Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

Résumé

Masses tissulaires complexes, à partir d'organes à des tumeurs, sont composées de différents éléments cellulaires. Nous avons élucidé la contribution des phénotypes cellulaires dans un tissu en utilisant des souris transgéniques fluorescentes marquées multi-paramètres multiples en combinaison avec la coloration par immunofluorescence suivie par déconvolution spectrale de déchiffrer l'origine de la cellule ainsi que les caractéristiques des cellules sur la base de l'expression de protéine.

Résumé

Avec la volonté de comprendre les contributions des éléments cellulaires multiples à l'élaboration d'un tissu complexe, tels que les nombreux types cellulaires qui participent à la régénération du tissu, formation d'une tumeur, ou la vasculogenèse, nous avons conçu un modèle de transplantation cellulaire multicolore de développement de tumeurs chez populations de cellules qui proviennent de différentes souris à gène rapporteur colorées par fluorescence et sont transplantés, greffés ou injectés dans et autour d'une tumeur en développement. Ces cellules colorées sont ensuite recrutés et incorporés dans le stroma tumoral. Afin d'évaluer quantitativement les cellules stromales de tumeurs dérivées de la moelle osseuse, nous avons transplanté exprimant la GFP ensemble transgénique moelle osseuse en DP mortellement irradié exprimer souris approuvé par IACUC. 0ovarian tumeurs qui ont été injectés de manière orthotopique dans les souris greffées ont été excisés 6-8 semaines après la prise de greffe et analysés pour le marqueur de la moelle osseuse d'origine (GFP) ainsi que des marqueurs d'anticorps pour détecter associé à une tumeurstroma en utilisant des techniques d'imagerie multispectrale. Nous avons ensuite adapté une méthode que nous appelons MIMicc-multispectrale Interrogation de compositions cellulaires multiplexés, en utilisant unmixing multispectrale de fluoroprobes d'évaluer quantitativement qui marqué cellule est venu à partir de laquelle les populations de départ (basé sur les étiquettes d'origine de gènes rapporteurs), et que notre capacité à unmix 4, 5 , 6 ou plusieurs spectres par glissement augmente, nous avons ajouté immunohistochimie supplémentaire associée à des lignées cellulaires ou la différenciation pour augmenter la précision. Utilisant le logiciel pour détecter les signaux multiplexés fluorescent co-localisées, les populations du stroma de la tumeur peuvent être tracées, énumérés et caractérisés en fonction de marqueur coloration. ¹

Introduction

Comprendre le développement et la réparation tissulaire est important d'élucider les composants cellulaires qui participent à la cicatrisation des plaies, ^2,3 médecine régénérative, la biologie du développement et de la biologie de la tumeur. Dans des circonstances de la réparation, de nombreux types de cellules infiltrent le microenvironnement entourant à l'aide de la vascularisation, le dépôt de l'ECM, la prolifération et la restructuration des tissus. Facteurs cellulaires et les phénotypes peuvent être identifiés sur la base de plusieurs paramètres, marqueurs multiplexés qui peuvent identifier la localisation, l'état de la différenciation et de l'interaction entre les composants cellulaires dans le microenvironnement enquête. Ici, nous décrivons le développement de la tumeur comme un exemple typique de ce modèle de greffe multicolore-multicellulaire suivi par imagerie multispectrale et la méthodologie de déconvolution spectrale.

La progression tumorale est un processus en plusieurs étapes qui est marquée par plusieurs capacités acquises qui incluent augmentation de la prolifération, unpropriétés ntiapoptotic, invasives et angiogéniques. ⁴ développement de la tumeur est facilitée par des cellules non néoplasiques qui sont recrutés dans l'environnement à fournir des facteurs de croissance, des matrices structurelles, les réseaux vasculaires et la modulation immunitaire. ^1,5,6 Ce micro-habitat est constitué de cellules dérivées de , les tissus locaux voisins tels que le tissu adipeux, et les vaisseaux sanguins et les sources lointaines comme la moelle osseuse des cellules dérivées ^1. L'étendue de l'incorporation des cellules non-néoplasiques dépend de la demande à partir de la tumeur, ce qui correspond souvent à l'étape / grade de la tumeur. Pour comprendre le rôle du micro-environnement de la tumeur de support, il faut comprendre l'origine et le potentiel de différenciation des populations de cellules non néoplasiques.

Ce protocole a été conçu pour aider à l'interprétation de la progression de la tumeur par le biais de la visualisation à la fois des composants cellulaires dérivées de la moelle osseuse, et la deriv tissulaire localecellules ed. Utilisant des souris fluorescentes de gènes exprimant journaliste transgéniques, nous avons transplanté GFP (protéine fluorescente verte) de la moelle osseuse dans un DP mortellement irradié (protéine rouge fluorescente) de la souris. Suite au succès la prise de greffe de moelle osseuse, une lignée cellulaire de tumeur syngénique est injecté orthotopique et on le laisse se greffer à 4-8 semaines. La tumeur résultant est excisé de la souris et traitées pour immunofluorescence (IF) pour visualiser la coloration des composants du stroma. Multiplexage SI marqueurs est une technique couramment utilisée qui implique une optimisation considérable ^9.7, mais en utilisant une plate-forme d'imagerie / de démixage multispectral améliore le potentiel de combinaisons de marqueurs fluorescents qui possèdent un recouvrement spectral. Nous présentons ici une technique que nous appelons interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés pour colorer et analyser jusqu'à huit marqueurs d'une section de la tumeur sur une seule lame afin d'analyser les origines cellulaires, la différenciation cellulaire stATU et les interactions cellule-cellule des composants dans le microenvironnement tumoral. Cet exemple simplifié a le potentiel d'être développée afin d'analyser cinq, six, ou plusieurs marqueurs utilisant des anticorps ou intracellulaire expression fluorescent promoteur-entraînée. Tableau 1 énumère potentiels fluorescentes combinaisons anticorps de coloration avec des espèces appropriées prises en compte.

Protocole

Syngénique murin de moelle osseuse (GMO), tel qu'approuvé par les protocoles institutionnels IACUC (Note: Le succès de ce protocole nécessite l'utilisation de n'importe quel type de cellule marquée (s) comme cible pour l'analyse multispectrale, et de faciliter l'analyse en aval, on peut exploiter tout génétique ou l'étiquetage cellulaire stable. Nous suggérons que n'importe quelle cellule, tissu ou organe à-être-peut être appliquée à un modèle de transplantation et la greffe peut contenir autant de populations marquées uniques que la recherche jugera utile. outre, multi-étiquetés systèmes cellulaires , tels que ceux trouvés dans les souris transgéniques contenant lignée multiple restreinte marquées par fluorescence populations peuvent être conçus pour éliminer les complications de greffe pour l'étude de certains états pathologiques.

1. Irradier Lethally souris receveuses BMT avec une seule dose de 9,5 Gy quatre heures avant la reconstitution avec donneur de moelle osseuse. (Bénéficiaires BMT GFP doivent être 6-10 semaines d'âge).
2. Mouiller la peau de souris avec 70% d'éthanol avant écrêtage et éplucher pour exposer les membres postérieurs avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Retirer la jambe entière, y compris la crête iliaque de l'articulation sacro-iliaque. Jeter le pied en coupant juste au-dessus de la cheville, puis retirez soigneusement tous les muscles, les ligaments et les tissus en excès de l'os. Rincer la moelle du tibia, péroné et la crête iliaque avec une aiguille 23 G en utilisant 2% de FBS dans du PBS stérile (PBS-2). (DP donateurs BMT doivent être sacrifiés selon les normes institutionnelles.)
3. Slice et doucement écraser l'os restant en fragments à l'aide d'un scalpel et pince puis placez dans 50 ml tube conique avec 3 pg / ml de collagénase I pendant 1 heure à 37 ° C à 300 tpm.
4. Terminez le tube avec du PBS-2 et recueillir le surnageant dans un nouveau tube et combiner avec des cellules vidées. Isoler à 250rpm pendant 5 min à 4 ° C.
5. Remettre les cellules en PBS-2 et filtrer à travers 40 nm filtre cellulaire. À ce stade, les cellules peuvent être étiquetés pour fluoresct tri cellulaire activé (FACS) si l'on souhaite manipuler des populations spécifiques pour la greffe de moelle osseuse.
6. Reprendre 2 x 10 ⁶ cellules par 100 pi de PBS, par la souris. Utilisez 29 aiguille G à injecter par voie systémique dans les souris receveuses GFP irradiés par la queue ou rétro-orbitaire veine conique côté-up. Injecter une souris avec 100 ul de PBS seulement que le contrôle de la prise de greffe. Utiliser une lampe chauffante pour dilater les vaisseaux avant l'injection et en utilisant un dispositif de retenue pour l'injection dans la veine caudale lors de l'injection. Avoir une gaze stérile disponible à appliquer une légère pression sur l'injection queue de poste.
7. Trois semaines après la greffe de moelle osseuse, sang de recueillir rétro-orbitale et d'analyser par cytométrie en flux pour confirmer la présence de cellules circulantes GFP et l'absence de cellules de la DP circulation. La souris de contrôle sont morts à ce stade.

2. La prise de greffe tumorale Selon institutionnels Directives IACUC

1. ID8 croître des cellules tumorales murines ovariens in vitro avant l'injection in vivo (1 x 10 ⁶ de caunes par souris). Jour de l'injection, traitement à la trypsine, laver avec du PBS et remettre en suspension dans du PBS à 1 x 10 ⁶ cellules par 100 pi.
2. Injecter des cellules tumorales dans la cavité intaperitoneal de la souris, l'aiguille doit être en biseau côté-up. Stériliser vue d'injection avec 70% d'éthanol. Injecter dans le coin inférieur gauche ou le quadrant inférieur droit de l'abdomen (crânienne et un peu en dedans de l'ensemble inférieur de mamelons abdominaux de souris femelle), éviter de heurter les organes. Retenez la souris en saisissant par la nuque et tenant la queue avec le petit doigt ou l'annulaire. Les souris peuvent être anesthésiés avec de l'isoflurane pour cette procédure.
3. Sacrifier la souris lorsque des signes de prise de greffe tumorale, telle qu'une légère ballonnements abdominaux, sont évidentes. Cela se produira plus de 4-12 semaines.
4. tumeurs d'accise de cavité IP. Tumeurs dans la cavité ressemblera nodules blancs sur et autour de la surface des organes. Avec un scalpel, enlever les tumeurs et les placer dans un tube / pot de formol à 10% pendant 24 heures fixation. P histologiqueréparation peut être sous-traité à cœur pathologie / d'histologie si les réactifs et les matériaux ne sont pas disponibles pour inclusion dans la paraffine et la préparation des lames. Section tissu dans 5-8 um tranches sur des lames de verre pour les procédures de coloration suivants.

3. Multi-paramètre immunofluorescence

1. Préparer des lames simples de contrôle de couleur pour chaque sonde fluorescente utilisée dans l'expérience. Dans ce scénario, on utilise quatre couleurs. Par conséquent, quatre diapositives pour chaque couleur ainsi que d'une diapositive pour le contrôle du bruit de fond et enfin une lame pour la coloration de combinaison complète. (Nombre de diapositives = 6) Toutes les lames sont traitées côte à côte d'une manière identique à minimiser la variation expérimentale.
2. Cuire des sections de paraffine à 56 ° C pendant 1 heure.
3. Laver les lames 3x 10 min dans le xylène.
4. Laver 2x 5 min 100% d'éthanol.
5. Laver 1x 3 min 95% d'éthanol
6. Laver 1x 2 min90% d'éthanol.
7. Laver 1x 2 min70% d'éthanol.
8. Laver 1x 2 min dans de l'eau. Immerger lentement le support de coloration dans et hors de l'eau de 10x.
9. Lors de la dernière série de lavage, pré-ébullition tampon de citrate de sodium pendant 2 minutes (micro-ondes en haut). (Peut remplacer par du tampon tris-EDTA en fonction des anticorps utilisés)
10. Faire bouillir les diapositives pendant 20 min dans le citrate de sodium tampon (micro-ondes sur 10% de la puissance ou dans une cocotte-minute). Si le tampon à ébullition, éteindre micro-ondes et laisser reposer.
11. Retirer de la source de chaleur et laisser les lames reposent pendant 30 min dans le tampon de citrate de sodium à refroidir.
12. Rincer les lames dans de l'eau pendant 5 min.
13. Mark autour des sections tumorales ayant Pap Pen et mis BSA 2% / 1% de FBS acide maléique tampon de blocage pendant 1 heure. Préparer les lames individuellement pour ne pas les laisser sécher pendant cette étape.
14. Préparer des anticorps primaires à une dilution optimale dans un tampon de blocage. (Si les anticorps utilisés sont tous des espèces différentes (ou chaîne variation IgG-ex: IgG1 IgG2a vs de même espèce), ils peuvent être utilisés en combinaison pendant quepériode d'incubation Ingle. Si les espèces d'anticorps se chevauchent, alors les incubations doivent être effectuées séquentiellement pour minimiser anticorps contre-réaction.)
15. À ce stade, laisser deux lames avec un tampon de blocage seulement. Ces deux diapositives servir de témoin sans tache et le contrôle de colorant nucléaire. Les autres contrôles simples de couleur seront incubées avec des anticorps primaires individuels. Seul le coulisseau d'analyse aura une combinaison d'anticorps primaires.
16. Incuber les lames avec l'anticorps primaire dans une boîte de la chambre de l'humidité sur un agitateur à rotation lente à 4 ° la nuit (~ 16-20 h) (Remarque: lorsque vous travaillez avec 4 + fluorophores, coloration séquentielle ou une conjugaison directe peut être nécessaire de réduire anticorps contre-réaction . dans ces conditions se répètent jusqu'à ce que toutes les étapes 1.16 à 1.21 anticorps sont appliqués sur les diapositives.)
17. Laver les lames pendant 10 minutes dans du PBST (2x) doucement sur agitateur
18. Bien laver va, préparer AlexaFluor 488, 594 et 647 Anticorps secondaires pour une dilution finalede 1:1000 dans du tampon de blocage. (Assurez-vous que ces anticorps et dilutions sont conservés à 4 ° C et à l'obscurité à tout moment afin de préserver la fluorescence dans des lots et au fil du temps.)
19. Sur les lames de contrôle de couleur simples, placez dilutions AlexaFluor simples correspondant aux espèces de l'anticorps primaire utilisé. Tous les anticorps secondaires seront placés sur la diapositive d'analyse. Les lames de contrôle colorées et non colorées le nucléaire restera avec un tampon bloquant tout au long de cette étape.
20. Incuber dans une boîte de la chambre de l'humidité (recouverte de papier d'aluminium pour éviter exposition à la lumière) sur lent agitateur rotatif à température ambiante pendant 2 h.
21. Laver les lames pendant 5 min en PBS (2x) doucement sur un agitateur. Couvrir de papier d'aluminium pour le protéger de la lumière.
22. Ajouter DAPI (1:10000) pendant 1 min à la lame de DAPI seule et la lame d'analyse. Couvrir de papier d'aluminium pour le protéger de la lumière. Les autres lames peuvent être laissés dans les récipients couverts de lavage.
23. Laver les deux DAPI incubésles lames dans un récipient séparé pour le premier lavage 5 min à ne pas contaminer les autres diapositives avec du DAPI taches. Pour le deuxième lavage 5 min, les lames peuvent être combinés dans du PBST (tous les lavages doivent être effectuées sur un agitateur). Couvrir de papier d'aluminium pour le protéger de la lumière.
24. Diapositives brièvement d'immersion dans l'eau avant (1,5 épaisseur avec les médias de montage aqueux pour préserver fluorescence) glisser couverture
25. Laisser sécher 3 heures dans l'obscurité à la température ambiante.
26. Scellez les bords de la lamelle avec du vernis durcisseur. (Ne pas utiliser de vernis à ongles comme de l'acétone peut étancher le signal fluorescent).
27. Analyser diapositives immédiatement ou conserver à 4 ° C pour une analyse ultérieure.

4. Imagerie multispectrale

1. Recueillir des images multispectrales utilisant une caméra Nuance EX (contenant un filtre accordable à cristaux liquides) sur un Olympus X-63 microscope droit avec le logiciel Nuance pour la collecte de données.
2. Recueillir des images en utilisant un objectif de l'huile pour augmenter la résolution.
3. Initiativel installation comprend l'établissement de la gamme spectrale pour chaque fluorophore utilisé.
   1. Pour 4 couleur:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Prendre une image initiale de la lame d'analyse pour obtenir les durées d'exposition appropriées pour chacune des plages spectrales.
5. Créer "bibliothèque spectrale" que le logiciel utilise pour identifier et séparer le rapport signal-sur-bruit des fluorophores et de l'autre signal de fond. (Remarque: Chaque fluorochrome doit avoir son propre curseur de contrôle de couleur unique pour assembler une bibliothèque spectrale avec des courbes de longueurs d'onde appropriées pour assurer une bonne analyse de l'ensemble de données Exemple: 3 fluorophores = 4 lames de contrôle; 5 fluorophores = 6 lames de contrôle.).
   1. Première image de la diapositive sans tache. Cette diapositive sera désigné au sein du bibliothécaire spectraley comme arrière-plan.>
   2. L'image du DAPI seulement glisser seconde. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les noyaux DAPI colorées avec l'outil "dessiner" et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale DAPI.>
   3. L'image de la AF488 seulement glisser tiers. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les régions AF488 colorées avec l'outil "dessiner" et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale AF488.>
   4. L'image de la AF594 seulement glisser quatrième. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les régions AF594 colorées avec l'outil "dessiner" et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale AF594.>
   5. L'image de la AF647 seulement glisser cinquième. Cette diapositive sera utilisé pour désigner les régions AF647 colorées avec l'outil "dessiner" et sera sauvegardé dans la bibliothèque spectrale AF647.>
   6. Après la collecte de chaque composant spectral,enregistrer la bibliothèque spectrale et le protocole.>
6. Une fois la bibliothèque spectrale est terminée, trouver des régions d'intérêt sur ​​la lame d'analyse sur le microscope et collecter / enregistrer des images.>

5. Analyse quantitative des images multispectrales

1. Importer un assortiment représentatif d'images acquises à l'aide de Nuance InForm logiciel.
2. Ouvrez la bibliothèque spectrale enregistrée selon les directives du programme
3. Identifier des régions de tissus d'intérêt à analyser. (Par exemple les tissus de la tumeur par rapport aux tissus adipeux).
4. Identifier les cellules individuelles basées sur DAPI-tache. Cytoplasme sera défini automatiquement sur la base de la forme du noyau.
5. Choisissez l'intensité de fluorescence de lecture de choix pour chaque paramètre fluorescent (par exemple, moyenne, écart-type)
6. Lot l'acquis images et de laisser le processus de logiciel en utilisant l'algorithme proposé.
7. Lorsque le traitement d'image est terminée, fusionnerles fichiers de résultats.
8. Ouvrez les résultats dans Excel (ou tout autre logiciel d'analyse) et tracer deux intensités de fluorescence uns contre les autres sur axes XY. Chaque intensité de fluorescence est donnée par cellule. Les cellules doubles positives apparaissent dans le quadrant supérieur droit. L'utilisateur doit définir les intensités de fluorescence de base.

Résultats

En utilisant une technique d'imagerie multispectrale pour analyser les tumeurs greffées dans notre modèle de souris transgénique BMT, nous sommes en mesure de discerner les composants de tumeurs stromales qui sont d'origine de la moelle osseuse. La première greffe de moelle osseuse a été confirmé trois semaines après la transplantation par cytométrie de flux (Figure 1). Orthotopiquement injecté tumeurs ovariennes non étiquetés suivant BMT confirmations de prise de greffe ont été ex...

Discussion

Nous décrivons ici l'application de l'imagerie multispectrale, nous décrivons comme interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés, pour analyser la moelle osseuse provenant composantes stromales du microenvironnement de la tumeur, mais cette méthodologie et le concept peut être appliqué à déchiffrer d'autres éléments cellulaires qui composent un complexe tissus tels que ceux observés lors des réactions de cicatrisation des plaies ou lors d'un tissu régénératri...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml