Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

Resumen

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

Resumen

Con el deseo de entender las contribuciones de múltiples elementos celulares para el desarrollo de un tejido complejo; tales como los numerosos tipos de células que participan en la regeneración de tejido, la formación del tumor, o la vasculogénesis, ideamos un modelo de trasplante celular multi-color de desarrollo de tumores en que las poblaciones de células se originan de diferentes colores reportero ratones de genes con fluorescencia y se trasplantan, injertados o se inyectan en y alrededor de un tumor en desarrollo. Estas células coloreadas se reclutaron y se incorporan en el estroma tumoral. Con el fin de evaluar cuantitativamente la médula ósea células del estroma derivadas de tumores, transplantamos que expresan GFP transgénica médula ósea entera en RFP letalmente irradiados expresando ratones aprobado por el IACUC. Tumores 0ovarian que fueron inyectados ortotópicamente en los ratones transplantados fueron extirpados 6-8 semanas después del injerto y se analizaron para marcador de médula ósea de origen (GFP), así como marcadores de anticuerpos para detectar tumor asociadoestroma utilizando técnicas de imagen multiespectral. A continuación, se adaptó una metodología que llamamos MIMicc-multiespectral Interrogación de composiciones celulares multiplexados, usando desmezcla multiespectral de fluoroprobes para evaluar cuantitativamente que la etiqueta de células vino de que poblaciones de partida (basados ​​en las etiquetas originales de gen reportero), y como nuestra capacidad para unmix 4, 5 , 6 o más espectros por aumentos de diapositivas, hemos añadido inmunohistoquímica adicional asociada con linajes celulares o diferenciación para aumentar la precisión. La utilización de software para detectar señales multiplexadas fluorescente co-localizados, las poblaciones del estroma tumoral pueden ser rastreados, enumerados y caracterizaron basándose en la tinción marcador. ¹

Introducción

Comprender el desarrollo de tejidos y la reparación es importante para dilucidar los componentes celulares que participan en la cicatrización de heridas, ^2,3 medicina regenerativa, la biología del desarrollo y la biología del tumor. En circunstancias de reparación, numerosos tipos de células se infiltran en el microambiente que rodea a la ayuda en la vascularización, la deposición de ECM, la proliferación y la reestructuración del tejido. Factores celulares y fenotipos se pueden identificar sobre la base de multiparamétrico, marcadores multiplexados que pueden identificar la localización, estado de diferenciación y la interacción entre los componentes celulares dentro de la microambiente investigado. Aquí se describe el desarrollo del tumor como un ejemplo prototípico de este modelo de trasplante multicolor multicelular seguido de imágenes multiespectrales y la metodología desmezcla espectral.

La progresión tumoral es un proceso de varios pasos que se caracteriza por varias capacidades adquiridas que incluyen una mayor proliferación, unpropiedades ntiapoptotic, invasivos y angiogénicos. ⁴ Desarrollo de tumores se ve facilitada por las células no neoplásicas que son reclutados en el ambiente circundante para proporcionar factores de crecimiento, matrices estructurales, redes vasculares y la modulación inmune. ^1,5,6 Este microhábitat consiste en células derivadas de tejidos locales, vecinos como adiposo y vasos sanguíneos y fuentes distantes, como la médula ósea células derivadas ^1. El grado de incorporación de células no-neoplásica depende de la demanda del tumor, que a menudo corresponde con la etapa / grado del tumor. Para comprender el papel del microambiente del tumor de apoyo, hay que entender el origen y el potencial de diferenciación de las poblaciones de células no neoplásicas.

Este protocolo ha sido diseñado para ayudar en la interpretación de la progresión del tumor a través de la visualización tanto de los componentes celulares derivadas de médula ósea, y el tejido local Derivcélulas ed. Utilizando ratones transgénicos fluorescentes reportero de genes que expresan, transplantamos GFP (proteína verde fluorescente) de la médula ósea en un RFP irradiados letalmente (proteína roja fluorescente) del ratón. Después de éxito del injerto de médula ósea, una línea celular de tumor singénico se inyecta ortotópicamente y se dejó que se injertan durante 4-8 semanas. El tumor resultante se escindió del ratón y se procesaron para inmunofluorescencia (IF) y la tinción para visualizar los componentes del estroma. Multiplexación IF marcadores es una técnica de uso común que implica una optimización significativa ^{de 7-9,} sin embargo el uso de una plataforma de imágenes / desmezcla multiespectral mejora el potencial de combinaciones de marcadores fluorescentes que poseen solapamiento espectral. El presente artículo presenta una técnica que llamamos interrogatorio MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados para teñir y analizar hasta ocho marcadores dentro de una sección del tumor en una sola diapositiva con el fin de analizar los orígenes celulares, diferenciación celular stratos y las interacciones célula-célula de componentes dentro del microambiente del tumor. Este ejemplo simplificado tiene el potencial de ser ampliado a fin de analizar cinco, seis, o más marcadores que utilizan anticuerpos o expresión fluorescente promotor impulsado intracelular. Tabla 1 se enumeran las posibles combinaciones de tinción de anticuerpos fluorescentes con especies apropiadas tomadas en cuenta.

Protocolo

Singenéico murino Trasplante de médula ósea (BMT), aprobados por los protocolos del IACUC institucional (Nota: El éxito de este protocolo requiere la utilización de cualquier tipo de célula marcada (s) como objetivo para el análisis multiespectral, y para facilitar el análisis de aguas abajo, se puede explotar cualquier genética o etiquetado celular estable. Sugerimos que cualquier célula, tejido, u órgano-a-ser puede ser aplicada a un modelo de trasplante y de que el trasplante puede contener tantas poblaciones marcadas únicas como la investigación considere útil. Además, múltiples marcado con sistemas celulares , tales como las que se encuentran en los ratones transgénicos que contiene de linaje múltiple restringido marcadas con fluorescencia poblaciones-pueden ser diseñados para eliminar las complicaciones de trasplante para el estudio de ciertos estados patológicos.

1. Letalmente irradiar ratones receptores de BMT con una sola dosis de 9,5 Gy cuatro horas antes de la reconstitución con médula ósea del donante. (Receptores de BMT GFP deben ser de 6-10 semanas de edad).
2. Humedezca la piel de ratón con etanol al 70% antes de la saturación y de la peladura de nuevo para exponer las patas traseras con tijeras quirúrgicas estériles. Retire toda la pierna incluyendo la cresta ilíaca en la articulación sacroilíaca. Deseche el pie cortando justo por encima del tobillo y luego eliminar completamente todos los músculos, los ligamentos y el exceso de tejido de la médula. Ósea ras de la cresta de la tibia, peroné y ilíaca con una aguja 23 G usando 2% de FBS en PBS estéril (PBS-2). (Donantes RFP BMT deben ser sacrificados de acuerdo a las normas institucionales.)
3. Rebanada y aplastar suavemente el hueso restante en fragmentos utilizando un escalpelo y pinzas y luego colocar en 50 ml de tubo cónico con 3 mg / ml de colagenasa I durante 1 hora a 37 ° C a 300 rpm.
4. Rematar el tubo con PBS-2 y recoger el sobrenadante en un tubo fresco y se combinan con células encendidas. Centrifugar a 250 rpm durante 5 min a 4 ° C.
5. Resuspender las células en PBS-2 y filtrar con filtro de 40 nm de células. En este punto, las células se pueden etiquetar para FLUORESCENT de células activadas (FACS) si se quiere manipular poblaciones específicas para el BMT.
6. Resuspender 2 x 10 ⁶ células por 100 l de PBS, por ratón. Utilizar 29 g de agujas para inyectar por vía sistémica en ratones receptores GFP irradiados por la cola o retro-orbital vena bisel de arriba abajo. Inyectar un ratón con 100 l de PBS solo como control de injerto. Utilice una lámpara de calor para dilatar los vasos antes de la inyección y utilizar un sistema de retención inyección en la vena de la cola después de la inyección. Tener una gasa estéril disponible para aplicar una ligera presión en la inyección posterior de la cola.
7. Tres semanas después de BMT, recogen retro-orbital de sangre y analizar por citometría de flujo para confirmar la presencia de células circulantes GFP y la ausencia de células RFP circulante. El ratón de control habrá muerto en este punto.

2. El injerto del tumor de acuerdo a las directrices del IACUC Institucionales

1. Grow ED8 células tumorales murinos de ovario in vitro antes de la inyección in vivo (1 x 10 ⁶ Cells por ratón). Día de la inyección, trypsinize células, se lavan con PBS y se resuspenden en PBS a 1 x 10 ⁶ células por cada 100 l.
2. Inyectar células tumorales en la cavidad intaperitoneal del ratón, la aguja debe estar del lado biselado hacia arriba. Esterilizar la vista de inyección con etanol al 70%. Inyecte en la parte inferior izquierda o en el cuadrante inferior derecho del abdomen (craneal y ligeramente medial al conjunto inferior de pezones abdominales de ratón hembra), evitar golpear los órganos. Restringir ratón por el pescuezo y la celebración de la cola con el dedo meñique o el anillo del dedo. Los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano para este procedimiento.
3. Sacrificar los ratones cuando los signos de prendimiento del tumor, como la leve hinchazón abdominal, son evidentes. Esto ocurrirá más de 4-12 semanas.
4. Tumores Impuestos Especiales de la cavidad IP. Los tumores de la cavidad se verá como nódulos blancos en y alrededor de la superficie de los órganos. Con un bisturí, extirpar los tumores y colocar en un tubo / frasco de formalina al 10% durante 24 horas de fijación. P histológicola reparación puede ser externalizadas a núcleo patología / histología si los reactivos y materiales no son fácilmente disponibles para la inclusión en parafina y preparación. Sección tejido en 5-8 micras rodajas en portaobjetos de vidrio para los procedimientos de tinción posteriores.

3. Multiparamétrico Inmunofluorescencia tinción

1. Preparar diapositivas individuales de control de color para cada sonda fluorescente utilizada en el experimento. En este escenario, se utilizan cuatro colores. Por lo tanto, cuatro diapositivas para cada color individual, así como una diapositiva para el control del ruido de fondo y, finalmente, una diapositiva para la tinción combinación completa. (Diapositivas totales = 6) Todos los portaobjetos se procesan de lado a lado de una manera idéntica para reducir al mínimo la variación experimental.
2. Hornee las secciones de parafina a 56 º C durante 1 hora.
3. Lavar los portaobjetos 3x 10 min en xileno.
4. Lavar 2x 5 min de etanol 100%.
5. Lavar 1x 3 min 95% de etanol
6. Lavar 1x 2 min90% de etanol.
7. Lavar 1x 2 min70% de etanol.
8. Lavado 1x 2 min en agua. Lentamente sumerja el dispositivo de tinción dentro y fuera de la 10x agua.
9. Durante la última serie de lavado, pre-ebullición tampón de citrato de sodio durante 2 min (microondas a máxima potencia). (Se puede sustituir con tampón tris-EDTA en función de los anticuerpos en el uso)
10. Hervir las diapositivas durante 20 minutos en tampón de citrato de sodio (microondas a potencia 10% o en una olla a presión). Si el buffer hierva, apague microondas y dejar reposar.
11. Eliminar de la fuente de calor y deje que los portaobjetos descansar durante 30 minutos en el tampón de citrato de sodio que se enfríe.
12. Enjuagar los portaobjetos en agua durante 5 min.
13. Marcos alrededor de las secciones tumorales con Pap Pen y puso el 2% de BSA / 1% de SFB ácido maleico tampón de bloqueo durante 1 hora. Prepare las diapositivas individualmente como para no dejar que se sequen durante este paso.
14. Preparar anticuerpos primarios en dilución óptima en tampón de bloqueo. (Si los anticuerpos en uso son todos de diferentes especies (o IgG cadena de variación ex: IgG1 IgG2a frente de misma especie) que se pueden usar en combinación durante comoperíodo de incubación de la ingle. Si las especies de anticuerpos se solapan, entonces las incubaciones deben llevarse a cabo secuencialmente para minimizar anticuerpo de reacción cruzada.)
15. En este punto, dejar dos portaobjetos con tampón de bloqueo solamente. Estos dos diapositivas servirán como control sin mancha y control tinción nuclear. Los otros controles de un solo color se incubaron con anticuerpos primarios individuales. Sólo la diapositiva análisis tendrá una combinación de anticuerpos primarios.
16. Incubar los portaobjetos con el anticuerpo primario en un cuadro de cámara de humedad en un agitador lento que gira a 4 ° durante la noche (~ 16-20 hr) (Nota: cuando se trabaja con 4 + fluoróforos, tinción secuencial o conjugación directa puede ser necesario para reducir al mínimo anticuerpo de reacción cruzada . Bajo estas circunstancias se repiten los pasos hasta que todos los anticuerpos 1.16 a 1.21 se aplican a los portaobjetos.)
17. Lavar los portaobjetos durante 10 minutos en PBST (2x) suavemente en un agitador
18. Mientras lavado se va, preparar Alexafluor 488, 594 y 647 anticuerpos secundarios para una dilución finalde 1:1.000 en tampón de bloqueo. (Asegúrese de que estos anticuerpos y diluciones se mantuvieron a 4 ° C y en la oscuridad en todo momento para preservar la fluorescencia a través de lotes y en el tiempo.)
19. En las diapositivas individuales de control de color, colocar diluciones individuales AlexaFluor que coincidan con las especies del anticuerpo primario utilizado. Todos los anticuerpos secundarios se colocarán en la diapositiva análisis. Los portaobjetos de control teñidas sin teñir y el nucleares permanecerán con tampón de bloqueo a lo largo de este paso.
20. Incubar en un cuadro de cámara de humedad (cubierto con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz) en un agitador de rotación lenta a TA durante 2 h.
21. Lavar los portaobjetos durante 5 minutos en PBST (2x) suavemente en la coctelera. Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
22. Añadir DAPI (1:10.000) durante 1 min a la diapositiva-DAPI sólo y la corredera análisis. Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Las otras diapositivas pueden quedar cubiertos en los recipientes de lavado.
23. Lavar dos incubaron DAPI-lalos portaobjetos en un recipiente separado para el primer lavado 5 min como para no contaminar los otros portaobjetos con tinción DAPI. Para el segundo lavado de 5 min, las diapositivas se pueden combinar en PBST (todos los lavados deberían llevarse a cabo en un agitador). Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de la luz.
24. Laminocultivos brevemente en agua antes de la cubierta-deslizamiento (1.5 grosor con los medios de montaje acuoso para preservar la fluorescencia)
25. Deje secar 3 horas en la oscuridad a temperatura ambiente.
26. Selle los bordes de la hoja de la cubierta con el endurecedor de uñas. (No use esmalte de uñas como la acetona puede apagar la señal fluorescente).
27. Analizar diapositivas inmediatamente o almacenar a 4 ° C para su posterior análisis.

4. Las imágenes multiespectrales

1. Recoge imágenes multiespectrales utilizando una cámara de Nuance EX (que contiene un filtro sintonizable de cristal líquido) en un X-63 microscopio vertical Olympus con el software Nuance para la recolección de datos.
2. Recoge imágenes, utilizando un objetivo de aceite para aumentar la resolución.
3. Iniciatival puesta a punto incluye establecer el rango espectral para cada fluoróforo en uso.
   1. Para 4 color:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Tome una imagen inicial de la corredera de análisis para obtener los tiempos de exposición apropiados para cada uno de los rangos espectrales.
5. Crear "biblioteca espectral" que el software utilizará para identificar y separar la relación señal-ruido de los fluoróforos unos de otros y la señal de fondo. (Nota: cada fluorocromo debe tener su propio deslizamiento simple control de color con el fin de armar una biblioteca espectral con curvas de longitud de onda adecuadas para garantizar el correcto análisis del conjunto de datos Ejemplo: 3 fluoróforos = 4 portaobjetos de control; 5 fluoróforos = 6 portaobjetos de control.).
   1. Imagen primero el portaobjetos sin teñir. Esta diapositiva se designará dentro del bibliotecario espectraly como telón de fondo.>
   2. Imagen del solo DAPI deslice segundos. Esta diapositiva se utilizará para designar a los núcleos teñidos con DAPI con la herramienta "draw" y se guardará en la biblioteca espectral como DAPI.>
   3. Imagen de la AF488-sólo deslice tercero. Esta diapositiva se utilizará para designar las regiones teñidas con AF488 con la herramienta "draw" y se guardará en la biblioteca espectral AF488.>
   4. Imagen del AF594 de sólo deslizar cuarto. Esta diapositiva se utilizará para designar las regiones teñidas con AF594 con la herramienta "draw" y se guardará en la biblioteca espectral AF594.>
   5. Imagen del AF647 de sólo deslizar quinto. Esta diapositiva se utilizará para designar las regiones teñidas con AF647 con la herramienta "draw" y se guardará en la biblioteca espectral AF647.>
   6. Después de la recogida de cada componente espectral individuo,guardar la biblioteca espectral y el protocolo.>
6. Una vez que la biblioteca espectral es completa, encontrar las regiones de interés en la diapositiva análisis en el microscopio y recoger / guardar imágenes.>

5. Análisis cuantitativo de imágenes multiespectrales

1. Importar una variedad representativa de las imágenes de Nuance adquiridos utilizando InForm Software.
2. Abra la biblioteca espectral guardado como lo indique el programa de
3. Identificar las regiones de tejido de interés a analizar. (Por ejemplo, tejido tumoral en comparación con el tejido adiposo).
4. Identificar las células individuales en función de DAPI-manchas. El citoplasma se define automáticamente en función de la forma del núcleo.
5. Elige la intensidad de fluorescencia de lectura de la opción para cada parámetro de fluorescencia (por ejemplo, media, desviación estándar)
6. Lotes del adquirido imágenes y dejar que el proceso de software utilizando el algoritmo propuesto.
7. Cuando el procesamiento de imágenes ha terminado, fusionarlos archivos de resultados.
8. Abra los resultados en Excel (o cualquier otro paquete de software de análisis) y trazar dos intensidades fluorescentes de unos contra otros sobre ejes XY. Cada intensidad de fluorescencia se da por célula. Aparecerán las células dobles positivas en el cuadrante superior derecho. El usuario debe definir la intensidad de fluorescencia de línea base.

Resultados

Usando una técnica de imagen multiespectral para analizar tumores injertados en nuestro modelo de ratón transgénico BMT, somos capaces de discernir los componentes de tumores del estroma que son de origen de la médula ósea. El primer trasplante de médula ósea fue, confirmado tres semanas después del trasplante mediante citometría de flujo (Figura 1). Ortotópicamente inyecta tumores ováricos no marcados siguiente confirmaciones injerto BMT fueron extirpados y fijadas en formol 6 semanas despu?...

Discusión

Aquí se describe la aplicación de imágenes multiespectrales que describimos como interrogación MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados, para analizar los componentes derivados de la médula ósea del estroma de la microambiente del tumor, sin embargo esta metodología y el concepto se puede aplicar a descifrar otros elementos celulares que componen un complejo tejidos tales como los que se observan durante las reacciones de curación de heridas o durante un tejido regenerativo. En estos experi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml