמות ניאון תחילת המחקר.

תוצאות

שימוש בטכניקת הדמיה multispectral לנתח גידולי engrafted במודל העכבר המהונדס שלנו BMT, אנו מסוגלים להבחין במרכיבי גידול סטרומה שהם ממוצא מח עצם. BMT הראשוני אושר שלושה שבועות לאחר השתלה על ידי cytometry זרימה (איור 1). Orthotopically הזריק גידולי השחלות ללא תווית הבאה אישורי engraftment BMT ה...

Discussion

במסמך זה אנו מתארים את היישום של ההדמיה multispectral אנו מתארים כחקירת MIMicc-multispectral של יצירות סלולריות Multiplexed, לנתח את רכיבי סטרומה שמקורם במח העצם של microenvironment הגידול, לעומת זאת מתודולוגיה זו ורעיון יכולים להיות מיושמים לפענוח מרכיבים תאיים אחרים המרכיבים את מתחם רקמות כמו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml