Количественный Мультиспектральный Анализ После Люминесцентная трансплантации тканей для визуализации клеточных Origins, типы и взаимодействий

Резюме

Сложные массы ткани, из органов к опухолям, состоят из различных клеточных элементов. Мы выяснены вклад сотовых фенотипов в ткани с использованием мульти-меченых флуоресцентными трансгенных мышей в сочетании с окрашиванием многопараметрических иммунофлуоресцентным последующим спектральным несмешивания расшифровать клеток происхождение, а также характеристики клеток, основанные на экспрессии белка.

Аннотация

С желанием понять вклад нескольких клеточных элементов в развитие сложной ткани, такие, как многочисленных типов клеток, участвующих в регенерации ткани, образование опухолей, или васкулогенез, мы разработали разноцветные сотовой трансплантата модель развития опухоли у которые популяции клеток происходят из различных флуоресцентно цветных гена-репортера мышей и пересаживают, привиты или вводят в и вокруг развивающейся опухоли. Эти цветные клетки затем на работу и включены в строме опухоли. Для того, чтобы количественно оценить костного мозга стромальные клетки опухоли, мы трансплантировали GFP выражения трансгенного весь костный мозг летально облученных в RFP, экспрессирующих мышей, утвержденной IACUC. 0ovarian опухоли, которые были ортотопически вводили в трансплантированных мышей вырезали 6-8 недель после приживления и анализировали на маркера костного мозга происхождения (GFP), а в качестве маркеров для выявления антител, ассоциированных с опухольюстромы с помощью мультиспектральных методов визуализации. Затем мы адаптировали методику мы называем MIMicc-Мультиспектральный Допрос мултиплексу сотовых композиций, используя мультиспектральных расслоении fluoroprobes количественно оценить, какие помечены ячейки пришли из которых, начиная населения (на основе оригинальных гена-репортера этикеток), и, как нашей способности unmix 4, 5 , 6 или более спектры в увеличении слайд, мы добавили дополнительную иммуногистохимию связанный с клеточных клонов или дифференциации повышения точности. Используя программное обеспечение для обнаружения совместно локализованные уплотненные-люминесцентные сигналы, популяции стромальных опухолей можно проследить, перечисленные и характеризующиеся на основе окрашивания маркера. ¹

Введение

Понимание развития и восстановления тканей имеет важное значение для выяснения, участвующих клеточные компоненты в заживлении ран, ^2,3 регенеративной медицины, биологии развития и биологии опухоли. В условиях ремонта, многочисленные типы клеток проникнуть в окружающую микросреду, чтобы помочь в васкуляризации, осаждения ECM, пролиферации и реструктуризации ткани. Клеточные факторы и фенотипы могут быть определены на основе многопараметрических, мультиплексированных маркеров, которые могут идентифицировать локализацию, состояние дифференциации и взаимодействия между клеточными компонентами в пределах исследуемого микросреды. Здесь мы описываем развитие опухоли как прототип, например, для этого многоцветного-многоклеточные модели трансплантации последующим мультиспектральных изображений и спектрального методологии несмешивания.

Прогрессия опухоли является многоэтапный процесс, который характеризуется несколько приобретенных возможностей, которые включают повышенную пролиферацию, а,ntiapoptotic, инвазивные и ангиогенные свойства. ⁴ Развитие опухоли способствует неопухолевых клеток, которые набранных в окружающую среду, чтобы обеспечить факторы роста, структурные матрицы, сосудистых сетей и иммунную модуляцию. ^1,5,6 Это микросреда состоит из клеток, полученных из местные, соседние ткани, такие как жировой, и кровеносные сосуды и далекие источники, такие как костного мозга, полученных клеток ^1. Степень неопухолевых включения клеток зависит от спроса со стороны опухоли, которая часто соотносится с этапа / сорта опухоли. Чтобы понять роль опухоли поддерживающей микросреды, нужно понять происхождение и дифференциации потенциал населения неопухолевых клеток.

Этот протокол был разработан, чтобы помочь в интерпретации опухолевой прогрессии через визуализации обеих костного мозга, полученных клеточных компонентов, и местные DERIV тканиред клетки. Используя флуоресцентные репортер генов, экспрессирующих трансгенных мышей, мы пересадили GFP (зеленый-флуоресцентный белок) костного мозга в летально облученных RFP (красно-флуоресцентный белок) мыши. После успешного приживления костного мозга, сингенными линия клеток опухоли вводится ортотопически и позволило привить в течение 4-8 недель. В результате опухоль вырезали из мыши и обработаны для иммунофлуоресцентного (ИФ) окрашивания для визуализации стромальных компонентов. Мультиплексирование ЕСЛИ маркеры является широко используемым методом, который включает в себя значительную оптимизацию ^7-9, однако с использованием мультиспектральных изображений / несмешивания платформу улучшает потенциал для люминесцентных комбинаций маркеров, которые обладают спектральной перекрытие. Здесь мы представляем технику мы называем MIMicc-мультиспектральный допрос мултиплексу сотовых композиций для окрашивания и анализировать до восьми маркеров в рамках секции опухоли на одном слайде для анализа клеточных происхождение, клеточной дифференцировки улАТУС и межклеточные взаимодействия компонентов внутри микросреды опухоли. Это упрощенный пример имеет потенциал, чтобы быть расширена на для анализа пять, шесть или более маркеров, использующие антитела или внутриклеточная промоутер управляемой люминесцентные экспрессии. В таблице 1 приведены потенциальные люминесцентные комбинаций окраски антитела с соответствующими видами учитывать.

протокол

Сингенная мышиный Пересадка костного мозга (ТКМ), утвержденного институциональных протоколов IACUC (Примечание: Успех этого протокола требуется использование любой надписью типа (типов) клеток в качестве цели для мультиспектральных анализа, а также содействовать потоку анализ, можно использовать любой генетический или стабильной сотовой маркировка. Мы полагаем, что любая клетка, ткань, орган или-к-быть может быть применен к модели трансплантата и что трансплантат может содержать множество уникальных меченых популяции как исследование считает полезным. Кроме того, мульти-меченого сотовые системы , таких, как те, что в трансгенных мышей, содержащий множественное происхождение ограниченным флуоресцентно меченных населения-могут быть разработаны для устранения трансплантации осложнений для изучения некоторых патологических состояний.

1. Летально облучать мышей-реципиентов BMT с одной дозой 9,5 Гр четырех часов до восстановления с донором костного мозга. (Получателей BMT GFP должно быть 6-10 недельного возраста).
2. Смочите шкуру мыши с 70% этанола до отсечки и пилинг его обратно, чтобы разоблачить задние конечности стерильными хирургическими ножницами. Удалить всю ногу включая гребня подвздошной кости в крестцово-подвздошных сочленений. Откажитесь от ногу за счет сокращения чуть выше лодыжки, а затем тщательно удалить все мышцы, связки и лишнюю ткань из кости. Флеш мозг от голени, fibia и гребня подвздошной кости с иглой 23 G с использованием 2% FBS в стерильные PBS (PBS-2). (BMT RFP доноры должны быть принесены в жертву в соответствии с институциональными нормами.)
3. Срез и осторожно раздавить оставшиеся кости на фрагменты с помощью скальпель и пинцет, а затем поместить в 50 мл коническую пробирку с 3 мкг / мл коллагеназы I в течение 1 часа при 37 ° С при 300 оборотах в минуту.
4. Завершают трубку с PBS-2 и собрать супернатант в новую пробирку и смешать с румянцем клеток. Спин вниз на 250rpm в течение 5 мин при 4 ° С.
5. Ресуспендируют клеток в PBS-2 и фильтруют через 40 фильтра нм клеток. В этот момент клетки могут быть помечены для fluorescenт Активированный сортировки клеток (FACS), если кто-то хочет манипулировать конкретные группы населения, для ТКМ.
6. Ресуспендируют 2 х 10 ⁶ клеток на 100 мкл PBS, на мышь. Используйте 29 г иглы для системно впрыснуть в облученных мышей-реципиентов GFP хвостом или ретро-орбитальной вены-конической стороной вверх. Введите одну мышь с 100 мкл PBS только в качестве контроля приживления. Используйте тепла лампы, чтобы расширить сосуды перед инъекцией и использовать в хвостовую вену впрыска сдержанность при инъекции. Есть стерильную марлю доступный для применения светового давления инъекции в хвостовую сообщению.
7. Три недели после ТКМ, собирать ретро-орбитально крови и анализ с помощью проточной цитометрии, чтобы подтвердить наличие GFP циркулирующих клеток и отсутствие RFP циркулирующих клеток. Управление мышью умрет в этой точке.

2. Опухоль Приживление По институциональных IACUC Руководства

1. Расти ID8 яичников мышиных опухолевых клеток в пробирке до в естественных условиях инъекций (1 х 10 ⁶ грлоктей на мышь). День инъекции, Trypsinize клетки, промывают PBS и ресуспендируют в PBS в 1 х 10 ⁶ клеток на 100 мкл.
2. Введите опухолевых клеток в intaperitoneal полости мыши, игла должна быть конической стороной вверх. Стерилизовать впрыска прицел с 70% этанола. Введите в левом нижнем углу или правом нижнем квадранте живота (черепной и слегка медиально к нижней набора брюшной соски женской мыши), избежать столкновения органы. Задержите курсор, захватывая за шкирку и проведение хвост с мизинец или безымянном пальце. Мыши могут быть анестезируют изофлураном для этой процедуры.
3. Жертвоприношение мышей, когда признаки приживления опухоли, такие как небольшой вздутие живота, являются очевидными. Это произойдет более 4-12 недель.
4. Акцизные опухоли от IP полости. Опухоли внутри полости будет выглядеть белыми узелков на поверхности органов и вокруг. С помощью скальпеля, удалить опухоли и поместите в трубке / банку 10%-ного формалина в течение 24 часов записи. Гистологическое рвозмещение может быть из-источников, чтобы патология / гистологии ядра, если реагенты и материалы не являются легкодоступными для парафин и подготовки слайд. Раздел ткани в 5-8 мкм ломтики на стеклах для последующих процедур окрашивания.

3. Многопараметрическая Иммунофлуоресцентное Окрашивание

1. Подготовка Single слайды управления цветом для каждого флуоресцентного зонда, используемого в эксперименте. В этом случае используются четыре цвета. Таким образом, четыре горки для каждого отдельного цвета, а также один слайд для контроля фонового шума и, наконец, одного слайда для полного окрашивания комбинированной. (Всего скользит = 6) Все слайды будут обработаны бок о бок в идентичным образом, чтобы минимизировать экспериментальную вариации.
2. Выпекать парафиновых срезов при 56 ° С в течение 1 часа.
3. Вымойте слайды 3x 10 мин в ксилоле.
4. Вымойте 2x 5 мин 100% этанола.
5. Вымойте 1x 3 мин 95% этанола
6. Вымойте 1x 2 min90% этанола.
7. Вымойте 1x 2 min70% этанола.
Вымойте 1x 2 мин в воде. Медленно опускайте Штатив для окрашивания в и из воды в 10 раз.
8. Во время последней серии стирки, предварительно кипятить цитрат натрия буфера в течение 2 мин (СВЧ на высокий). (Можно заменить с Трис-ЭДТА буфере в зависимости от антител в использовании)
9. Отварить слайды в течение 20 мин в натрия буфера цитрата (СВЧ на 10% мощности или в скороварке). Если буфер закипит, выключить микроволновку и пусть сидят.
10. Удалить из источника тепла и пусть слайды отдохнуть в течение 30 мин в буфере цитрата натрия, чтобы остыть.
11. Промыть слайды в воде в течение 5 мин.
12. Mark вокруг опухолевых срезах с Pap Перо и положить 2% BSA / 1% FBS малеиновую кислоту блокирующем буфере в течение 1 часа. Подготовьте слайды индивидуально, чтобы не позволить им высохнуть на этом этапе.
13. Подготовка первичных антител при оптимальном разведении в блокирующем буфере. (Если антитела в использовании все из различных видов (или IgG цепь изменение экс-: IgG1 против IgG2a того же вида) они могут быть использованы в сочетании в течение какИнгл инкубационный период. Если антитела видов перекрываются, то инкубации должна осуществляться последовательно, чтобы минимизировать перекрестные антитела реакцию.)
14. На данный момент, оставить две горки с блокировки только буфер. Эти две горки будет служить незапятнанной контроля и контроля над ядерными пятен. Другие единичные управления цветом будет инкубировали с отдельных первичных антител. Только анализ слайд будет иметь сочетание первичных антител.
15. Выдержите слайды с первичным антителом в камерном влаги коробке на медленно вращающейся качалке при 4 ° в течение ночи (~ 16-20 час) (Примечание: при работе с 4 + флуорофорами, последовательного окрашивания или прямого сопряжения может быть необходимо, чтобы минимизировать антител кросс-реакцию . В этих условиях повторить шаги 1,16-1,21, пока все антитела не применяются к слайдам.)
16. Промыть слайдов в течение 10 мин в PBST (2х) осторожно на шейкере
17. В то время как мыть собирается, подготовить AlexaFluor 488, 594 и 647 вторичных антител для конечного разведения1:1000 в блокирующем буфере. (Убедитесь, что эти антитела и разведения хранить при температуре 4 ° С и в темноте во все времена, чтобы сохранить флуоресценции через партиями и с течением времени.)
18. На отдельных слайдов управления цветом, поместите одиночные разведения AlexaFluor, соответствующие виды первичного антитела используются. Все вторичные антитела будут размещены на анализ слайда. В неокрашенные и ядерные окрашенных слайды управления останется блокирующим буфером в течение этого шага.
19. Выдержите в камерном влаги окне (покрытой алюминиевой фольгой для предотвращения попадания света) на медленной вращающейся качалке при комнатной температуре в течение 2 часов.
20. Промыть слайдов в течение 5 мин в PBST (2х) осторожно на шейкере. Накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света.
21. Добавить DAPI (1:10000) в течение 1 мин к DAPI только горкой и анализа слайда. Накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света. Остальные слайды могут быть оставлены покрыты промывных емкостей.
22. Вымойте два ДАПИ инкубировалислайды в отдельной емкости в течение первых 5 мин стирки, чтобы не загрязнить другие слайды с DAPI пятна. Для второго 5 мин стирки, слайды могут быть объединены в PBST (все моет следует проводить на шейкере). Накрыть алюминиевой фольгой для защиты от света.
23. Кратко погружные скользит в воде, прежде чем крышка-скольжения (1,5 толщины с водных монтажных СМИ для сохранения флуоресценции)
24. Дайте высохнуть 3 ч в темноте при комнатной температуре.
25. Печать края покровного стекла с лаком для отвердителя. (Не используйте лак для ногтей, как ацетон может утолить флуоресцентного сигнала).
26. Сразу Анализ слайды или хранить при 4 ° С для последующего анализа.

4. Мультиспектральных изображений

1. Сбор мультиспектральных изображений, использующие камеру Нюанс EX (содержащий жидкокристаллический фильтр перестраиваемый) на Olympus X-63 прямой микроскоп с Nuance программного обеспечения для сбора данных.
2. Сбор фотографий с использованием масляного цели увеличить разрешение.
3. Первол установка включает в себя установку спектральный диапазон для каждого флуорофора в использовании.
   1. Для 4 цвета:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Возьмем начальное изображение анализа ползуна для получения надлежащих время экспозиции для каждого из спектральных диапазонов.
5. Создание "спектральные библиотеки", что программное обеспечение будет использовать для выявления и отделить отношение сигнал-шум из флуорофорами друг от друга и фоновый сигнал. (Примечание: Каждый флуорохромом должен иметь свой ​​собственный отдельный слайд управления цветом для того, чтобы собрать спектральную библиотеку с соответствующими кривыми длин волн для обеспечения надлежащего анализа набора данных Пример: 3 флуорофоры = 4 горки контроля; 5 флуорофоры = 6 горки Control.).
   1. Изображение неокрашенных слайд первым. На этом слайде будут обозначены в спектральном Librarу в качестве фона.>
   2. Изображение DAPI только скользить второй. На этом слайде будет использоваться для обозначения DAPI-окрашенные ядра с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как DAPI.>
   3. Изображение AF488 только скользить треть. На этом слайде будет использоваться для обозначения AF488-окрашенные регионы с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как AF488.>
   4. Изображение AF594 только скользить четвертый. На этом слайде будет использоваться для обозначения AF594-окрашенные регионы с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как AF594.>
   5. Изображение AF647 только скользить пятый. На этом слайде будет использоваться для обозначения AF647-окрашенные регионы с помощью инструмента "привлечь" и будет сохранен в спектральном библиотеки как AF647.>
   6. После сбора каждого отдельного спектрального компонентасохранить спектральные библиотеки и протокол.>
6. После того, как спектральная библиотека будет завершена, найти интересующие участки на анализ слайда на микроскопе и собирать / сохранения изображений.>

5. Количественный анализ мультиспектральных изображений

1. Импорт представительный ассортимент получаемых изображений Nuance использованием InForm Software.
2. Откройте сохраненный спектральные библиотеки в соответствии с указаниями программы
3. Определить ткани регионах, представляющих интерес для анализа. (Например, опухоли тканей по сравнению с жировой ткани).
4. Определить отдельные ячейки на основе DAPI-пятно. Цитоплазма будет определяться автоматически в зависимости от формы ядра.
5. Выберите интенсивность флуоресценции считывания выбора для каждого флуоресцентного параметра (например, среднее значение, стандартное отклонение)
6. Пакетная полученных изображений и пусть процесс программного обеспечения с помощью предложенного алгоритма.
7. Когда обработка изображений закончена, объединятьрезультирующие файлы.
8. Откройте результаты в Excel (или любой другой аналитической программного пакета) и земельный участок два флуоресцентных интенсивности друг против друга на XY оси. Каждый интенсивность флуоресценции дано на клетку. Двойные позитивные клетки появится в правом верхнем квадранте. Пользователь должен определить базовые люминесцентные интенсивности.

Результаты

Использование мультиспектральных метод воображения для анализа опухолей насаждаемое в нашей трансгенной модели ТКМ мыши, мы можем различить стромальных компонентов опухоли, которые происхождения костного мозга. Первоначальный БМТ было подтверждено три недели после трансплантации ...

Обсуждение

Здесь мы опишем применение мультиспектральных изображений мы описываем как MIMicc-многоспектрального допроса мултиплексу сотовых композиций, проанализировать костного мозга стромальных компонентов микросреды опухоли, однако эта методология и концепция может быть применена к расшифр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml